一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法
2023-05-17 15:15:51 3
一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法
【專利摘要】本聲明提供一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，包括如下步驟：(1)將德國小蠊滅活；(2)用乙醇清洗、浸泡、風乾後置於-80℃冰箱保存備用；(3)取適量的冰凍德國小蠊在液氮中研磨成粉末；(4)使用丙酮脫脂後冷凍，隨後凍幹成粉末；(5)稱取德國小蠊粉末加入提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻吸取上清；(6)用相應的抗過敏原的特異性抗體鑑定德國小蠊過敏原粗提物中過敏原的含量及比例；(7)加入酵母菌或昆蟲表達的重組蛋白質，使其達到與德國小蠊自身的五種主要過敏原含量及比例的一致性為65％～75％，即得到本發明的過敏原製劑。本發明方法提取的德國小蠊過敏原粗提物能最大程度的獲得德國小蠊主要過敏原蛋白，提取物可重複性好，誤差小於30％。
【專利說明】一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物製藥【技術領域】，具體為一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法。
【背景技術】
[0002]過敏性疾病是人類重大疾病之一。其發病率目前估計約佔世界人口的22%，而且正以每年大於1%的速度增加，且以兒童患者的發病率上升最為明顯。其危害性不能簡單地以其死亡率來衡量,而要考慮疾病的高發作頻度給患者造成的經濟負擔。由於過敏性疾病多發生在年輕人群，其對人類社會和經濟的影響就更嚴重。我國在工業化轉型過程中，其發病率顯著增加，嚴重影響了我國受累人口的生活質量、工作效率，加重了患者的經濟負擔。僅歐洲每年用於治療過敏患者的費用已經超過500億歐元，並繼續以3倍於其它疾病的增速在發展。美國每年僅哮喘和過敏性鼻炎的花費已分別高達64和60億美元。全國尚有數以億計的人有潛在的診斷和治療需求。因此，積極扶持我國過敏原體內診斷和治療製劑研發，能有效防止因國外產品對我國的滲入造成的醫療費用上漲，減少國家醫療財政支出和人民負擔。
[0003]過敏原標準化是一項世界性難題，我國在此領域與歐美國家差距逐漸拉大。例如，美國為有效管理過敏原製劑，專門成立了 FDA / CBER / LIB實驗室，旨在建立過敏原參考品、過敏患者參考血清池、標準的生物效價檢定方法、設定有效合理的質量放行標準。1981年，美國市場上有超過5000種非標準化過敏原產品出售，其中絕大部分均沒有安全性和有效性驗證。而現今，FDA經過多年過敏原標準化體系規範，正式批准的標準化過敏原僅19種。德國生物製品研究所-PEI研究所(Paul Ehrlich Institute, PEI)執行了同樣的策略，強制在德國推行標準化過敏原，加強監管，關閉了數十家過敏原生產企業。歐盟通過連續三屆框架科技計劃資助，建立了樺樹主要致敏蛋白重組參考品rBet Vl以及標準的ELISA檢定方法，準備寫入歐洲藥典。我們在本項目中利用新的提取和重組技術，製備出第二代標準化過敏原製劑。
[0004] 早在上世紀60年代，就有蟑螂引起哮喘的報導。但直到近年來，蟑螂在哮喘發病中的作用才逐漸受到人們的關注。資料顯示，美國哮喘患者中蟑螂過敏的發生率達到27.5~42%，歐洲為3.9~24.5%，非洲為30~44.6%，在我國，北京、上海等大城市中兒童哮喘患者的蟑螂過敏率也高達27.8~43.8%。哮喘發病率的不斷升高，在很大程度上與蟑螂汙染加劇有關，蟑螂已經成為僅次於塵蟎的第二大室內過敏源。目前常見的德國小蠊過敏原已經被鑑定出來，使第二代標準化德國小蠊過敏原製劑的製備有了依據。但是，到目前為止，尚無公開發表的德國小蠊製備工藝，而德國小蠊過敏原製劑又有較大的臨床需求，以此本公司研發出第二代標準化德國小蠊過敏原製劑。
【發明內容】
[0005]本發明所解決的技術問題在於提供一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，以解決上述【背景技術】中的問題。[0006]本發明所解決的技術問題採用以下技術方案來實現:一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，包括如下步驟:
[0007](1)將德國小蠊在_80°C冰箱中滅活；
[0008](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分鐘，風乾後置於_80°C冰箱保存備用；
[0009](3)取適量的冰凍德國小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0010](4)使用丙酮脫脂2次後，置於_80°C冰箱中冷凍，隨後在真空冷凍乾燥機內凍幹成粉末；
[0011](5)稱取德國小蠊粉末，按照德國小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相應的提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻，置4°C搖床上抽提，之後在轉速為12000g，4°C條件下離心30min,吸取上清，即為德國小蠊過敏原粗提物；
[0012](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原Blag5的特異性抗體鑑定德國小蠊過敏原粗提物中主要過敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原 Blag5 的含量及比例；
[0013](7)根據步驟(6)中鑑定結果加入酵母菌或昆蟲表達的重組蛋白質，使其達到與德國小蠊自身的五種主要過敏原Blag2或Blag9、Blag6.0U Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin, I種次要過敏原Blag5含量及比例基本一致，即得到本發明的過敏原製劑。
[0014]所述德國小蠊粉末加入提取液後置4°C搖床上提取時間為0.5~4h。
[0015]所述提取液為高滲磷酸鹽緩衝液(PBS)，配方為:NaCl:35.1g~70.2g、KCl:
0.2g、Na2HPO4:1.42g、KH2PO4:0.27g，加入 800mlddH20 調節 pH 值 5.0 ~9.0，定容至 1L。
[0016]所述德國小蠊自身的五種主要過敏原含量及比例的一致性為65%~75%。
[0017]所述的德國小蠊為純系，由一對雙親繁殖成。
[0018]與現有技術相比，本發明有以下有益效果:本發明方法提取的德國小蠊過敏原粗提物能最大程度的獲得德國小蠊主要過敏原蛋白，提取物可重複性好，誤差小於30%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明中不同NaCl濃度PBS溶液抽提德國小蠊I小時結果。
【具體實施方式】
[0020]為了使本發明的技術手段、創作特徵、工作流程、使用方法達成目的與功效易於明白了解，下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0021]實施例1
[0022]一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，包括如下步驟:
[0023](1)將德國小蠊在_80°C冰箱中滅活；
[0024](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分鐘，風乾後置於_80°C冰箱保存備用；
[0025](3)取適量的冰凍德國小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0026](4)使用丙酮脫脂2次後，置於_80°C冰箱中冷凍，隨後在真空冷凍乾燥機內凍幹成粉末；
[0027](5)稱取德國小蠊粉末，按照德國小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相應的提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻，置4°C搖床上抽提lh，之後在轉速為12000g，4°C條件下離心30min,吸取上清，即為德國小蠊過敏原粗提物；
[0028](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原Blag5過敏原的特異性抗體鑑定德國小蠊過敏原粗提物中主要過敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原 Blag5 的含量及比例；
[0029](7)根據步驟(6)中鑑定結果加入酵母菌或昆蟲表達的重組蛋白質，使主要過敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDUBlagtrypsin, I 種次要過敏原 Blag5 含量及比例的一致性為68%，即得到本發明的過敏原製劑。
[0030]實施例2
[0031]一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，包括如下步驟:
[0032](I)將德國小蠊在_80°C冰箱中滅活；
[0033](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分鐘，風乾後置於_80°C冰箱保存備用；
[0034](3)取適量的冰凍德國小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0035](4)使用丙酮脫脂2次後，置於_80°C冰箱中冷凍，隨後在真空冷凍乾燥機內凍幹成粉末；
[0036](5)稱取德國小蠊粉末，按照德國小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相應的提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻，置4°C`搖床上抽提1.5h，之後在轉速為12000g，4°C條件下離心30min，吸取上清，即為德國小蠊過敏原粗提物；
[0037](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原Blag5過敏原的特異性抗體鑑定德國小蠊過敏原粗提物中主要過敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原 Blag5 的含量及比例；
[0038](7)根據步驟(6)中鑑定結果加入酵母菌或昆蟲表達的重組蛋白質，使主要過敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDUBlagtrypsin, I 種次要過敏原 Blag5 含量及比例的一致性為70%，即得到本發明的過敏原製劑。
[0039]實施例3
[0040]一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，包括如下步驟:
[0041](I)將德國小蠊在_80°C冰箱中滅活；
[0042](2)用75%乙醇清洗、浸泡15分鐘，風乾後置於_80°C冰箱保存備用；
[0043](3)取適量的冰凍德國小蠊在液氮中研磨成粉末；
[0044](4)使用丙酮脫脂2次後，置於_80°C冰箱中冷凍，隨後在真空冷凍乾燥機內凍幹成粉末；
[0045](5)稱取德國小蠊粉末，按照德國小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相應的提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻，置4°C搖床上抽提2h，之後在轉速為12000g，4°C條件下離心30min,吸取上清，即為德國小蠊過敏原粗提物；
[0046](6)用抗 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原Blag5過敏原的特異性抗體鑑定德國小蠊過敏原粗提物中主要過敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原 Blag5 的含量及比例；[0047](7)根據步驟(6)中鑑定結果加入酵母菌或昆蟲表達的重組蛋白質，使主要過敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDUBlagtrypsin, I 種次要過敏原 Blag5 含量及比例的一致性為72%，即得到本發明的過敏原製劑。
[0048]以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵及本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明的要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。·
【權利要求】
1.一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，其特徵在於:包括如下步驟: (1)將德國小蠊在-80°C冰箱中滅活； (2)用75%乙醇清洗、浸泡15分鐘，風乾後置於_80°C冰箱保存備用； (3)取適量的冰凍德國小蠊在液氮中研磨成粉末； (4)使用丙酮脫脂2次後，置於_80°C冰箱中冷凍，隨後在真空冷凍乾燥機內凍幹成粉末； (5)稱取德國小蠊粉末，按照德國小蠊粉末Ig提取液IL的比例加入相應的提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻，置4°C搖床上抽提，之後在轉速為12000g，4°C條件下離心30min，吸取上清，即為德國小蠊過敏原粗提物；
(6)用抗Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原Blag5過敏原的特異性抗體鑑定德國小蠊過敏原粗提物中主要過敏原Blag2或Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin 及 I 種次要過敏原 Blag5 的含量及比例； (7)根據步驟(6)中鑑定結果加入酵母菌或昆蟲表達的重組蛋白質，使其達到與德國小蠊自身的五種主要過敏原 Blag2 或 Blag9、Blag6.01、Blag7、BlagGSTDl、Blagtrypsin, I種次要過敏原Blag5含量及比例的一致性為65%~75%，即得到本發明的過敏原製劑。
2.根據權利要求1所述的一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，其特徵在於:所述德國小蠊粉末加入提取液後置4°C搖床上提取時間為0.5~4h。
3.根據權利要求1所述的一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，其特徵在於:所述提取液為高滲磷酸鹽緩衝液(PBS)，配方為=NaCl:35.1g ~70.2g、KCl:0.2g、Na2HP04:1.42g、KH2PO4:0.27g,加入 800mlddH20 調節 pH 值 5.0 ~9.0，定容至 1L。
4.根據權利要求1所述的一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，其特徵在於:所述德國小蠊自身的五種主要過敏原含量及比例的一致性為65 %~75 %。
5.根據權利要求1所述的一種德國小蠊過敏原製劑的製備方法，其特徵在於:所述的德國小蠊為純系，由一對雙親繁殖成。
【文檔編號】A61P37/08GK103656635SQ201310694219
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】何韶衡 申請人:安徽潤敏江生物科技有限公司