一種檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白含量的方法
2023-05-04 05:21:46 2
專利名稱：一種檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因蛋白的檢測方法，尤其涉及一種檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白含量的方法。
背景技術：
肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，生存期短，治療棘手，素有″癌中之王″之稱。全世界每年新發HCC中42％出現在我國大陸，已佔我國腫瘤死因的第2位。目前，臨床發現的HCC病例以晚期HCC為主，HCC患者的生存率基本為零。但如果能夠早期發現HCC，即HCC＜2-3釐米時，HCC手術後，一年生存率達80-90％，五年生存率可達54％-76％、十年生存率43％-45％。如果配合適當的其它治療方法，生存率還將更高。
目前，世界上對於肝癌的診斷主要以血清甲胎蛋白檢測，及B超，計算機斷層掃描顯像(Computed Tomography，簡稱CT)CT為主。其中血清甲胎蛋白檢測其特異性及準備性均有待於提高，而B超與CT均為影像學檢查，受儀器性能及檢查者水平影響很大。故，對肝癌的早期診斷還沒有找到一個行之有效的方法。
是近些年來，以差異顯示技術發現的一個致癌基因，是p53的負向調節劑。其首先是在宮頸癌中發現，稱人類子宮頸癌1類基因。在早期HCC患者中，發現其167-360cDNA片斷翻譯的蛋白(以下簡稱人類子宮頸癌1類基因蛋白)，有特異性的高表達，在正常組織中包括肝組織，均基本無表達。此類蛋白在HCC早期就能夠大量的游離於HCC患者的血清中，只要檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白的含量，就能及早診斷HCC。
酶聯免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，EILSA)主要是基於抗原或抗體能吸附至固相載體的表面並保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與其它物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量有一定的比例，加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據顏色反應的深淺進行定性或定量分。是目前，最常用的抗原分析方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白含量的方法，用於早期診斷肝癌，具有高度特異性，敏感性，成本低的特點，適於推廣。對於早期診斷肝癌提供了一種重要方法。
本發明是這樣來實現的，其檢測方法步驟為1、人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於酶標板上，再加入梯度濃度的人類子宮頸癌1類基因蛋白，再加入抗人類子宮頸癌1類基因蛋白的單克隆抗體，再加入酶標二抗，再加入四甲基聯苯胺顯色，以酶標儀讀數，製做標準曲線。
2、人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於酶標板上，加入血清，再加入抗人類子宮頸癌1類基因蛋白的單克隆抗體，再加入酶標二抗，再加入四甲基聯苯胺顯色，以酶標儀讀數，根據標準曲線確定患者血清中的人類子宮頸癌1類基因蛋白濃度。
本發明的優點是1、特異性高本發明應用人類子宮頸癌1類基因蛋白作為包被抗原，在材料選擇上有新意。在腫瘤體積小於2cm時，就會產生人類子宮頸癌1類基因蛋白抗體，且其它正常組織不產生。
2、檢測成本低廉本方法與現有的方法相比，特異性高及準確性前提下好，大大降低了檢測的成本。
具體實施例方式
本發明的檢測方法步驟為檢測早期肝癌患者血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白的含量。
1、包被抗原將提純的100微升人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於普通96孔ELISA酶標板上，於4℃封閉過夜。
2、用2％的脫脂牛奶封閉45分鐘。
3、以0.1M磷酸鹽緩衝液洗滌三次。
4、標準曲線的制定將10，20，40，80，160，320，640ng/ml人類子宮頸癌1類基因蛋白100微升，移入酶標板內，加入抗人類子宮頸癌1類基因蛋白單克隆抗體，反應45分鐘，以磷酸鹽緩和衝液洗滌三次，再加入酶標二抗，然後加入四甲基聯苯胺顯色，10分鐘後，以酶標儀讀數，即得到標準曲線。
5、樣品的測定將患者的血清用0.1M磷酸鹽緩和衝液稀釋100倍後，移入酶標板內，加入抗人類子宮頸癌1類基因蛋白單克隆抗體，反應45分鐘，以磷酸鹽緩和衝液洗滌三次，再加入酶標二抗，然後加入四甲基聯苯胺顯色，10分鐘後，以酶標儀讀數，然後根據標準曲線，得到患者體內人類子宮頸癌1類基因蛋白含量。
1、抗人類子宮頸癌1類基因蛋白蛋白單克隆抗體的研製1.1動物免疫A)選用四周齡的雌性BALB/c小鼠作為免疫動物，人類子宮頸癌1類基因蛋白與等量弗氏完全佐劑完全乳化後採用皮下多點注射(100μg/只)。一周後將小鼠斷尾採血，分離血清，以人類子宮頸癌1類基因蛋白為檢測抗原測定抗體效價。
B)距第一次免疫後的第4周取人類子宮頸癌1類基因蛋白與等量弗氏不完全佐劑乳化後採用皮下注射加強免疫一次(100μg/只)。
C)距第二次免疫後的第4周再取人類子宮頸癌1類基因蛋白與等量弗氏不完全佐劑乳化後採用皮下注射加強免疫一次(100μg/只)。一周後將小鼠斷尾採血，分離血清，以人類子宮頸癌1類基因蛋白為檢測抗原測定抗體效價。
D)在距第三次免疫後的第4周進行最後一次加強免疫，採用尾靜脈注射人類子宮頸癌1類基因蛋白50μg/只。三天後摘除眼球採血，分離血清，測定抗體效價，取脾細胞進行融合。
1.2骨髓瘤細胞懸液的製備A)融合前36小時擴大培養骨髓瘤細胞。
B)融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁輕輕吹下，收集於50mL離心管內，1000轉/分離心5分鐘，棄去上清。
C)加入30mL DMEM不完全培養基，同法離心洗滌一次。然後將細胞重懸浮於10mL DMEM不完全培養基，混勻。
D)取骨髓瘤細胞懸液，加0.4％臺盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1mL加入0.1mL臺盼藍染液和0.8mL蒸餾水，混勻，用血球計數板計數1.3脾細胞的製備A)取已經最後一次尾靜脈免疫三天後的BALB/c小鼠，眼眶放血，收集血清，斷頸處死，70％乙醇體表消毒，置於已消毒的平皿中。
B)無菌打開腹腔，挑出脾臟，置於已盛有10mL不完全DMEM培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。
C)將脾臟用已滅菌的玻璃注射器針芯在200目不鏽鋼網中磨碎，收集濾液。
D)1000轉/min離心5分鐘，去上清，用不完全DMEM培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10mL不完全培養基混勻，取上述懸液，加臺酚藍染液作活細胞計數後備用。
1.4飼養細胞的製備A)在細胞融合前天或當天眼眶放血，斷頸處死昆明鼠，浸泡在70％乙醇中5min，體表消毒。
B)將鼠置於消毒平皿中，剪開腹部皮膚，用小鑷子挑起腹部皮膚，注入50mL完全培養基。
C)用手輕輕揉動腹部，將其體內液體用注射器小心吸出，反覆2-3次。
D)1000r/min離心5分鐘，棄上清，用5mL HAT(hypoxantin、aminopterin、thymidin黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)培養基將沉澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，用HAT培養基調整細胞濃度為2×105/mL，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1mL，然後置37℃5％CO2的培養箱中培養。
1.5細胞融合A)先將HAT培養液、DMEM不完全培養液、DMEM完全培養液、50％聚乙二醇放入37℃水浴箱中預溫，同時放入一盛水燒杯預溫備用。
B)將1×108脾細胞與2×107～5×107骨髓瘤細胞混合於一支50mL融合管中，補加DMEM不完全培養液至30mL，充分混勻。
C)1000r/min離心5-10分鐘，將上清儘量吸淨。
D)在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻，使細胞沉澱充分混勻如糊狀，置37℃水浴中預熱。
E)用1mL吸管在1分鐘內加預熱至37℃的50％聚乙二醇(pH 8.0)1mL，邊加邊輕輕攪拌。
F)用10mL吸管在90秒內加20-30mL預熱至37℃的不完全DMEM培養基，37℃靜置10分鐘。
G)1000r/min離心5分鐘；棄去上清，加入5mL HAT培養基，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加HAT培養基至80-100mL。
H)分裝至融合前一天的含有飼養細胞的96孔細胞培養板，每孔0.10mL；然後將培養板置37℃，5％CO2培養箱內培養。
I)培養5天後用HAT培養基換出1/2培養基，培養7天後用HT(hypoxantin、thymidin黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)培養基換出HAT培養基，經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
1.6雜交瘤細胞的篩選採用間接ELISA與間接競爭ELISA聯合應用的方法對雜交瘤進行篩選，先用間接ELISA對全部有克隆生長孔的抗體進行初篩，再用間接競爭ELISA法對陽性孔抗體進行競爭抑制試驗，選抑制效果最明顯的孔進行克隆化。
2抗體的純化A.取新鮮採集的腹水(或凍存的腹水)，2000轉/min 15分鐘，除去細胞成分(或凍存過程中形成的固體物質)等；取上層清亮的腹水，等量加入0.1M磷酸緩衝液。
B.用0.44微米的微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000轉/min 15分鐘高速離心(4℃)除去細胞殘渣及小顆粒物質。
C.按每毫升稀釋腹水加11μL辛酸的比例，16-22℃攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鐘內加完，4℃靜置2小時。
D.10000轉/min離心30分鐘，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾(125um)，加入1/10體積的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液，用1mol/L碳酸鹽緩和衝液調pH至7.2；E.在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，作用30分鐘，靜置1小時；F.10000轉/min離心30分鐘，棄上清；沉澱溶於適量碳酸鹽緩和衝液中，對50-100倍體積的磷酸鹽緩和衝液透析，4℃過夜，其間換液3次以上。
G.10000轉/min離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。
權利要求
1.一種檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白含量的方法，其特徵是檢測方法步驟為(1)人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於酶標板上，再加入梯度濃度的人類子宮頸癌1類基因蛋白，再加入抗人類子宮頸癌1類基因蛋白單克隆抗體，再加入酶標二抗，再加入四甲基聯苯胺顯色，以酶標儀讀數，製做標準曲線；(2)人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於酶標板上，加入血清，再加入抗人類子宮頸癌1類基因蛋白的單克隆抗體，再加入酶標二抗，再加入四甲基聯苯胺顯色，以酶標儀讀數，終止反應根據標準曲線確定患者血清中的人類子宮頸癌1類基因蛋白濃度。
全文摘要
本發明在於提供一種檢測血清中人類子宮頸癌1類基因蛋白含量的方法，其特徵是檢測方法步驟為(1)人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於酶標板上，以酶標儀讀數，製做標準曲線；(2)人類子宮頸癌1類基因蛋白包被於酶標板上，加入血清，根據標準曲線確定患者血清中的人類子宮頸癌1類基因蛋白濃度。其優點是1.特異性高；2.檢測成本低廉。
文檔編號G01N33/543GK101042404SQ20071005180
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月2日 優先權日2007年4月2日
發明者餘宙 申請人:南昌大學