一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株及其應用的製作方法

2023-04-23 08:10:41

專利名稱：一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛭弧菌，特別涉及一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭 弧菌菌株及其應用。
背景技術：
近年來，世界各地相繼發生重大的食品安全事件，不僅帶來巨大的經濟損 失，還是對社會穩定和安全的考驗，使得食品安全問題成為人們日益關注的問 題。對此，世界各國和組織都設定了多種食品安全相關的法律法規，以達到預 防和控制食品安全問題的目的。微生物是汙染食品的重要因素之一，由於其個 體微小、分布廣泛、生存能力強、繁殖迅速等特點，使得如何避免和減少微生 物汙染成為食品加工和流通等環節考慮的首要問題。
養殖病害一直是制約水產養殖業持續健康發展的瓶頸之一，僅2004年我國 監測到的水產病害損失就達151億元。抗生素及化學消毒藥物的濫用又使養殖 經濟動物抗病能力明顯下降，既不利於養殖動物的健康生長，也不符合健康養 殖理念及可持續發展的需要。隨著對水產品安全要求的提高和對耐藥菌株危害 的重視，符合環境友好和可持續發展的生態防治技術則是當前和今後水產養殖 病害最有希望的發展方向之一，而微生物則在其中扮演著最重要的角色。但是， 一些微生態製劑在應對水生動物疾病防治方面還是存在諸多缺陷，而噬菌蛭弧 菌具有獨特的裂解細菌的生物學特性，為水生動物的疾病防治開闢了新的途徑， 一種綠色、環保、健康的天然"抗生素"正逐漸走進水產養殖產業。如能在水產 品在養殖期間、運輸過程或食用、加工前，先進行致病菌的生物消除工作，則 一方面可以減少或消除食物中毒的機率，減少或消除藥物殘留的可能，提高產 品質量安全係數，保護消費者的健康，另一方面也可為水產品的加工提供優質 原材料和加工上的便利，為出口創匯提供強有力的保障。
水產養殖中可引起水產品病害的革蘭氏陽性菌主要包括能引發分枝桿菌病 的分枝桿菌(Myco^jrcten'Mwsp.)、引發諾卡氏菌病的諾卡氏菌(M ajr^a sp.)、 引發鏈球菌病的鏈球菌(&^ptococc^sp.)、引發葡萄球菌病的表皮葡萄球菌(5^ap/y;/ococcws ep/cfenrnVZ/s )、弓I發梭菌'性腸炎的梭菌(C7oWnW/wwi sp.)、 導致水體養殖環境發生變化而影響養殖對象的健康狀況的紅球菌 (i /zo(iococcws sp.)禾口弓l發棒狀桿菌病的棒狀桿菌(C。7"eZ acteWwm sp.)。

發明內容
本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種消除水產品 革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株。
本發明的另一 目的在於提供所述蛭弧菌菌株的應用。
本發明的目的通過下述技術方案實現 一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌 的蛭弧菌菌株，名稱為蛭弧菌(^fe//ovAWo sp.) BDS02，於2009年8月7日 保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M209170;
對所述蛭弧菌BDS02進行負染後於電子顯微鏡下形態觀察(見圖1): BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65x0.2^im，端生鞭毛，鞭毛長度至少1.8hiti; 所述蛭弧菌BDS02以雙層平板法於28"C培養四天可形成直徑l-2mm的透明圓 形噬菌斑；
蛭弧菌BDS02的16S-ITS rDNA序列如下(序列表SEQ ID NO.l所示)一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的微生物製劑，含有所述的蛭弧菌 BDS02;
所述的微生物製劑還含有蛭弧菌(^M/ov^n'osp.) BDS01;
所述蛭弧菌BDS01於2009年8月7日保藏於中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCCNO: M209169;將所述蛭弧菌BDS01進行負染後於電子顯 微鏡下形態觀察BDS01呈單細胞，弧形，大小為0.9x0.25pm，端生鞭毛，鞭 毛長度為4 jim;所述蛭弧菌BDSOl以雙層平板法於28'C培養四天可形成直徑 l-2mm的透明圓形噬菌斑；
所述的蛭弧菌BDS02優選通過申請號"200710031166.X",名稱為"高密 度蛭弧菌遊泳體的發酵培養技術"國家發明專利申請公開的高密度蛭弧菌遊泳 體的發酵方法進行發酵；
所述蛭弧菌BDS01優選通過申請號"200710031166.X"，名稱為"高密度 蛭弧菌遊泳體的發酵培養技術"國家發明專利申請公開的高密度蛭弧菌遊泳體 的發酵方法進行發酵；所述的蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDS01優選按細菌數1:1混合； 所述微生物製劑應用於消除水產品革蘭氏陽性致病菌； 所述水產品優選淡水產品；
所述水產品革蘭氏陽性致病菌包括結核分枝桿菌(Jl^co6acfer^m ^ercw/as7'51)、星狀諾卡氏菌(M c"Wa 、紅串紅球菌(i /wdococcMS
e/j^ojoo/^ )、糞鏈球菌(ASW/ tococcws々ec"//51)、表皮葡萄球菌(S鄉/ y/ococcws 、產氣莢膜梭菌(C7o血鄉w / e^/h'"gms)禾口穀氨酸棒狀桿菌 (Gofywe6acfer/^m w^zm/c/zm );
所述微生物製劑應用於消除食用或加工前水產品攜帶的革蘭氏陽性致病 菌，應用時蛭弧菌最佳濃度範圍為104 108pfu/mL;
所述微生物製劑應用於控制水產品運輸過程中的革蘭氏陽性致病菌，應用 時蛭弧菌最佳濃度範圍為103 106pfb/mL;
所述微生物製劑應用於控制水產品養殖水體中的革蘭氏陽性致病菌，應用 時蛭弧菌最佳濃度範圍則為102 105pfWmL;
本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果
1、 本發明所述的微生物製劑在消除水產品攜帶的革蘭氏陽性致病菌的應 用效果顯著。
本發明所述的微生物製劑在消除水產品食用或加工前、運輸過程及其養殖 水體中革蘭氏陽性致病菌的應用效果顯著，以羅非魚、南美白對蝦、河蜆、大
閘蟹例，如圖2 13所示，對革蘭氏陽性致病菌均有較高的消除率，消除率均 達90%以上。
2、 在食用前用蛭弧菌消除水產品中致病性革蘭氏陽性菌安全性好 蛭弧菌消除水產品中革蘭氏陽性致病菌方法是生物的方法，蛭弧菌可侵
染、裂解宿主細菌的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環境中致病菌的 生物淨化因子，且其在裂解完宿主細菌後，會因飢餓而自動消亡，因此對人和 動物無毒副作用。不僅可提高消費者生食水產品的安全係數，保護消費者的健 康，也為水產品的綠色加工生產提供保障。
3、 將本發明應用於水產品運輸過程中，方便、安全且效果好 水產品在運輸過程中採用蛭弧菌來控制革蘭氏陽性致病菌可防止水質惡
化、提高水產品存活率，同時避免使用抗生素，確保水產品的優質。
4、 本發明適合推廣應用於水產品的養殖過程在養殖期間即進行致病菌的消除工作，特別有利於減少或消除化學藥物如 抗生素的使用和殘留，確保水產品的優質，以羅非魚、南美白對蝦、河蜆、大
閘蟹養殖為例，2株蛭弧菌混合得到的微生物製劑使用時對淡水魚蝦貝蟹養殖 水體中革蘭氏陽性致病菌的消除試驗的效果如圖13所示，養殖水體中致病菌的 數量，可控制在100cfli/mL以內。
5、本發明為消除水產品所攜帶的致病菌提供一種新的方法並可適用於水 產品養殖到食用前的全過程中，有效地減少或消除化學藥物如抗生素的殘留， 確保水產品的優質，從根本上避免水產品食物中毒事件的發生，為出口創匯提 供強有力的保障。


圖1是蛭弧菌BDS02於電鏡下觀察的形態圖。
圖2是只含BDS02的微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致 病菌產氣莢膜梭菌的效果圖。
圖3是只含BDS02的微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致 病菌紅串紅球菌的效果圖。
圖4是只含BDS02的微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致 病菌穀氨酸棒狀桿菌的效果圖。
圖5是由BDS01和BDS02組成的微生物製劑用於消除水產品食用前的革 蘭氏陽性致病菌的效果圖。
圖6是只含BDS02的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中的革蘭氏陽 性致病菌產氣莢膜梭菌的效果圖。
圖7是只含BDS02的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中的革蘭氏陽 性致病菌紅串紅球菌的效果圖。
圖8是只含BDS02的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中的革蘭氏陽 性致病菌穀氨酸棒狀桿菌的效果圖。
圖9是由BDS01和BDS02組成的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中 的革蘭氏陽性致病菌的效果圖。
圖10是只含BDS02微生物製劑用於消除水產品養殖過程中的革蘭氏陽性 致病菌產氣莢膜梭菌的效果圖。
圖11是只含BDS02微生物製劑用於消除水產品養殖過程中的革蘭氏陽性致病菌紅串紅球菌的效果圖。
圖12是只含BDS02微生物製劑用於消除水產品養殖過程中的革蘭氏陽性 致病菌穀氨酸棒狀桿菌的效果圖。
圖13是由BDS01和BDS02組成的微生物製劑用於消除水產品養殖過程中 的革蘭氏陽性致病菌的效果圖。
圖14是由BDS01和BDS02組成的微生物製劑用於消除淡水產品養殖過程 中的致病菌的效果圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式 不限於此。
實施例1 (1)蛭弧菌BDS02的分離純化
將宿主嗜水氣單胞菌Ueramowos/^Ao; /k7"，購於廣東省微生物所菌種保 藏中心，編號GIM1.172)接種於含100mL滅菌LB (Luria-Bertani)液體培養 基(蛋白腖10g，酵母膏5g，蒸餾水lOOOmL， pH 7.2)的三角瓶中，置於轉 速為200rpm，溫度為28°C的恆溫搖床中培養16h，使其處於對數生長期。培養 液在4。C溫度條件下，以6000rpm速度離心20min，棄去上清液，沉澱下來的 菌體用lmL DNB (dilute nutrient broth)液體培養基(營養肉湯0.8g，酪蛋白酸 水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶於1000mL蒸餾水中，pH值為7.2 7.6)重 新懸浮後(濃度約為3xl0^fWmL)置於4。C冰箱，待用。
對採集的泥樣進行預處理，取泥樣約3g加入到含50mL滅菌DNB液體培 養基的三角瓶中，同時加入已製備好的增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌菌懸液 0.5mL，將三角瓶置於轉速為200rpm，溫度為28°C的恆溫搖床中培養36h，培 養液先在4°C條件下，1500rpm離心15min離心去泥渣，後6000rpm離心20min 去宿主，上清液再在4。C溫度條件下，以16000rpm速度離心20min，棄去上清 液，沉澱物用lmLDNB液體培養基重新懸浮，成為樣品濃縮液。
採用雙層平板法:取0.5mL樣品濃縮液和0.5mL嗜水氣單胞菌懸浮液混合， 此混合液再與3 3.5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水1000mL， pH7.2， 瓊脂粉7g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0.8g，酪蛋白酸水 解物0.5g，酵母精提物O.lg，蒸餾水1000mL， pH7.2，瓊脂粉17g)中並鋪平。
9將雙層平板置於28。C恆溫培養箱中培養，每隔12h觀測實驗結果。待含宿主菌 的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑，挑取不斷擴大的單斑，加入到含有50mLDNB 液體培養基的三角瓶中懸浮，同時加入相應的宿主菌濃縮液，置於轉速為 200rpm，溫度為28°C的恆溫搖床中連續培養30h。然後，培養液在4°C溫度條 件下，以6000rpm的速度離心20min，上清液在4。C溫度條件下，再以16000rpm 的速度離心20min，傾倒雙層瓊脂平板檢驗，再次挑取不斷擴大的單斑，並重 復若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明均一致的噬菌斑即為一株蛭 弧菌純菌株。挑選形狀規則、透明且噬菌斑最大的噬菌斑，命名為蛭弧菌 BDS02。將其進行負染後於電子顯微鏡下形態觀察(圖1):蛭弧菌呈單細胞， 弧形，大小為0.65x0.2^im，端生鞭毛，鞭毛長度至少1.8pm;所述蛭弧菌 (^fe〃ov沾n'o sp.) BDS02以雙層平板法於28'C培養四天可形成直徑1 2mm 的透明圓形噬菌斑。根據伯傑氏手冊(Bergey， sManual)對蛭弧菌的描述蛭 弧菌是寄生於其他細菌上的細菌，在寄生階段、細胞呈單個、小、彎曲、運動 的杆狀，極生鞭毛運動，鞭毛有鞘。由此可以確認，分離得到的蛭弧菌BDS02 為5A//ovz7^o sp.。應用DNA純化試劑盒提取蛭弧菌BDS02的基因組DNA， 擴增其16SrDNA。通過測序和拼接後(見序列表SEQ ID NO.l)在GenBank 中進行同源性搜索，比對結果顯示蛭弧菌BDS02的16S-ITS rDNA與其他已經 公開的蛭弧菌16SrDNA序列相似度高，但不完全相同，說明蛭弧菌BDS02是 首次分離得到。所述蛭弧菌BDS02於2009年8月7日在位於中國武漢市武漢 大學內的中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNO:M209170。 (2)消除水產品革蘭氏陽性致病菌的微生物製劑的製備 蛭弧菌菌液通過申請號"200710031166.X"的國家發明專利申請公開的高 密度蛭弧菌遊泳體的發酵方法進行發酵分別在2個裝有100mLLB (蛋白腖 10g，酵母膏5g，蒸餾水1000mL， pH7.2)液體培養基的錐形瓶中接種嗜水氣 單胞菌(An mo打cw /^&op/w7a，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號 GIM1.172) ， 250rpm、 30。C搖床培養24小時，培養液分別於4'C、 6000rpm離 心15min，棄上清。分別將沉澱加入到2個裝有100mLDNB液體培養基(營養 肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶於1000mL蒸餾水中， pH值為7.2 7.6)的錐形瓶中，同時再分別從雙層平板上挑取蛭弧菌BDS02 和蛭弧菌BDS01 (於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典 型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M209169)的噬菌斑至已加入嗜水氣單胞菌的DNB液體培養基中。恆溫搖床200rpm、 3(TC培養24h。培養液分 別於4°C 6000rpm離心20min，取上清液，再將上清液分別於4°C 16000rpm離 心20min，保留沉澱，加入DNB液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉澱物，使蛭弧 菌BDS02菌液和蛭弧菌BDSOl菌液的濃度分別為101QpfU/mL。
微生物製劑為由蛭弧菌數為101Qpfii/mL的蛭弧菌BDS02菌液組成。 (3)將微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致病菌
① 、製備水產品革蘭氏陽性致病菌液
產氣莢膜梭菌(C7o欲W^m; ^/h'wgmsATCC13124，購於廣東省微生物菌 種保藏中心)，用強化梭菌培養基(酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白腖10g，可 溶性澱粉lg，葡萄糖5g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g， NaC13g， NaAc 3g，蒸餾 水1000mL， pH8.5),厭氧條件下28。C培養24h。紅串紅球菌(及/w必coccws eo^ra/ o/&ATCC4277，購於中國普通微生物菌種保藏中心)，用ATYP培養 基(KH2P04lg， CaCl20.1g， NaHC033g，乙酸鈉lg， MgCl2 0.5g， NH4Cl lg， NaCl lg，微量元素溶液lmL，維生素溶液lmL，琥珀酸鈉lg，酵母提取物0.5g， 蛋白腖0.5g，蒸餾水1000mL; pH6.8;微量元素配方為FeCl2*4H20 1.8g， CoCl2.6H20 0.25g， NiCl2.6H2O0.01g， CuCl2-2H20 O.Olg， MnCl2 4H20 0.7g， ZnCl20.1g， H3BO30.5g， NaMo042H20 0.03g， Na2Se03'5H20 O.Olg，蒸餾水 lOOOmL;維生素溶液配方為生物素0.1g，煙酸0.35g，鹽酸硫胺素0.3g，對 氨基苯甲酸0.28，鹽酸吡多胺0.1g，泛酸鈣0.1g，維生素Bu0.05g，蒸餾水 lOOOmL)搖床培養，3CTC160rpm培養48h。穀氨酸棒狀桿菌(C07"e6ac^^附 g/"tow/c/^2 ATCC13032，購於廣東省微生物菌種保藏中心)用普通營養肉湯培 養基(蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL， pH7.4)搖床培 養，28。C160rpm培養24h。上述各菌的培養液分別經6000rpm、 4。C離心20min， 棄上清液，沉澱菌體用DNB液體培養基重新懸浮，分別調整各自濃度為 109cfli/mL。產氣莢膜梭菌菌液、紅串球菌菌液和穀氨酸棒狀桿菌菌液以1:1:1 的比例混合，得到水產品革蘭氏陽性致病菌液。
② 將微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致病菌 試驗容器為25L的水族箱，分為試驗組(試驗組共有3組，其中使用的蛭
弧菌終濃度分別為104pfu/mL、 1(^pfii/mL和108pfu/mL)和對照組，每組設3 個平行。試驗用水為濾膜過濾的養殖淡水，每個水族箱注入16L過濾水。水族 箱在實驗前經二氯異腈尿酸鈉消毒，水溫為26'C。在每個水族箱中加入步驟①製備水產品革蘭氏陽性致病菌液，終濃度為分別lxl04cfU/mL。然後每個水 族箱放羅非魚、南美白對蝦、河蜆以及大閘蟹各10隻。試驗所用羅非魚約重 140 190g，羅非魚、南美白對蟲下體長約為15-20cm，河蜆平均體長為40mm， 大閘蟹規格為30 40g。對照組為只加步驟①製備水產品革蘭氏陽性致病菌液 但不加蛭弧菌，實驗組分別加入微生物製劑，使用的蛭弧菌終濃度分別為 104pfb/mL、 106pfb/mL、和108pfti/mL。培養72小時後，取1000 ml水樣，用 0.22 um濾膜(Millipore)過濾濃縮細菌，然後在用10ml無菌水洗下濾膜上的 菌體，再按10倍稀釋法稀釋，最後從每個稀釋梯度樣品中吸取0.2mL的水樣 塗平板進行檢測。做三個平行樣檢測。
產氣莢膜梭菌的檢測採用強化梭菌瓊脂(強化梭菌培養基中加入瓊脂15g 即可得)選擇性培養，紅串紅球菌的檢測採用加入丁二酸(1%W/V)的改良 Raymond培養基(Na2C03 O.lg, CaCI2-6H20 O.Olg， MnCI2-4H20 0.007g,Na2HPO4.12H2O 35.8g， KH2 P04 13.6g， MgCl2.6H20 0.16g, NH4C1 2.0g， NaCl 5.0g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL， 丁二酸1%W/V， pH6.7)選 擇培養，穀氨酸棒狀桿菌的檢測採用CLED培養基(蛋白腖4g，牛肉粉3.0g, 胰蛋白腖4g，乳糖10g，半胱氨酸0.128g，溴麝香草酚藍0.02g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g， pH3.0)選擇性培養。計算活菌數。
從圖2，圖3和圖4中可知，添加只由蛭弧菌BDS02製成的微生物製劑 72h後，試驗系列中試驗組的各革蘭氏陽性致病菌產氣莢膜梭菌、紅串紅球菌 和穀氨酸棒狀桿菌濃度均呈下降趨勢。作用72小時後，蛭弧菌濃度為104pfWmL 時，對產氣莢膜梭菌、紅串紅球菌和穀氨酸棒狀桿菌的消除率分別為98.42%、 97.48%和98.00%。實驗結果表明，應用只由蛭弧菌BDS02製成的微生物製劑 對革蘭氏陽性致病菌進行消除時，蛭弧菌的濃度越大，作用時間越長，消除效 果就越好。
實施例2
(1) 消除水產品革蘭氏陽性致病菌的微生物製劑的製備 製備過程同實施例1步驟(2)，區別僅在於加入生理鹽水重新懸浮蛭弧菌
沉澱物，蛭弧菌BDSOl菌液和蛭弧菌BDS02菌液的濃度分別為101Qpfu/mL，將 蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDS02菌液按細菌數1:1混合，得到微生物製劑。
(2) 將微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致病菌① 製備水產品所含的革蘭氏陽性致病菌液
結核分枝桿菌(鄉C(^acfen)/m/i^ewM/a^ ATCC607，購於中國普通微生物菌種保藏中心)，用液體培養基(取嫩椰子汁經過棉紗布墊過濾後，再通過Whatmannl號濾紙過濾，每80 mL嫩椰子汁濾液加入20 mL馬血清和5 mL甘油，再加苯甲青黴素至混合液中，使培養基中苯甲青黴素最後濃度達到100IU/mL，混合液再經0.22um醋酸纖維素膜過濾)搖床培養，160rpm 37。C培養7d。星狀諾卡氏菌(A^cfln^ostero/AATCC19247，購於廣東省微生物菌種保藏中心)用ISP-2培養基(酵母提取物4g，麥芽提取物10g，葡萄糖4g，蒸餾水1000mL，pH73)搖床培養，160rpm28。C培養7d。糞鏈球菌(5^e/ toco"w/flecafeATCC29212，購於廣東省微生物菌種保藏中心)和表皮葡萄球菌
"top/^/ococcws印W^vwVfo ATCC12228,購於廣東省微生物菌種保藏中心)分別用普通營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL， pH7.4)搖床培養，160rpm 28。C培養36h。產氣莢膜梭菌(C7oWnV^w/ er/n."gera ATCC13124)、紅串紅球菌(i /2o^cocc附eo^^poto ATCC4277)和穀氨酸棒狀桿菌(Coo^e^c^^wg/wtomzV^w ATCC13032)的培養同實施例l歩驟(3)①。上述各菌的培養液分別經6000rpm、 4。C離心20min，棄上清液，沉澱菌體用DNB液體培養基重新懸浮，分別調整各自濃度為10、fu/mL。將上述菌按相同比例混合，得到水產品革蘭氏陽性致病菌液。
② 將微生物製劑用於消除水產品食用前的革蘭氏陽性致病菌實驗方法同實施例l步驟(3)②，微生物試劑的使用中，蛭弧菌的終濃
度也與實施例1步驟(3)②相同。培養72小時後，取1000 ml水樣，用0.22um濾膜(Millipore)過濾濃縮細菌，然後在用10ml無菌水洗下濾膜上的菌體，再按10倍稀釋法稀釋，最後從每個稀釋梯度樣品中吸取0.2mL的水樣塗平板進行檢測。做三個平行樣檢測。
結核分枝桿菌的檢測採用Middlebrook 7H10 (Difco， DISEASES OFAQUATIC ORGANISMS, Vol. 61: 41-51， 2004)的複合瓊脂培養基選擇培養，星狀諾卡氏菌的檢測釆用含氯黴素的沙氏葡萄糖培養基(蛋白腖10g，葡萄糖40g，瓊脂粉llg，氯黴素O.lg，蒸餾水lOOOmL， pH6.0士0.2)選擇培養，糞鏈球菌的檢測採用KF鏈球菌瓊脂(蛋白腖10g，酵母粉10g， NaC15g，甘油磷酸鈉10g，麥芽糖20g，乳糖1.0g，疊氮化鈉0.15g，溴甲酚紫0.015g，瓊脂20g， pH7.2)選擇培養，表皮葡萄球菌的檢測採用甘露醇高鹽瓊脂平板(牛肉浸出粉lg，多價腖10g，氯化鈉75g，甘露醇10g，酚紅0.025g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL， PH7.4i0.2)選擇培養。產氣莢膜梭菌的檢測採用強化梭菌瓊脂選擇培養，紅串紅球菌的檢測採用加入丁二酸(1%W/V)的改良Raymond培養基選擇培養，穀氨酸棒狀桿菌的檢測採用CLED培養基選擇培養。計算活菌數。
如圖5,不加蛭弧菌時，革蘭氏陽性菌總濃度有一定的增加；加入蛭弧菌後,革蘭氏陽性菌總濃度均減少。當蛭弧菌使用終濃度濃度為10VfWmL、l(^pfU/mL、1Spfi!/mL時，微生物製劑作用於食用羅非魚、南美白對蝦、河蜆和大閘蟹，72小時後革蘭氏陽性菌總濃度的消除率分別為99.90%、 99.95%和99.98%。
實施例3
將只含有蛭弧菌BDS02的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中的革蘭氏陽性致病菌，具體過程如下
試驗容器、試驗用水和試驗所用羅非魚、南美白對蝦、河蜆、大閘蟹規格均同實施例l。每個水族箱內放4隻完好的網格，在每一個網格中分別放入羅非魚、南美白對蝦、河蜆及大閘蟹，封好網格蓋子後立即把它平放到水族箱中，排出箱內多餘用水，使其水位剛好蓋過網格。在實驗前經二氯異腈尿酸鈉消毒，水溫為26。C。實驗期間用水連續充氣。3個水族箱作為對照組，僅加入實施例l步驟(3)①製備的水產品革蘭氏陽性致病菌液，終濃度為lxl04cfb/mL。試驗組中，3個水族箱為一組，共四組，除了致病菌加入與對照組一樣外，還分別加入實施例1製備的微生物製劑，使用的蛭弧菌終濃度分別達到103pfii/mL、104pfU/mL、 105pfii/mL、 106pfU/mL。培養72小時後，取1000 ml水樣，用0.22um濾膜(Millipore)過濾濃縮細菌，然後在用10ml無菌水洗下濾膜上的菌體，再按10倍稀釋法稀釋，最後從每個稀釋梯度樣品中吸取0.2mL的水樣塗平板進行檢測。做三個平行樣檢測。
產氣莢膜梭菌(ao^r/A>/w pe/yh'wgms ATCC13124)、紅串紅球菌(^/zo^fococciw ^3^/ ra/7o// s ATCC4277)和谷氣酸棒狀桿菌(Co^y"e6acfe,附g/Wtow/c/^ATCC13032)的檢測方法同實施例1，進行活菌計數。
消除試驗效果如圖6 8所示。圖6 8為試驗系列中蛭弧菌終濃度分別為103pfu/mL、 104pfU/mL、 105pfU/mL和106pfu /mL時產氣莢膜梭菌、紅串紅球菌和穀氨酸棒狀桿菌各自濃度的對數值。所有數據均為三個平行樣(水族箱)的平均值。當蛭弧菌BDS02濃度為10Spfu/mL時，對產氣莢膜梭菌、紅串紅球菌及穀氨酸棒狀桿菌的消除率分別為96.84%、 96.02%和94.99%。
實驗結果表明，蛭弧菌BDS02能有效消除革蘭氏陽性菌。將只含有蛭弧菌BDS02的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中的革蘭氏陽性致病菌，蛭弧菌使用終濃度為103 106pfU/mI^t，革蘭氏陽性菌濃度均保持下降趨勢。隨著蛭弧菌BDS02使用濃度的增大，革蘭氏陽性菌的消除率越大。
實施例4
將含有蛭弧菌BDS02和BDS01的微生物製劑用於消除水產品運輸過程中的革蘭氏陽性致病菌，具體過程如下-
實驗方法同實施例3，區別僅在於所用的微生物製劑和水產品革蘭氏陽性致病菌分別為實施例2製備的微生物製劑和水產品革蘭氏陽性致病菌。
72小時後，採用實施例2的方法進行檢測，計算活菌數目。
由圖9可知，與對照系相比較，試驗系列中革蘭氏陽性菌總濃度均保持下降趨勢。當蛭弧菌使用終濃度濃度分別為103pfWmL、 104pfb/mL、 105pfb/mL、1(^pfWmL時，微生物製劑在羅非魚、南美白對蝦、河蜆和大閘蟹的運輸過程中對革蘭氏陽性菌總濃度的消除率分別為99.80%、 99.87%、 99.92%和99.95%。
實施例5
將含有蛭弧菌BDS02的微生物製劑用於消除水產品養殖過程中的革蘭氏陽性致病菌，具體過程如下
試驗前，臨時建造12個養殖水池(0,5mxO.5mxO.5m=125L)。將養殖水池分為試驗組和對照組。試驗用水為不過濾的養殖淡水，每個水池注入IOOL。養殖水池在實驗前經二氯異腈尿酸鈉消毒，試驗期間水溫為26°C，每個水池放羅非魚、南美白對蝦、河蜆及大閘蟹各20隻，每日早晚各投餌一次。試驗所用羅非魚、南美白對蝦、河蜆、大閘蟹規格均同實施例1。 3個水池為對照組，僅加入實施例1步驟(3)①製備的水產品革蘭氏陽性致病菌液，終濃度為lxl04cfU/mL。試驗組中，3個水池為一組，除了致病菌加入與對照組一樣外，還分別加入實施例1製備的微生物製劑，使用的蛭弧菌終濃度分別達到102pfii/mL、 103pfu/mL、 104pfU/mL和105pfb/mL。
72小時後，採用實施例1的方法進行檢測，計算活菌數目。消除試驗效果如圖10 12所示。圖10 12為試驗系列中蛭弧菌終濃度分別為102pfii/mL、 103pfii/mL、 104pfii/mL和105pfo/mL時產氣莢膜梭菌、紅串紅球菌和穀氨酸棒狀桿菌各自濃度的對數值，所有數據均為三個平行樣(養殖水池)的平均值。當蛭弧菌BDS02的濃度為1(^pfU/mL時，對產氣莢膜梭菌、紅串紅球菌及穀氨酸棒狀桿菌的消除率分別為94.99%、 92.05%和卯.00%。
實驗結果表明，蛭弧菌BDS02能有效消除革蘭氏陽性菌。將只含有蛭弧菌BDS02的微生物製劑用於消餘水產品養殖過程中的革蘭氏陽性致病菌，蛭弧菌使用終濃度為1(^ 1SpfU/mL時，革蘭氏陽性菌濃度均保持下降趨勢。隨著蛭弧菌BDS02使用濃度的增大，革蘭氏陽性菌的消除率越大。
實施例6
將微生物製劑用於消除水產品養殖過程中的革蘭氏陽性致病菌，具體過程如下
實驗方法同實施例5,區別僅在於所用的微生物製劑和水產品革蘭氏陽性致病菌分別為實施例2製備的微生物製劑和水產品革蘭氏陽性致病菌。72小時後，採用實施例2的方法進行檢測，計算活菌數目。消除試驗效果如圖13所示，所有數據均為三個平行樣(養殖水池)的平均值。
由圖13可知，與對照組相比較，試驗系列中革蘭氏陽性菌總濃度均保持下降趨勢。蛭弧菌使用終濃度為102pfU/mL、 103pfU/mL、 104pfU/mL和105pfu/mL，革蘭氏陽性菌的消除率分別為99.00%， 99.60%， 99.75%和99.87%。 2株蛭弧菌聯用，能明顯消除養殖水體中的革蘭氏陽性菌的濃度，保證了淡水養殖過程中水產品的健康生長。
實施例7
將微生物製劑用於消除淡水養殖水體中的致病菌，具體過程如下嗜水氣單胞菌(4eramoMas/^c/ro; /H7a，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.172)，惡臭假單胞菌(屍^i^owo"ay ;^/Wfl，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.193)及大腸桿菌(五"/zmW^ co仏購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.42)分別用用普通營養肉湯培養基搖床培養，160rpm28。C培養12h。培養液分別於4。C6000rpm離心20min，棄上清液，沉澱菌體用無菌蒸餾水重新懸浮，再將這些沉澱菌體混合，並使其終濃度分別達到
lxi05cfii/mL。嗜水氣單胞菌的檢測採用RimLer-shotts選擇性培養基(L-鹽酸鳥氨酸0.05% w/v， L-鹽酸鳥氨酸0.65% w/v，麥芽糖0.35% w/v，次亞硫酸鈉0.68%w/v， L-半脫氨酸鹽酸鹽0.03。/。w/v，溴百裡酚藍0.003% w/v，枸橡酸鐵銨0.08°/。w/v，脫氧膽酸鈉0.1。/。w/v，新生黴素0.0005°/。 w/v，酵母抽提物0.3% w/v，氯化鈉0.5。/。w/v，瓊脂1.35% "，pH7.0)，惡臭假單胞菌的檢測採用NMS選擇性培養基(KH2P04 0.58 g/1 ; Na2HP04*12H20 2.17 g/l; NaN02 0,85 g/l; K2S040.17 g/l; MgS04*7H20 0.037 g/1; FeS04*7H20 0.012 g/1;微量元素溶液2mL， pH7.0)，遲緩愛德華菌(請提供菌株和來源，是多出的菌株？)的檢測採用HE選擇性瓊脂培養基(賕腖12g,牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水楊素2g，膽鹽20g氯化鈉5g，溶於400mL蒸餾水，加入20mL甲液(硫代硫酸鈉34g，檸檬酸鐵銨4g，蒸餾水lOOmL) ， 20mL乙液(去氧膽酸鈉10g，蒸餾水lOOmL)，0.4%溴麝香草酚藍溶液16mL， Andrade指示劑20mL (酸性復紅0.5g， lmol/L氫氧化鈉溶液16mL，蒸餾100mL，將復紅溶解於蒸餾水中，加入氫氧化鈉溶液。數小時後如復紅褪色不全，再加氫氧化鈉溶液1 2mL， pH7.5，再與瓊脂混合)，大腸桿菌的檢測採用TBX (—種顯色培養基)選擇性瓊脂培養基。
將革蘭氏陰性致病菌與步驟(2)製備的革蘭氏陽性致病菌按1:1，得到淡水養殖水體中的致病菌。
實施例2製備的微生物製劑消除淡水養殖水體中的致病菌實驗的實驗方法同實施例6，區別僅在於所用的致病菌為本實例製備的致病菌。
72小時後，進行活菌計數。
對養殖水體中革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌的消除試驗的效果如圖14所示。所有數據均為三個平行樣(養殖水池)的平均值。
如圖14，不加蛭弧菌時，養殖水體中的致病菌濃度有一定的增加；當加入濃度為10ifb/mL蛭弧菌時，致病菌的濃度最初為lxl05cfii/mL，到72h時，致病菌的濃度還不到100cfU/mL。可知這2株蛭弧菌合用能很好的控制養殖水體中革蘭氏陽性及革蘭氏陰性致病菌的濃度。蛭弧菌發使用濃度為102 105pfU/mL，蛭弧菌濃度越大，消除致病菌的效果就越好。在淡水養殖水體中加入所述的微生物製劑，既能全面預防各種病害，同時又保證了水產品的優質。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。SEQUENCE LISTING
〈110〉華南理工大學
〈120〉 一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株及其應用
〈130〉 8
〈160〉 1
〈170> Patentln version 3，2
〈210〉 1
〈211〉 1835
〈212〉 DNA
〈213〉 蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)
〈400〉 1
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60
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atcgctt犯a agctatctaa gttcaga/ttg atctctgcaa ctcgagatca tgaagttgga 1260
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ttggttacag cacacgcttg ataagcgtgg ggtcggaagt tcgagtcttc ccaggcccac 1680
caagttctac tgtactggaa tgcggtgtaa gttagagttt tgctgaacgg ttttcgttct 1740
ttgacatttg aatagattga tttagttgat ttttagcgag gttagttcca ttctttt犯g 1800
ctacaaaggg cttacggtgg atgccctggc agtca 183權利要求
1、一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株，其特徵在於，所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02，於2009年8月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM209170。
2、 一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的微生物製劑，其特徵在於， 所述微生物製劑含有權利要求1所述的蛭弧菌BDS02。
3、 根據權利要求2所述的微生物製劑，其特徵在於所述的微生物 製劑含有蛭弧菌(3^//0^'^/0 8 .) BDSOl。
4、 根據權利要求3所述的微生物製劑，其特徵在於所述微生物制 劑中蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDS01按細菌數1:1混合。
5、 權利要求2 4任一項所述微生物製劑的應用，其特徵在於所述 微生物製劑用於消除水產品革蘭氏陽性致病菌。
6、 根據權利要求5所述微生物製劑的應用，其特徵在於所述水產 品為淡水產品。
7、 根據權利要求6所述微生物製劑的應用，其特徵在於所述水產 品革蘭氏陽性致病菌為結核分枝桿菌(聊co6acfe^a附ft^ercw/o^;s)、星狀 諾卡氏菌(M)caWar ay/era/cfes)、紅串紅球菌(朋odococc"s e/j/Zwo/Po/^ )、 糞鏈球菌(iSW/^ococcMs^ecato)、表皮葡萄球菌(S鄉/^/ococcws e/ zV^vmD 、產氣莢膜梭菌(C7o血A—/ e咖'"ge"s)及穀氨酸棒狀杆 菌(C"o^y打e6acteri^m g/i^amz'cpm )。
8、 根據權利要求6所述微生物製劑的應用，其特徵在於所述微生物製劑應用於消除食甩或加工前水產品攜帶的革蘭氏陽性致病菌；所述微生物製劑應用於控制水產品運輸過程中的革蘭氏陽性致病菌； 所述微生物製劑應用於控制水產品養殖水體中的革蘭氏陽性致病菌。
9、 根據權利要求8所述微生物製劑的應用，其特徵在於 所述微生物製劑應用於消除食用或加工前水產品攜帶的革蘭氏陽性致病菌，使用的蛭弧菌終濃度為104 108pfu/mL;所述微生物製劑應用於控制水產品運輸過程中的革蘭氏陽性致病菌， 使用的蛭弧菌終濃度為103 106cfU/mL;所述微生物製劑應用於控制水產品養殖水體中的革蘭氏陽性致病菌，使用的蛭弧菌終濃度為102 105pfii/mLc
全文摘要
本發明公開了一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株及其應用。本發明分離得到一株在電子顯微鏡下觀察呈單細胞，弧形，大小為0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛長度至少1.8μm的蛭弧菌BDS02。將其以雙層平板法於28℃培養四天可形成直徑1-2mm的透明圓形噬菌斑。應用所述蛭弧菌BDS02製備的微生物製劑對水產品食用前，運輸過程及養殖過程中的常見革蘭氏陽性致病菌，包括結核分枝桿菌、星狀諾卡氏菌、紅串紅球菌、糞鏈球菌、表皮葡萄球菌、產氣莢膜梭菌及穀氨酸棒狀桿菌有顯著的消除作用，不僅可提高消費者生食水產品的安全係數，保護消費者的健康，也為水產品的綠色加工生產提供保障。
文檔編號C12N1/20GK101649298SQ20091004227
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月28日 優先權日2009年8月28日
發明者敏 張, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學