包含乳鐵蛋白的營養組合物在刺激免疫細胞中的用途的製作方法

2023-04-26 16:07:01 1

本申請是申請日為2011年12月14日的中國專利申請201180062843.9「包含乳鐵蛋白的營養組合物在刺激免疫細胞中的用途」的分案申請。

本公開一般性地涉及具有乳鐵蛋白、特別是由非人來源產生的乳鐵蛋白的營養組合物領域，例如嬰兒配方（infantformulas），人乳強化劑，兒童膳食補充劑等。更具體地，本公開涉及通過向人施用包含由非人來源產生的乳鐵蛋白的營養組合物，在人中刺激先天免疫細胞的方法。

背景技術：

目前有各種用於人、尤其是年輕人的膳食組合物，在特定生命階段提供補充或者基本營養。一般來說，用於嬰兒的商品化的膳食組合物力圖儘可能模擬人乳的組成和相關功能。通過其中一些具有生理活性的蛋白和摻合的脂肪成分的組合，膳食組合物得以配製為它們模擬人乳，用作完全或部分替代品。其它經常在用於嬰兒的膳食組合物中使用的成分可包括碳水化合物來源如乳糖以及其它維生素、礦物質和元素，認為它們存在於人乳中用於被嬰兒吸收。

乳鐵蛋白是人乳中的基本蛋白之一，認為它是具有大約80千道爾頓平均分子量的糖蛋白。其為鐵結合蛋白，具有以可逆的方式結合兩分子的鐵的能力，並能促進人腸道內鐵的吸收。在功能上，乳鐵蛋白調節鐵吸收，並且如此地，能夠結合基於鐵的自由基以及提供鐵用於免疫應答。

乳鐵蛋白的另外一個作用是其一般性地在人、但尤其是在嬰兒中在防禦腸道感染中的抗微生物活性。已知乳鐵蛋白既是抑菌的又是殺菌的，在抑制特定細菌生長同時也在微生物成功侵入腸道細胞之前將其殺死。

在獲取商品化的有活力的（viable）膳食組合物中，由於在加工過程中活性的預期喪失，乳鐵蛋白的添加通常受到限制。例如，一般來說，加工嬰兒配方和其它產品如人乳強化劑和各種兒童產品中的溫度和ph需求降低乳鐵蛋白的特定功能，導致乳鐵蛋白不包含在最終的製劑中。另外，乳鐵蛋白通常僅被考慮其鐵結合性質，因此在認為該性質被加工條件所減少的情況下，乳鐵蛋白可能通常被排除在製劑之外。

進一步地，如現有技術已知，人母乳的鐵相對低，每升母乳含約0.3毫克鐵。雖然該量低，但是人嬰兒具有高的吸收率，從母乳中吸收大約一半的鐵。然而，當人嬰兒被給予具有高水平鐵強化例如每升從約10毫克到約12毫克的現有技術配方時，嬰兒吸收小於約5％的總鐵。應用現有技術配方中如此增加水平的鐵，事實上所有的鐵結合位點會預期被佔據，因為乳鐵蛋白是已知的鐵轉運蛋白。

現有技術配方的其它問題包括不能提供抑菌效果。這部分是由於使用具有被封閉或損壞的結合位點的乳鐵蛋白，因為抑菌效果至少部分與配方中存在的乳鐵蛋白結合鐵的程度有關。

相應地，提供含有乳鐵蛋白特別是由非人來源產生的乳鐵蛋白的營養組合物例如嬰兒配方、人乳強化劑、兒童膳食補充劑等將是有益的。優選地，即使在高溫和低ph條件下加工後，組合物中含有的乳鐵蛋白也能夠刺激先天免疫細胞。測定先天免疫細胞對包含乳鐵蛋白的營養組合物的應答也將是有益的。

技術實現要素：

簡而言之，在一個實施方案中，本公開涉及一種在人中刺激至少一種類型的先天免疫細胞的方法。在某些實施方案中，該方法包括向人施用營養組合物，所述組合物包含：

a.至多約7g/100kcal的脂肪或脂類來源，更優選約3g/100kcal到約7g/100kcal的脂肪或脂類來源；

b.至多約5g/100kcal的蛋白來源，更優選約1g/100kcal到約5g/100kcal的蛋白來源；和

c.至少約10mg/100kcal的乳鐵蛋白，更優選約70mg到約220mg/100kcal的乳鐵蛋白，並且最優選約90mg到約190mg/100kcal的乳鐵蛋白。任選地，在某些實施方案中，營養組合物可以進一步包含約0.1g/100kcal到約1g/100kcal包含聚葡萄糖（polydextrose）和/或低聚半乳糖（galactooligosaccharide）的益生元組合物。更優選地，營養組合物包含約0.3g/100kcal到約0.7g/100kcal包含聚葡萄糖和低聚半乳糖的組合的益生元組合物。

優選地，乳鐵蛋白是非人乳鐵蛋白和/或通過遺傳修飾的生物產生的人乳鐵蛋白。在一個特別優選的實施方案中，所使用的乳鐵蛋白使有效量的含乳鐵蛋白的營養組合物可以被施用以刺激人中至少一種類型的先天免疫細胞，即使在加工過程中，營養組合物已暴露於某些加工條件如巴氏滅菌中典型的ph和溫度波動。

具體實施方式

在某些實施方案中，本公開提供了通過向人施用含有脂類或脂肪來源、蛋白來源和由非人來源產生的乳鐵蛋白的營養組合物，在人中刺激至少一種類型的先天免疫細胞的方法。

如本文所用，「來自非人來源的乳鐵蛋白」指由人母乳之外的來源產生或者獲得的乳鐵蛋白。例如，本公開中使用的乳鐵蛋白包括通過遺傳修飾的生物產生的人乳鐵蛋白和非人乳鐵蛋白。本文所使用的術語「生物」，指任何連續生存的系統，例如動物、植物、真菌或微生物。本文所使用的術語「非人乳鐵蛋白」指具有不同於人乳鐵蛋白的胺基酸序列的胺基酸序列的乳鐵蛋白。

乳鐵蛋白是約80kd，根據物種含有1－4個聚糖的單鏈多肽。不同物種乳鐵蛋白的3d結構非常類似，但不相同。每個乳鐵蛋白包含兩個同源的葉，稱為n－和c－葉，分別指分子的n－末端和c－末端部分。每葉進一步由兩個亞葉或結構域組成，它們形成裂縫，在裂縫處鐵離子（fe3+）與碳酸（碳酸氫根）陰離子協同作用緊密結合。這些結構域分別稱為n1，n2，c1和c2。乳鐵蛋白的n末端具有強陽離子肽區域，其負責許多重要的結合特性。乳鐵蛋白具有非常高的等電點（～pi9），且其陽離子性質在其抵禦細菌、病毒和真菌病原體的能力中發揮主要作用。在乳鐵蛋白的n末端區域中有幾個陽離子胺基酸殘基簇，介導乳鐵蛋白對廣範圍微生物的生物學活性。例如，人乳鐵蛋白的n末端殘基1－47（牛乳鐵蛋白的1－48）對於乳鐵蛋白的鐵非依賴性的生物學活性是關鍵的。在人乳鐵蛋白中，殘基2到5（rrrr）和28到31（rkvr）是n末端中富含精氨酸的陽離子結構域，對乳鐵蛋白的抗微生物活性是尤其關鍵的。在牛乳鐵蛋白中發現了n末端中的類似區域（殘基17到42，fkcrrwqwrmkklgapsitcvrrafa）。

如在出版物biochemistryandcellbiology,pp275-281(2006)中出現的「perspectivesoninteractionsbetweenlactoferrinandbacteria」中所述，來自不同宿主物種的乳鐵蛋白，其胺基酸序列可能不同，儘管它們在內葉的末端區域帶有帶正電荷的胺基酸而共同具有相對高的等電點。用於本公開的合適的乳鐵蛋白包括與hlf（349－364）片段處的胺基酸序列avgeqelrkcnqwsgl具有至少48％同源性的那些。在一些實施方案中，乳鐵蛋白與hlf（349－364）片段處的胺基酸序列avgeqelrkcnqwsgl具有至少65％的同源性，並且在一些實施方案中，至少75％的同源性。例如，可被接受用於本公開的非人乳鐵蛋白包括但不限於，牛乳鐵蛋白，豬乳鐵蛋白，馬乳鐵蛋白，水牛乳鐵蛋白，山羊乳鐵蛋白，鼠乳鐵蛋白和駱駝乳鐵蛋白。

用於本公開的乳鐵蛋白可以例如從非人動物的奶中分離，或者通過遺傳修飾的生物產生。例如，在通過引用整體併入本文的美國專利號4,791,193中，okonogi等公開了生產高純度牛乳鐵蛋白的方法。通常，所公開的方法包括3步。原料奶首先與弱酸性陽離子交換劑接觸吸附乳鐵蛋白，然後是第二步，其中進行清洗除去非吸附的物質。隨後是解吸步驟，其中將乳鐵蛋白除去產生純化的牛乳鐵蛋白。其它方法可包括如在美國專利號7,368,141、5,849,885、5,919,913和5,861,491中描述的步驟，它們的公開內容均通過引用整體併入。

在一個實施方案中，乳鐵蛋白在營養組合物中以至少約10mg/100kcal的量存在，尤其當所述營養組合物意圖由兒童應用時。在某些實施方案中，乳鐵蛋白的上限是約240mg/100kcal。在另一個實施方案中，營養組合物是嬰兒配方時，乳鐵蛋白在營養組合物中以從約70mg到約220mg/100kcal的量存在；在另一個實施方案中，乳鐵蛋白以約90mg到約190mg/100kcal的量存在。用於嬰兒的營養組合物可以包含從每毫升配方約0.5mg到約1.5mg的量的乳鐵蛋白。在替代人乳的營養組合物中，乳鐵蛋白可以從每毫升配方約0.6mg到約1.3mg的量存在。

如所述，在本公開的某些實施方案中，營養組合物當施用於人時，刺激至少一種類型的先天免疫細胞。本領域公知幾種類型的先天免疫細胞，包括但不限於天然殺傷細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞；和吞噬細胞包括巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞。優選地，當施用於人時，營養組合物刺激巨噬細胞、樹突細胞和/或中性粒細胞。營養組合物可通過本領域已知的任何方式刺激先天免疫細胞。優選地，營養組合物刺激從巨噬細胞和/或樹突細胞表達共刺激分子。在另一個優選實施方案中，營養組合物刺激從巨噬細胞和/或樹突細胞產生細胞因子。在又一個優選實施方案中，營養組合物刺激中性粒細胞的呼吸爆發能力。

優選地，營養組合物中使用的乳鐵蛋白即使在高溫和低ph條件下加工後，在人腸道中也保持其穩定性和活性。在本公開的一個實施方案中，所用的乳鐵蛋白為非人乳鐵蛋白。

例如，令人驚訝地，牛乳鐵蛋白即使暴露於會預期破壞或嚴重限制人乳鐵蛋白的穩定性或活性的條件即低ph（即低於7，並且甚至低如約4.6或更低）和/或高溫（即高於約65℃，並且高如約120℃）也保持某些殺菌活性。這些低ph和/或高溫條件在本文所述類型的營養組合物的某些加工方案、例如巴氏滅菌期間可以預期。然而，雖然牛乳鐵蛋白具有與人乳鐵蛋白具有約70％序列同源性的胺基酸組成，並且在人乳鐵蛋白變得不穩定或失活的條件下穩定並且保持活性，牛乳鐵蛋白對人腸道中發現的不期望的細菌病原體具有殺菌活性。

在一些實施方案中，本公開的營養組合物可以是嬰兒配方。術語「嬰兒配方」適用於通過作為人乳替代品滿足嬰兒營養需求的液體或粉末形式的組合物。在美國，嬰兒配方的含量由21c.f.r.§§100,106和107下列出的聯邦法規規定。這些法規定義了常量營養素、維生素、礦物質和其它成分水平，以努力模擬人母乳的營養和其它性質。在一個單獨的實施方案中，營養產品可以是人乳強化劑，意味著它是加入人乳以增加人乳營養價值的組合物。作為人乳強化劑，公開的組合物可以是粉末或者液體形式。在另一個實施方案中，公開的營養產品可以是兒童營養組合物。

優選地，營養組合物施用於嬰兒或兒童。如本文所述，術語「嬰兒」通常定義為從出生到12個月年齡的人。「兒童」定義為年齡超過12個月到約12歲大的人。

本公開的營養組合物可以提供最低、部分或全部的營養支持。營養組合物可以是營養補充劑或膳食替代品。在一些實施方案中，營養組合物可以連同食物或另外的營養組合物施用。在本實施方案中，營養組合物可以在對象攝取前與食物或其它營養組合物互相混合，或可以在攝取食物或營養組合物之前或之後施用給對象。營養組合物可以施用於接受嬰兒配方、人乳、人乳強化劑或其組合的早產嬰兒。對於本公開的目的，「早產嬰兒」是少於37周妊娠後出生的嬰兒，而「足月嬰兒」是至少37周妊娠後出生的嬰兒。

營養組合物可以但不需要是營養全面的。技術人員將認識到「營養全面」取決於許多因素而變化，包括但不限於適用該術語的對象的年齡、臨床狀況和膳食攝入。通常，「營養全面」指本公開的營養組合物提供正常生長所需的足量的所有碳水化合物，脂類，必需脂肪酸，蛋白質，必需胺基酸，條件必需胺基酸，維生素，礦物質和能量。如用於營養物的，術語「必需」指不能由機體以足以用於正常生長和保持健康的量合成且從而必需通過飲食補充的任何營養物。如用於營養物的，術語「條件必需」指在機體得不到足量的前體化合物用於發生內源合成時的條件下必須通過飲食補充的營養物。

通過限定，對於早產嬰兒為「營養全面」的組合物將提供早產嬰兒生長所需的定性和定量上足量的所有碳水化合物，脂類，必需脂肪酸，蛋白質，必需胺基酸，條件必需胺基酸，維生素，礦物質和能量。通過限定，對於足月嬰兒為「營養全面」的組合物將提供足月嬰兒生長所需的定性和定量上足量的所有碳水化合物，脂類，必需脂肪酸，蛋白質，必需胺基酸，條件必需胺基酸，維生素，礦物質和能量。通過限定，對於兒童為「營養全面」的組合物將提供兒童生長所需的定性和定量上足量的所有碳水化合物，脂類，必需脂肪酸，蛋白質，必需胺基酸，條件必需胺基酸，維生素，礦物質和能量。

營養組合物可以以本領域已知的任何形式提供，包括粉末，凝膠，懸液，膏（paste），固體，液體，液體濃縮物或即用產品。在一個優選實施方案中，營養組合物是嬰兒配方，尤其是適於用作嬰兒唯一營養源的嬰兒配方。

在優選實施方案中，本文公開的營養產品可以經腸道施用。如本文所述，「經腸道」指通過胃腸道或消化道或在胃腸道或消化道內，「經腸道施用」包括口服餵食、胃內餵食、經幽門施用或者向消化道內的任何其它導入。

用於實施本公開的合適的脂肪或脂類來源可以是本領域中任何已知或使用的來源，包括但不限於，動物來源，例如乳脂，黃油，奶油，卵黃脂質；海洋來源，例如魚油，海洋油（marineoils），單細胞油；蔬菜和植物油，例如玉米油，低芥酸菜籽油，葵花油，大豆油，棕櫚油精，椰子油，高油酸葵花油，月見草油，菜籽油，橄欖油，亞麻子（亞麻籽）油，棉籽油，高油酸紅花油，棕櫚硬脂（palmstearin），棕櫚仁油，小麥胚芽油；中鏈甘油三酯油和乳液和脂肪酸的酯，及其任意組合。

在某些實施方案中，營養組合物中包含的蛋白來源包括牛奶蛋白。可用於實施本公開的牛奶蛋白來源包括但不限於，乳蛋白粉，乳蛋白濃縮物，乳蛋白分離物，脫脂奶固體，脫脂奶，脫脂奶粉，乳清蛋白，乳清蛋白分離物，乳清蛋白濃縮物，甜乳清，酸乳清，酪蛋白，酸酪蛋白，酪蛋白酸鹽（如酪蛋白酸鈉，酪蛋白酸鈉鈣，酪蛋白酸鈣）及其任意組合。

在一個實施方案中，蛋白以完整蛋白提供。在其它實施方案中，蛋白以完整蛋白和水解程度在約4％和10％之間的部分水解蛋白的組合提供。在又一個實施方案中，蛋白來源可以補充以含穀氨醯胺肽。

在本公開的一個具體實施方案中，蛋白來源包含乳清和酪蛋白，且乳清對酪蛋白的比例與人母乳中發現的比例類似。例如，在某些實施方案中，乳清與酪蛋白的重量比從約20％乳清：80％酪蛋白到約80％乳清：20％酪蛋白。

在本公開的一個實施方案中，營養組合物可以包含一種或多種益生菌。術語「益生菌」指具有低病原性或無病原性、對宿主健康發揮有益效果的微生物。只要其實現意圖的結果，任何本領域已知的益生菌在本實施方案中都是可接受的。在一個具體的實施方案中，益生菌可以選自乳桿菌屬（lactobacillus）物種，鼠李糖乳桿菌gg（lactobacillusrhamnosusgg），雙歧桿菌屬(bifidobacterium)物種，短雙歧桿菌(bifidobacteriumbrevis)，長雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)，和動物雙歧桿菌乳亞種bb-12（bifidobacteriumanimalissubsp.lactisbb-12）。

如果包括在組合物內，益生菌的量可以從每kg體重每天約104到約1010個菌落形成單位（cfu）變化。在另一個實施方案中，益生菌的量可以從每kg體重每天約106到約109個菌落形成單位變化。在又一個實施方案中，益生菌的量可以是每kg體重每天至少約106個菌落形成單位。並且，公開的組合物還可以包括益生菌條件培養基成分。

在一個實施方案中，益生菌中的一種或多種是有活力的。在另一個實施方案中，益生菌中的一種或多種是無活力的。如本文所述，術語「有活力的」指活微生物。術語「無活力的」或「無活力的益生菌」指非活的益生菌微生物、其細胞成分和其代謝物。這些無活力的益生菌可以已被熱殺滅或以其它方式滅活，但是保持有益影響宿主健康的能力。用於本公開的益生菌可以是天然發生的、合成的或通過遺傳操作生物開發的，無論這些新的來源是目前已知的或後來開發的。

在本公開的一個實施方案中，營養組合物可以包括包含一種或多種益生元的益生元組合物。如本文所述，術語「益生元」指通過選擇性刺激結腸中一種或有限數目的能改善宿主健康的細菌的生長和/或活性而有益影響宿主的不可消化的食物成分。「益生元組合物」是包含一種或多種益生元的組合物。這些益生元可以是天然發生的、合成的或通過遺傳操作生物和/或植物開發的，無論這些新的來源是目前已知的或後來開發的。在某些實施方案中，本公開組合物中包含的益生元包括美國專利號7,572,474中教導的那些，該專利的公開內容通過引用併入本文。

用於本公開的益生元可以包括寡糖，聚糖，和包含果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的其它益生元。更具體地，用於本公開的益生元可以包括乳果糖，低聚乳果糖，棉子糖，葡寡糖，菊粉，聚葡萄糖，聚葡萄糖粉，低聚半乳糖，低聚果糖，低聚異麥芽糖，大豆低聚糖，低聚乳果糖，低聚木糖，殼寡糖，低聚甘露糖，低聚阿拉伯糖，低聚唾液酸糖，低聚巖藻糖，和低聚龍膽糖。優選地，營養組合物包含聚葡萄糖和/或低聚半乳糖。任選地，除了聚葡萄糖和/或低聚半乳糖之外，營養組合物還包含一種或多種附加的益生元。

如果包含在營養組合物內，營養組合物中存在的益生元的總量可以是從約0.1g/100kcal到約1g/100kcal。更優選地，營養組合物中存在的益生元的總量可以是從約0.3g/100kcal到約0.7g/100kcal。至少20％的益生元應當包含低聚半乳糖（gos）和/或聚葡萄糖（pdx）。

如果聚葡萄糖用於益生元組合物中，在一個實施方案中，營養組合物中聚葡萄糖的量可以為約0.1g/100kcal到約1g/100kcal的範圍。在另一個實施方案中，營養組合物內的聚葡萄糖的量是從約0.2g/100kcal到約0.6g/100kcal的範圍內。

如果低聚半乳糖用於益生元組合物中，在一個實施方案中，營養組合物中低聚半乳糖的量可以從約0.1g/100kcal到約1g/100kcal。在另一個實施方案中，營養組合物中的低聚半乳糖的量是從約0.2g/100kcal到約0.5g/100kcal。在某些實施方案中，益生元組合物中聚葡萄糖與低聚半乳糖的比例為約9：1到約1：9。

在一些實施方案中，本公開的營養製劑可以進一步包含長鏈多不飽和脂肪酸（lcpufas）來源。優選地，lcpufas的來源包含二十二碳六烯酸（dha）。其它合適的lcpufas包括，但不限於α-亞油酸，γ-亞油酸，亞油酸，亞麻酸，二十碳五烯酸（epa）和花生四烯酸（ara）。

在一個實施方案中，營養組合物補充以dha和ara二者。在此實施方案中，ara:dha的重量比可以從約1：3到約9：1。在本發明的一個實施方案中，ara:dha的重量比是約1：2到約4：1。

營養組合物中長鏈多不飽和脂肪酸的量可以從約5mg/100kcal到約100mg/100kcal變化，更優選從約10mg/100kcal到約50mg/100kcal。

營養組合物可以使用本領域已知的標準技術補充以含dha和ara的油。例如，dha和ara可以通過替換組合物中正常存在的等量油例如高油酸葵花油來加入組合物。作為另一個實例，含有dha和ara的油可以通過替換不含dha和ara的組合物中正常存在的總脂肪摻合物的等量剩餘部分（rest）來加入組合物。

如果使用，dha和ara的來源可以是本領域已知的任何來源，例如海洋油，魚油，單細胞油，卵黃脂質和腦脂質。在一些實施方案中，dha和ara分別來源於單細胞martek油，dhasco®和arasco®，或其變體。dha和ara可以是天然形式，前提是lcpufa來源的其餘部分對嬰兒不造成任何實質的有害效果。可選地，dha和ara可以以精煉的形式應用。

在本公開的一個實施方案中，dha和ara的來源是美國專利號5,374,567、5,550,156和5,397,591中教導的單細胞油，這些專利的公開內容通過引用整體併入本文。但是，本公開並不僅限於這些油。

在某些實施方案中，營養組合物包含從約0.5mg/100kcal到約5mg/100kcal的鐵，包括結合到乳鐵蛋白上的鐵。

實施例

提供下面的實施例來闡釋本公開的營養組合物的實施方案，但是其不應解釋為對本公開的任何限制。基於對說明書或本文公開的營養組合物或方法的實施的考慮，在本文權利要求範圍之內的其它實施方案對本領域技術人員是顯而易見的。意圖說明書連同實施例僅考慮為示例性的，本公開的範圍和精神由所附權利要求表明。

實施例1

本實施例闡釋根據本公開的營養產品的一個實施方案。

實施例2

本實施例闡釋根據本公開的營養產品的另一個實施方案。

實施例3

本實施例闡釋了可用於製備根據本公開營養產品的成分的一個實施方案。

實施例4

本實施例闡釋了可用於製備根據本公開營養產品的成分的另一個實施方案。

優選地，營養組合物施用於人並刺激人中至少一種類型的先天免疫細胞。

本說明書所引用的所有參考文獻，包括但不限於所有論文、出版物、專利、專利申請、演講、課文、報告、手稿、手冊、書籍、網絡發表物、雜誌論文、期刊等，在此通過引用整體併入本說明書。對本文參考文獻的討論僅是為了總結其作者作出的觀點，並不是承認任何參考文獻構成現有技術。申請人保留質疑所引用的參考文獻的準確性和相關性的權利。

雖然本公開的優選實施方案已經使用特定術語、工具和方法進行了描述，但是這些描述僅用於示例性目的。所使用的詞語是說明性詞語而不是限制的。可以理解，在不偏離所附權利要求列出的本公開的精神或範圍的情況下，本領域技術人員可以進行改變和變化。另外，應當理解各實施方案的各個方面可以全部或部分地相互替換。例如，雖然示例了生產根據那些方法製備的商品化無菌液體營養補充劑的方法，其它的用途也是預期的。因此，所附權利要求的精神和範圍不應限於本文包含的優選形式的描述。