一株高耐性酵母菌株及其構建方法

2023-04-23 00:03:46 1

一株高耐性酵母菌株及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株及其構建方法，所述高耐性酵母菌株通過在親本酵母菌株中，選用強啟動子PGK1過表達H/ACA小核仁RNA(SNR84)全序列，來獲得該高耐性酵母菌株。該菌株在高溫、高糖和冷凍環境中其細胞活性較親本菌株均有顯著提高。該麵包酵母在熱激處理中的抗高溫能力強，高糖麵團中的抗高糖能力強，冷凍麵團中的抗冷凍能力強，解決了麵包製作過程中的技術障礙和質量缺陷，有廣泛的應用前景。
【專利說明】一株高耐性酵母菌株及其構建方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，涉及工業微生物的育種，特別是一種耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株及其構建方法。
【背景技術】:
[0002]麵包酵母是麵食製作過程中必不可少的微生物發酵劑和疏鬆劑，同時酵母也是一種生物營養劑，可以增加麵團的營養成分。隨著烘焙產業的發展，各種麵團技術應運而生，良好的酵母品種是麵包品質的重要保證。但是，在麵包烘培過程中，麵包酵母常常處於高溫、高糖、冷凍等環境中，不良的生長環境將導致麵包酵母活性的下降，從而導致麵包品質的下降。烘培者一般選取耐高溫、耐高糖、耐冷凍的麵包酵母投入使用，以期適應各種麵團製作技術，獲得較高品質的麵包產品。
[0003]麵包酵母的高溫耐受性是麵包酵母質量的重要指標之一。酵母的高溫耐受性主要指麵包酵母在烘焙過程中對高溫(>50°C )的適應性。烘烤麵包是麵包製作的一個關鍵環節，主要採用的設備是遠紅外烤爐。麵團升溫至50°C之前有一個旺盛的產氣過程，隨著溫度的繼續升高，氣體衝破麵筋網絡的包圍而溢出形成麵包最初的疏鬆結構，麵包酵母在此過程中活性逐漸降低直至死亡。為了獲得較高的產氣量，必須維持高溫下酵母細胞的活性。因此，選育耐熱性酵母菌株可以解決這一烘焙技術問題，推動烘焙產業的發展，為烘培食品行業帶來巨大的經濟效益。
[0004]麵包酵母的高糖耐受性是麵包酵母質量的另一重要指標。酵母的高糖耐受性主要指麵包酵母對麵團中高濃度的蔗糖的適應性。當蔗糖含量超過6%時，高濃的糖濃度破壞酵母細胞，抑制酵母菌呼吸作用相關酶的活性，使得葡萄糖的分解受阻，從而影響酵母的產氣速率。傳統麵包製作一般採用加大酵母用量的方法，但這無疑提高了甜麵包的製作成本，同時殘留在麵包裡的酵母也對麵包的風味有一定的影響。因此，為了降低甜麵包的製作成本，保持麵包的風味，必須提高酵母對高糖的耐性。耐高糖酵母菌株的選育為甜麵包產品的獲得和相關食品產業的發展提供了重要途徑。
[0005]冷凍麵團技術是麵包生產的一種新工藝，是將麵包製作過程的兩個工藝(麵團製作、烘烤)相分離的過程。與傳統麵包製作法相比，冷凍麵團法具有生產效率高、麵包質量穩定、方便快捷等優點，但同時也對麵包酵母的耐冷凍性提出了更高的要求。麵團冷凍時，溫度一般為-18~_20°C，麵團中的酵母在冷凍、凍藏和解凍過程中都會受到嚴重傷害，尤其是發酵後的麵團經過冷凍工序後，酵母的存活率和產氣能力顯著下降。普通麵包酵母凍存20天後，其活力下降一半以上，導致解凍後的麵團膨脹不足，醒發時間延長，且成品麵包體積小、結構粗糙、口感差，產品質量明顯下降。正是這些缺陷的存在，限制了冷凍麵團技術的發展。因此，選育耐冷凍麵包酵母可解決冷凍麵團技術的發展瓶頸，推動冷凍麵團技術在國內的發展。
[0006]Nakagawa等利用雜交技術得到發酵性能良好的耐冷凍酵母菌株，其在不加糖麵團和甜麵團中均能夠保持較高活力。Cakar等通過乙基甲磺酸化學誘變的方法，篩選得到耐高溫耐冷凍酵母菌株，其冷凍耐性和高溫耐性較出發菌株分別提高了 102倍和89倍。Sasano等通過調節POGl的表達水平來提高麵包酵母細胞在各種環境條件下的耐受性以及發酵性能，但是不能達到酵母細胞高糖耐性和冷凍耐性同時提高。
[0007]在我國，對於酵母耐高溫、耐高糖、耐冷凍機制和菌種選育的研究較少，不僅制約了酵母工業的發展，同時也制約了相關麵團技術等在我國的推廣應用。
[0008]SNR84基因編碼H/ACA snoRNA (小核仁RNA)。大部分H/ACA小核仁RNA參與鹼基修飾，像大亞基rRNA的假尿苷化，指定rRNA中假尿苷的形成位點；小部分H/ACA小核仁RNA在剪切前體rRNA中也起到重要作用。據推測，SNR84參與到激活大亞基rRNA假尿苷化的功能，加快大亞基rRNA的成熟速率和提高大亞基rRNA的數量。當成熟的大亞基rRNA在指數生長期快速形成時，大部分相關酶的產率提高。Lee等以半乳糖為碳源，通過過表達SNR84基因提高了釀酒酵母在半乳糖中的生長及酒精產量。
[0009]同時，目前對於H/ACA小核仁RNA的研究基本上集中在理論研究，關於H/ACA小核仁RNA的應用僅有少數報導，尤其在選育耐性菌株中的研究更是空白。因此，本發明通過過表達SNR84基因編碼的H/ACA snoRNA，選育耐高溫、耐高糖、耐冷凍酵母菌株，在拓寬H/ACA小核仁RNA的應用的同時滿足酵母應用相關領域對酵母的較高要求。

【發明內容】
:
[0010]本發明所解決的技術問題之一是提供一株耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株。
[0011]所述高耐性酵母 菌株是在出發酵母菌株中過表達由SNR84基因編碼的H/ACA小核仁RNA全序列所得。
[0012]所述SNR84基因的Gene ID為:9164879，序列如核苷酸序列表中SEQ NO:1所示。
[0013]優選的，所述出發酵母菌株為麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。
[0014]本發明所解決的另一個技術問題是提供一種耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株的構建方法，包括如下步驟:
[0015](I)以麵包酵母CICC31616總DNA為模板，PCR擴增SNR84基因；
[0016](2)將PCR產物連接到含有釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)強啟動子的質粒上,獲得重組質粒I ;
[0017](3)以重組質粒I為模板，通過PCR擴增獲得SNR84基因和強啟動子的連接片段；
[0018](4)將步驟(3)獲得的片段連接到帶有KanMX抗性的載體上，得到重組質粒2 ；
[0019](5)將步驟(4)獲得的重組質粒導入出發酵母菌株中，並通過G418抗性篩選獲得重組菌株。
[0020]所述含有PGKl強啟動子的質粒優選pUC質粒；
[0021 ] 所述帶有KanMX抗性的載體優選Y印352載體；
[0022]所述麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC31616,是一株保存於中國工業微生物菌種保藏管理中心的菌株，公眾可通過購買獲得。
[0023]所述重組菌株可通過上述方法構建，也可以用其他分子生物學手段獲得。這些方法已有許多文獻報導，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版,科學出版社，1995。[0024]本發明所述的麵包酵母重組菌株，其在高溫(52°C )熱激2min後的細胞存活率較親本菌株提高280% ;在高糖(30%蔗糖)麵團中培養2h後的細胞存活率較親本菌株提高29% ;在_201:冷凍7d後，不加糖麵團中細胞存活率和相對發酵力分別較親本菌株提高107%和38%，高糖麵團中細胞存活率和相對發酵力分別較親本菌株提高100%和21%。
[0025]有益效果:
[0026]1、本發明提供一種既適合於高糖麵團又適合於冷凍麵團發酵且在高溫烘焙中保持較高活性的耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株，克服了普通麵包酵母高溫耐性、高糖耐性和冷凍耐性差的不足。
[0027]2、本耐高溫、耐高糖、耐冷凍酵母是在保持優良基本發酵性能的前提下，高溫熱激後，能夠保持較高的細胞存活能力；在麵團中擁有良好的抗高糖、抗冷凍能力，解決了高糖麵團、冷凍麵團麵包製作過程中的技術障礙和質量缺陷，提高了我國烘焙食品工業的生產技術水平，對促進我國酵母工業的發展和相關麵團技術的推廣應用具有重要意義。
[0028]3、本發明所述的高耐性酵母菌株是通過過表達由SNR84基因編碼的H/ACA小核仁RNA全序列所得，是對H/ACA小核仁RNA的創造性運用，為其理論研究和應用研究開闢了新的領域。
[0029]4、選育得到的菌株對發酵設備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設備和條件均可使用，因而有廣泛的應用前景，必將帶動我國焙烤食品行業、饅頭產業和零售行業的發展。
【專利附圖】

【附圖說明】: [0030]圖1為Y印-KPS質粒構建過程；
[0031 ] 圖2重組質粒Y印-KPS的PCR驗證
[0032]其中:(a)中M為marker ;I為以Y印-KPS為模板，PCR擴增SNR84片段
[0033](b)中M為marker ; I為以Y印-KPS為模板，PCR擴增片段PS ；
[0034]圖3過表達SNR84基因的重組菌株的驗證
[0035]其中:M為marker ;I為以重組菌株的酵母質粒為模板，PCR擴增PS片段；2為以出發菌CICC31616酵母質粒為模板，PCR擴增PS片段。
【具體實施方式】:
[0036]下面通過具體的實施方案敘述本發明的一種耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母及其選育方法。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0037]實施例1:耐高溫、耐高糖、耐冷凍麵包酵母菌株的構建
[0038](I)重組質粒Y印-KPS的構建
[0039]重組質粒Y印-KPS的構建流程如圖1所示；
[0040]以酵母菌株CICC31616總DNA為模板，PCR擴增SNR84基因全序列；
[0041]上遊引物S1:5』 -GGAAGATCTATTGCACAACTTAAGTTTGTCGAGG-3> (SEQ ID NO:2)；
[0042]下遊引物S2:5』 -GGAAGATCTTAATGTGTCTCTTTGAGTCATGTTCCTT-3> (SEQ ID NO:3)；劃線部分為酶切位點；
[0043]PCR 反應條件:95°C 5min ；94°C 40s, 54°C lmin, 72°C 40s, 30 個循環；72°C lOmin,
0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑑定擴增產物；[0044]將PCR產物連接到含有強啟動子的pUC-PGKl載體上，得到pUC-PGKS ；以pUC-PGKS為模板，PCR擴增得到插入SNR84基因的PGKp-SNR84-PGKt(PS)片段；
[0045]上遊引物PSl:5』 -CCCAAGCTTTCTAACTGATCTATCCAAAACTGA-3> (SEQ ID NO:4)；
[0046]下遊引物PS2:5』 -CCCAAGCTTTAACGAACGCAGAATTTTC-3> (SEQ ID NO:5)；
[0047]劃線部分為酶切位點；
[0048]PCR 反應條件:95V 5min ；94°C 40s，60。。lmin, 72°C 140s, 30 個循環；72°C IOmin0
0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑑定擴增產物。
[0049]將片段PS連接到帶有KanMX抗性的Y印352-K載體上，得到重組質粒Y印-KPS。
[0050]PCR驗證結果如圖2所示。
[0051](2)重組菌株的構建
[0052]通過醋酸鋰轉化的方法將重組質粒Y印-KPS導入麵包酵母出發菌株CICC31616，通過G418抗性篩選重組子進行PCR驗證，即以轉化子的酵母質粒為模板擴增PS片段，可得到2200bp左右的條帶，而出發菌株則不能擴增得到該片段，PCR驗證結果如圖3所示。結果表明，在酵母細胞中實現了強啟動子PGKl過表達SNR84基因全序列。
[0053]實施例2:耐高溫、耐高糖、耐冷凍麵包酵母菌株發酵實驗
[0054](I)重組菌株與出發菌株的高溫耐性實驗
[0055]挑取一環酵母細胞於YEH)液體培養基中培養至指數期(OD66tl =1-1.5);將細胞轉接入5mL新鮮YEH)液體培養基，用YEH)液體培養基調整細胞OD6tltl = 1.0後取200 μ L細胞培養液至1.5mL離心管內，52°C水浴熱激2min，立即冰浴。待細胞冷卻後，取50 μ L細胞培養物稀釋至一定濃度，同時將未熱激的酵母細胞稀釋相同倍數，分別塗布於YEH)平板中培養2d,計數單菌落個數,分別記作UpU215高溫下細胞存活率(％ ) = (U1Ai2)XIOO^q
[0056](2)重組菌株與出發菌株的高糖耐性實驗
[0057]挑取一環酵母細胞於YEH)培養基中，30°C，靜置培養24h ;以10% (v/v)的接種量轉入糖蜜培養基(糖度為10~12Brix的糖蜜中添加0.5g/L硫酸銨、5g/L酵母粉)中，30°C，180r/min，培養24h至穩定期(OD600為1.5左右);靜置培養2h，在4000r/min下，離心5min，無菌水洗滌兩次後收集菌體備用。將上述離心收集得到的酵母按1.5% (m/v)的接種量接到高糖模擬麵團培養基(300g/L蔗糖、2.5g/L硫酸銨，5g/L尿素，16g/L磷酸二氫鉀，5g/L磷酸氫二鈉,0.6g/L硫酸鎂,22.5mg/L煙酸,5.0mg/L泛酸,2.5mg/L維生素BI,
1.25mg/L維生素B6,1.0mg/L維生素B2，0.5mg/L葉酸)，30°C，靜置培養2h。取ImL細胞培養液稀釋至一定濃度；同時將接入到高糖模擬麵團培養基(30%蔗糖)未經培養的細胞稀釋相同倍數，塗布於YEH)平板中培養2d，計數單菌落個數，分別記作u3、u4。高糖下細胞存活率(% ) = (u3/u4) X 100% O
[0058](3)重組菌株與出發菌株的冷凍耐性實驗
[0059]挑取一環酵母細胞於YEH)培養基中，30°C，靜置培養24h ;以10% (v/v)的接種量轉入糖蜜培養基(糖度為10~12Brix的糖蜜中添加0.5g/L硫酸銨、5g/L酵母粉)中，30°C，180r/min，培養24h至穩定期(OD600為1.5左右);靜置培養2h，在4000r/min下，離心5min，無菌水洗漆兩次後收集菌體備用。
[0060]將上述離心收集得到的酵母按1.5% (m/v)的接種量分別接到低糖模擬麵團培養基(40%葡萄糖)和高糖模擬麵團培養基(30%蔗糖)，立即分別取ImL細胞培養液於-20°C冷凍。7d後，將細胞培養物於30°C解凍30min。取100 μ L冷凍細胞液稀釋至10_4 ;同時將未冷凍的細胞培養物稀釋相同倍數，塗布於YEH)平板中培養2d，計數單菌落個數。低糖模擬麵團培養基中冷凍前後單菌落個數分別記作u5、U6 ;高糖模擬麵團培養基中冷凍前後單菌落個數分別記作u7、u8。不加糖冷凍細胞存活率(％) = (u6/u5) X 100% ;高糖冷凍細胞存活率(% ) = (u8/u7) X 100%。
[0061]稱取上述離心收集得到的酵母9.0g,與4.0g Nacl、150mL水、280g標準麵粉混合後，放入預熱的發酵儀中進行發酵。30°C下預發酵Ih後，稱取50g麵團於-20°C冷凍7d後，於30°C解凍30min。將解凍後麵團放入發酵儀繼續發酵，記錄2h CO2產氣量為V1 ;同時，記錄相同質量(50g)未經冷凍麵團2h CO2產氣量,記作v2。不加糖冷凍相對發酵力(％ )=(V1ZV2) X 100% ο
[0062]稱取上述離心收集得到的酵母9.0g，與44.8g蔗糖、2.8g Nacl、130mL水、280g標準麵粉混合後，放入發酵儀中進行發酵。30°C下預發酵2h後，稱取50g麵團於-20°C冷凍7d後，於30°C解凍30min。將解凍後麵團放入發酵儀繼續發酵，記錄2h CO2產氣量為V3 ;同時，記錄相同質量(50g)未經冷凍麵團2h CO2產氣量，記作v4。高糖冷凍相對發酵力)=(v3/v4) X 100%。
[0063](4)重組菌株與出發菌株的耐性實驗結果
[0064]出發菌株及重組菌株耐性實驗結果見表1。結果顯示，在不同處理條件下，與出發菌株相比，重組菌株表現出較強的細胞活性和較高的麵團發酵力。重組菌株的高溫、高糖、不加糖冷凍以及高糖冷凍細胞存活率較親本菌株分別提高了 280 %、29 %、107 %、100 %。麵團冷凍後，重組菌株的無糖冷凍以及高糖冷凍相對發酵力較親本菌株分別提高38%、21 %。由結果看出，SNR84基因的過表達可提高酵母細胞在高溫、高糖和冷凍處理後的細胞存活能力，從而提高麵團發酵力 。
[0065]表1親本菌株及轉化子細胞存活率及發酵力
[0066]
鋼應存活率{n/o)相對發醇力(%)
菌株 IJiiifiimSMim iim^
?溫高糖
冷凍冷凍冷凍冷凍
CICO1616 5 93 44 325563
Φ:組 #!'株 W 120 91 647676
[0067] 注:所示數據為三個平行試驗結果的平均值。
【權利要求】
1.一株耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株，是在酵母出發菌株中過表達H/ACA小核仁RNA的編碼基因SNR84獲得。
2.如權利要求1所述的一株耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株，其特徵在於，所述出發菌株為麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC31616。
3.如權利要求1所述的一株耐高溫、耐高糖、耐冷凍的高耐性酵母菌株，其特徵在於，所述SNR84基因其Gene ID為:9164879，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO:1所示。
4.一株高耐性酵母菌株的製備方法，包括以下步驟: (1)以麵包酵母CICC31616總DNA為模板，PCR擴增SNR84基因； (2)將PCR產物連接到含有PGKl強啟動子的質粒上，獲得重組質粒I; (3)以重組質粒I為模板，通過PCR擴增獲得SNR84基因和強啟動子的連接片段； (4)將步驟(3)獲得的片段連接到帶有KanMX抗性的載體上，得到重組質粒2; (5)將步驟(4)獲得的重組質粒2導入出發酵母菌株中，獲得重組菌株。
5.如權利要求4所述的一株高耐性酵母菌株的製備方法，其特徵在於，所述含有PGKl強啟動子的質粒為puc質粒。
6.如權利要求4所述的一株高耐性酵母菌株的製備方法，其特徵在於，所述帶有KanMX抗性的載體為Y印352載體。
7.如權利要求4所述的一株高耐性酵母菌株的製備方法，其特徵在於，所述重組質粒導入出發酵母菌株的方法為醋酸鋰轉化法。
8.如權利要求1所述的高耐性酵母菌株在麵包生產中的應用。
【文檔編號】A21D8/04GK104017742SQ201410277435
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月20日 優先權日:2014年6月20日
【發明者】張翠英, 肖冬光, 林雪, 董健, 柏曉雯, 宋海巖 申請人:天津科技大學