用於檢測患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其製備方法
2023-05-14 05:45:16
專利名稱：用於檢測患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其製備方法。
在測試方法上，用於快速診斷的滴金法(dot immunogold filtration assayDIGFA)已廣泛應用於人類免疫缺陷病(HIV)，抗B型肝炎病毒核心抗原的抗體，C-反應蛋白，早早孕及感染的診斷等疾病的檢測。在上述系列臨床測試中全部用膠體金為標記物進行目視觀察。無論以膠體金標記抗原還是標記抗體都存在一個成本價格昂貴的特點。
步入90年代，隨著HIV疾病在世界範圍內出現不同程度的蔓延，引起了世界衛生組織及各國的衛生部門及醫療機構對該病的防治進行了大量全方位的研究，並發現由於HIV病毒對患者免疫功能的損壞，在受到HIV病毒感染的人中，當T-細胞再次受到外源蛋白刺激時，許多T-細胞甚至包括沒有受到感染的T-細胞都不是按正常方式發生細胞分裂，而是發生細胞自殺，即出現由遺傳控制的功能所發生的稱為程序性細胞自殺，故此，該技術可能對於愛滋病患者病情的發展及跟蹤治療提供一絲幫助。同時該技術對於研究和檢測皰疹性皮膚病患者Gliadin受體是個極為有利的工具。
本發明的目的是提供一種檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其製備方法，該試劑盒容易製備，利用該試劑盒可以快速檢測。
為達到上述目的，本發明採用以下技術方案這種用於檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒包括(1)載體濾膜其孔徑0.22-1.20um，(2)標記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，標記物濃度為0.01％-2.00％(V/V)，標記物為亮綠或快綠，抗原與標記物的用量比為1-10∶10-1(V/V)，(3)質控血清其特異蛋白總量總Ig為2-10mg/ml。
本發明的方法包括以下步驟(1)標記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，採用亮綠或快綠為標記物，其濃度為0.01％-2.00％(V/V)，抗原與標記物的用量比為1-10∶10-1(V/V)，按照上述配比，逐滴混合，室溫靜置半小時後，於顯微鏡下觀察有大量藍綠色囊泡出現，表示標記完成，
(2)質控血清的製備取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作為免疫青紫藍兔的抗原，採用常規手段，免疫；抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與製備；測定抗血清中蛋白含量的測定。
在本發明專利中利用了抗原可呈現的特殊形態特徵即可以在特定條件下抗原能夠以出現囊泡形態的特徵，並能利用該特徵包裹可做為標記物的染料的技術進行抗原標記，亮綠，快綠就是本方法中標記抗原的染料。用該標記抗原在載體濾膜上對人血清和免疫兔血清中抗Gliadin抗體進行定性測定獲得了與酶聯免疫吸附實驗中的有類同的定性數據。故用綠色染料標記抗原進行滴滲並用於臨床快速診斷的技術是個創新。
以下結合實施例對本發明作進一步說明實施例1．質控血清的製備1、免疫取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作為免疫青紫藍兔的抗原，採用常規手段，分四次進行免疫。整個免疫過程在無菌條件下進行。在免疫前首先將抗原配製成1mg/ml的溶液備用。
第一次免疫取抗原3ml，逐滴加入等體積的完全佐劑，在加佐劑過程中不斷研磨，使成乳濁液，分次注入消毒後的兔腳墊中，每隻腳墊0.4-4.5ml。
第二次免疫抗原乳濁液的製備方法同上，只不過採用不完全佐劑(即不含卡介苗)，製備體積亦為6ml，兔免疫部位為背部皮下多點注射，每點0.4-0.5ml。
第三次免疫完全同第二次免疫。
第四次免疫取無菌的抗原溶液1ml，慢速注入兔耳緣靜脈中，每隻耳朵注射量為0.5-0.7ml。每次免疫的間隔均為5-7天，經過近一月的免疫後，從兔的耳部取少量血進行效價測定。
2、抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與製備——PAGE法1血清處理血清10％甘油=1∶1(v/v)2電極緩衝液Tris-Gly,pH 8.33膠濃度濃縮膠5％，分離膠12％4電泳條件溫度15-20oC，恆流20mA，電泳4-5小時5分離提取γ-球蛋白採用橫向切膠法。連續切膠，每條膠長2mm；並分別立即浸泡於0.9％的生理鹽水中，4oC提取48小時。
6電泳條帶掃描在分離提取γ-球蛋白的同時，進行縱向切膠並對蛋白條帶染色及脫色，然後作條帶掃描，以確定活性部位的位置。
3、抗血清中蛋白含量的測定(1)在紫外區波長280nm下測定抗血清的總蛋白含量。
(2)根據免疫活性測定的結果和電泳條帶掃描圖譜確定電泳條帶中γ-球蛋白的位置，計算γ-球蛋白的含量。本質控血清的特異蛋白總量，總Ig為2-10mg/ml。
上述免疫活性測定採用酶聯免疫吸附法1抗原包被量10-50μg/孔2第一抗體為系列稀釋的抗血清3第二抗體為羊抗兔酶標抗體4底物TMB5反應產物測定波長450nmIg類型的檢測採用直接法，通過酶聯免疫吸附實驗即將正常人或病人血清直接鋪板，再用酶標羊抗人IgG或羊抗人IgA及酶的底物按常規比例進行檢測。
本實施例用是的酶標抗體為辣根酶標記，底物為TMB，酶促反應產物檢測使用酶標儀，波長為450nm。
抗原的標記免疫用的抗原製成E1cm1％280nm為15-5的濃度與O.01％-2.00％(V/V)的亮綠按1-10∶10-1的比例逐滴混合，室溫靜置半小時後，於顯微鏡下觀察有大量的藍綠色囊泡出現，便意味著完成製備標記抗原。
滴綠法檢測人血清抗Gliadin IgG抗體首先滴15μl病人血清在給定的濾膜上，再滴上15μl試劑盒中標記抗原，(本測定中，標記抗原的抗原濃度為E1cm1％280nm為10，亮綠濃度0.1(V/V)，兩者比例為1∶1，本實用新型採用的磷酸緩衝液為0.01mol/L,pH為7.6)反應完畢(待液體完全滲入膜後)，立即觀察到濾膜上標記抗原的外圍沉澱圈與內部(蘭綠色實心或雜斑)之間有空白間隔，其中空白間隔極明顯者定為陽性，空白間隔僅可分辯者定為±，不可分辯者定為陰性(見
圖1)，表1系濾膜片法(本發明)與酶聯免疫法結果對照比較測試樣品\ 測試結果＼方法 酶聯免疫法O,D450nm;濾膜片法**正常血清(N)*0.37 有可辯白環±稀釋100倍正常人血清(N100) 0.12 無白環-稀釋20倍免疫兔血清(IR20)1.11 有明顯白環+(N)*用14人正常人血清測試結果
**濾膜法見圖1圖1中，左圖為陽性，在蘭綠色斑外有白環，中圖為±性，在蘭綠色斑外有不明顯的白環；右圖為陰性，在蘭綠色斑無白環。
檢測範圍血清總蛋白47×103mg/L-58×103mg/L血清球蛋白1.4×103mg/L---2.0×103mg/L本發明優點本發明提供的試劑盒製作簡便，測定快速。
權利要求
1.一種用於檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒，其特徵在於它包括(1)載體濾膜其孔徑0.22-1.20um，(2)標記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，標記物濃度為0.01％-2.00％(V/V)，標記物為亮綠或快綠，抗原與標記物的用量比為1-10∶10-1(V/V)，(3)質控血清其特異蛋白總量總Ig為2-10mg/ml。
2.一種製備權利要求1所述試製盒的方法，其特徵在於它包括以下步驟(1)標記抗原抗原濃度E1cm1％280nm為15-5，採用亮綠或快綠為標記物，其濃度為0.01％-2.00％(V/V)，抗原與標記物的用量比為1-10∶10-1V/V)，按照上述配比，逐滴混合，室溫靜置半小時後，於顯微鏡下觀察有大量藍綠色囊泡出現，表示標記完成，(2)質控血清的製備取市售SIGMA公司G3375 Gliadin作為免疫青紫藍兔的抗原，採用常規手段，免疫；抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與製備；測定抗血清中蛋白含量的測定。
3.根據權利要求2所述製備試劑盒的方法，其特徵在於所述抗血清中清蛋白和γ-球蛋白的分離與製備，採用PAGE法1血清處理血清10％甘油=1∶1(V/V)2電極緩衝液Tris-Gly,pH 8.33膠濃度濃縮膠5％，分離膠12％4電泳條件溫度15-20℃，恆流20mA，電泳4-5小時5分離提取γ-球蛋白採用橫向切膠法。連續切膠，每條膠長2mm；並分別立即浸泡於0.9％的生理鹽水中，4℃提取48小時。6電泳條帶掃描在分離提取γ-球蛋白的同時，進行縱向切膠並對蛋白條帶染色及脫色，然後作條帶掃描；抗血清中蛋白含量的測定1在紫外區波長280nm下測定抗血清的總蛋白含量。2根據免疫活性測定的結果和電泳條帶掃描圖譜確定電泳條帶中γ-球蛋白的位置，計算γ-球蛋白的含量，本實驗控制特異蛋白總量，總Ig為2-10mg/ml。
全文摘要
一種用於檢測腹腔自身免疫病患者血清中Gliadin抗體的試劑盒及其製備方法,試劑盒包括:(1)載體濾膜:其孔徑:0.22－1.20um,(2)標記抗原:抗原濃度E
文檔編號G01N33/531GK1304042SQ00100250
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月11日 優先權日2000年1月11日
發明者王素雲 申請人:吳光耀