一種新型檢測H2S螢光分子探針的製備方法和應用與流程
2023-04-25 00:37:46
本發明屬於生物化學技術領域,具體涉及一種新型檢測H2S螢光分子探針的製備方法和應用。
背景技術：
在過去幾年中，對於硫化氫的生理功能的不斷研究，硫化氫被看作是繼一氧化氮和一氧化碳之後的第三種信號分子，據報導，在人體血液中內源性的硫化氫含量是10-100 μM，內源性的硫化氫可以參與很多方面的生理過程，例如舒緩血管平滑肌，調節神經傳遞，抑制胰島素信號，調節體內炎症以及氧氣釋放等。考慮到硫化氫具有很高的擴散性和活性，從而導致硫化氫在生理條件下主要以硫氫根離子（SH-）形式存在。
硫化氫的內源水平與一些疾病如阿爾茨海默氏病，唐氏症候群，糖尿病和肝硬化，此外，它已被證實為有毒氣體；螢光檢測方法具有簡單，高靈敏度，低成本和能實時性檢測等特點。因此，發展在溫和條件下對硫化氫具有快速反應的高選擇性和靈敏性的螢光探針尤為重要，因為它們對於更好和更深入地了解硫化氫的生物學功能具有很大的幫助。
技術實現要素：
鑑於上述情況，本發明的目的在於克服一些現有技術的不足，提供一種選擇性好，靈敏度高，響應速度快，新型檢測H2S螢光分子探針的製備方法和應用。
本發明的目的還在於提供一種製備方法簡單、反應條件溫和、成本較低的上述螢光分子探針的合成方法。
為實現上述目的，本發明採取的技術方案為，一種新型檢測H2S螢光分子探針，其化學分子結構如（1）所示。
本發明使用的新型檢測H2S螢光分子探針，採用E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和2,4-二硝基氟苯在縛酸劑的存在下發生親核取代反應，生成的碳氧鍵作為檢測基團。
一種新型檢測H2S螢光分子探針的製備方法，所述的螢光分子探針的製備方法包括以下步驟：
. 將E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和2,4-二硝基氟苯溶於無水乙腈中，加入當量的無水三乙胺，100℃下攪拌回流反應24小時;
. 將步驟中的反應液冷至室溫，過濾，真空乾燥濾餅得到所述螢光分子探針化合物。
所述的步驟中的E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和2,4-二硝基氟苯摩爾比為1:1.1-1 :1.5。
所述的螢光分子探針在細胞內成像的應用。
在本說明書的實施例中更詳細地說明了該探針的合成和檢測方法。
本發明的螢光分子探針使用方法沒有特殊限制，通常可以在室溫下將探針分子溶解在二甲基亞碸（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中進行測試。
本發明的一種新型檢測H2S螢光分子探針的具體特徵如下：
該分子螢光探針用二甲基亞碸（DMSO）溶解，探針分子在二甲基亞碸（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時其最大紫外吸收波長在320 nm。 加入硫氫根離子後，探針分子產生一個以475 nm為中心的新的寬吸收峰，隨著硫氫根離子濃度的增高，吸收峰逐漸上升，同時在320 nm處的吸收峰的逐漸下降。相應地，溶液的顏色由紅色變為無色，裸眼能夠清楚的看到顏色的明顯變化。而且，探針分子在二甲基亞碸（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時基本無螢光，當加入硫氫化鈉（常用的H2S供體）後，探針分子有一明顯的螢光發射光譜，最大發射波長在620 nm，接近近紅外區域，非常有利於生物細胞成像分析。
本發明所述的螢光探針分子靈敏度高，螢光性能穩定，合成步驟簡單，產率高，選擇性好，檢測速度快較其他方法快，檢測限低等優點，並且適合裸眼檢測，同時，該分子螢光探針不受SO32-, NO3-, NO2-, SCN-, CN-, SO42-, HSO4-, HSO3-, S2O32-, S2O82-等陰離子的幹擾，即使在有幹擾離子存在的條件下，探針也對H2S有很好的響應，使得該螢光分子探針在生物化學，環境保護科學等分析檢測領域用於H2S的檢測，具有潛在的實際應用價值。
附圖說明
圖1為本發明的螢光探針在二甲基亞碸和水溶液（2:8，v/v）體系中，紫外吸收光譜隨加入H2S濃度增加的變化情況，橫坐標為波長，縱坐標為吸光度。
圖2為本發明的螢光探針在二甲基亞碸和水溶液（2:8，v/v）體系中，螢光發射光譜隨加入H2S濃度增加的變化情況，橫坐標為波長，縱坐標為歸一化螢光強度。
圖3為本發明的螢光探針在二甲基亞碸和水溶液（2:8，v/v）體系中，螢光發射光譜隨加入等濃度不同離子變化情況，橫坐標為波長，縱坐標為螢光強度（圖中ygx15為該探針的代號）。
圖4為本發明的螢光探針的核磁共振氫譜圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明做進一步的說明。
本發明所述的螢光分子探針的合成路線如下圖所示。
實施例1
步驟1. 合成2-（苯並[d]噻唑-2-基）-6-甲基苯酚
a. 將3 g 2-羥基-3-甲基苯甲酸和2.25 g 鄰氨基苯酚及40 mL多聚磷酸加入100 mL圓底燒瓶中，在120℃下攪拌反應6小時，然後在160℃下繼續攪拌反應5小時；
b. 將步驟a中的反應液冷卻至室溫，然後倒入冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，過濾，真空乾燥即得2-（苯並[d]噻唑-2-基）-6-甲基苯酚。
步驟2. 合成3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯甲醛
. 將2 g 2-（苯並[d]噻唑-2-基）-6-甲基苯酚和5.8 g烏洛託品溶於50 mL三氟乙酸中，在攪拌回流狀態下反應8小時；
. 將步驟中的反應液冷卻至室溫，加水稀釋，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥；
. 將步驟中的反應液加水並攪拌回流1小時，5℃過夜，過濾，水洗固體，乾燥得得目標化合物。
步驟3. 合成E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物
①. 將1 g 3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯甲醛和0.88 g 1,4-二甲基吡啶-1-鎓碘化物溶於15 mL無水乙醇，加入6-7滴哌啶，室溫反應12小時；
②. 將①中的反應液過濾，無水乙醇洗滌所得固體，真空乾燥得E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物。
步驟4. 合成E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-（2,4-二硝基苯氧基）-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物
.將1.5 g E-4-（3-（苯並[d]噻唑-2-基）-4-羥基-5-甲基苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘化物和0.631 g 2,4-二硝基氟苯溶於15 mL無水乙腈中，加入394 mg的三乙胺，100 ℃下攪拌回流反應24小時；
. 將步驟中的反應液冷至室溫，過濾，真空乾燥濾餅得到所述螢光分子探針化合物1.608 g。
上述螢光分子探針的核磁氫譜數據：1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 – 8.97 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.97 – 8.91 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 8.63 – 8.58 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.35 – 8.28 (m, 3H), 8.25 – 8.19 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 8.13 – 8.07 (m, 2H), 8.03 – 7.98 (m, 1H), 7.75 – 7.67 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 7.59 – 7.53 (m, 1H), 7.50 – 7.44 (m, 1H), 7.06 – 7.01 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 4.34 – 4.27 (s, 3H), 2.30 – 2.22 (s, 3H)。
實施例2：新型檢測H2S螢光分子探針的應用
將該分子螢光探針溶於二甲基亞碸（DMSO）中，配置成1 mmol/L的探針溶液；取探針溶液加入相應的二甲基亞碸（DMSO）和PBS（pH=7.4）緩衝液，配置成10 µM（有機相：PBS水相=2:8，v/v）的溶液，測試其紫外吸收光譜變化情況。圖1表明探針分子在二甲基亞碸（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時其最大紫外吸收波長在320 nm，隨著加入H2S濃度的增加，其紫外吸收光譜明顯發生變化，探針分子產生一個以475 nm為中心的新的寬吸收峰，隨著硫氫根離子濃度的增高，吸收峰逐漸上升，同時在320 nm處的吸收峰的逐漸下降。相應地，溶液的顏色由紅色變為無色，裸眼能夠清楚的看到顏色的明顯變化。
將該分子螢光探針溶於二甲基亞碸（DMSO）中，配置成1 mmol/L的探針溶液；取探針溶液加入相應的二甲基亞碸（DMSO）和PBS（pH=7.4）緩衝液，配置成10 µM（有機相：PBS水相=2:8，v/v）的溶液，測試其螢光發射光譜變化情況，圖4表明，探針分子在二甲基亞碸（DMSO）和水溶液（2:8，v/v）中時基本無螢光，當加入硫氫化鈉後，探針分子有一明顯的螢光發射光譜，最大發射波長在620 nm，接近近紅外區域，非常有利於生物細胞成像分析。同時，該分子螢光探針不受SO32-, NO3-, NO2-, SCN-, CN-, SO42-, HSO4-, HSO3-, S2O32-, S2O82-等陰離子的幹擾，即使在有幹擾離子存在的條件下，探針也對H2S有很好的響應，使得該螢光分子探針在生物化學，環境保護科學等分析檢測領域能用於H2S的檢測，具有潛在的實際應用價值。
儘管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細的介紹，但應當認識到上述的描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容後，對於本發明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發明的保護範圍因由所附的權利要求來限定。