中藥複方藥物組合物的新用途的製作方法

2023-04-24 11:43:51

專利名稱：中藥複方藥物組合物的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥複方藥物組合物的新用途，具體地，是在製備用於輔助生殖的藥物中的用途。
背景技術：
近年來，由於環境汙染嚴重、工作壓力加大、飲食習慣改變、生殖系統疾病等因素對正常受孕造成不利影響，不孕症患者數量呈上升勢頭，發病率約為12. 5% 15%，且有逐年增加趨勢。因此世界衛生組織(WHO)宣布將不孕症與心血管病、腫瘤並列為當今影響人類生活和健康的三大主要疾病。自1978年全球首例試管嬰兒誕生以來，以體外授精-胚胎移植(IVF-ET)為代表的輔助生殖技術(ART)的引入給不孕不育症的成功治療提供了更大的可能。助孕的相關·研究對於解決不孕不育患者的實際問題具有現實的意義。IVF-ET俗稱試管嬰兒，其成功率(指臨床妊娠率)還不太令人滿意，一般為30% 40%[1]，並且容易造成卵巢過度刺激症候群(0HSS)。此外，一些卵巢反應低下或卵子成熟障礙的患者如多囊卵巢症候群(PC0S)、卵巢早衰(P0F)，還有一些不能接受超排卵治療如乳腺癌、卵巢癌術後的患者，仍無法解決生育問題。因而，卵母細胞的體外成熟(IVM)作為IVF-ET的衍生新興技術之一日益受到關注。與傳統的IVF相比，IVM避免了 OHSS的發生。此外，容易獲得的未成熟卵母細胞，還可為卵母細胞捐供提供來源。然而IVM目前仍存在很多亟待解決的問題，包括卵母細胞成熟率低、受精率低等。ICSI (Intracytoplasmic sperm injection)即卵胞眾內單精子注射技術,也就是第二代「試管嬰兒」，該技術是藉助顯微作業系統將單一精子注射入卵子內使其受精。該技術僅需數條精子可以達到受精、妊娠，是嚴重男性因素不育患者的最有效治療方法。補腎中藥介入輔助生殖技術，具有調經、助孕、促卵泡發育及排卵、提高卵細胞質量以及提高卵子受精率、促進早期胚胎發育的作用[2_5]，已得到證實。補腎中藥的上述作用與激素、細胞因子等因素有關[6_9]。目前在輔助生殖技術中與補腎中藥聯繫較為緊密的環節主要是超促排卵和胚胎移植。研究主要以卵細胞質量體外受精及胚胎發育[5，11]、子宮內膜容受性[I15]為切入點。補腎中藥對卵母細胞體外成熟的影響研究尚未見報導。生殖激素是哺乳動物卵母細胞成熟的基本調節物。卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和雌二醇(E2)是常用激素。孕馬血清促性腺激素(PMSG)也能使卵母細胞體外成熟。哺乳動物卵母細胞成熟通常分為核和胞質的成熟核成熟通常以卵母細胞的第一極體排出為代表而胞質成熟則主要指卵母細胞具有受精能力及相應的早期胚胎發育能力。(I) FSH0FSH在早期卵泡體外發育中起到了關鍵作用，在卵母細胞體外成熟中促進核及胞質的成熟，對於卵裂及囊胚的發育有積極作用。人未成熟卵-冠-丘複合物(OCCCs)中的顆粒細胞上可以檢測到FSH受體mRNA的存在。FSH和LH對在不含血清的TCM199中的卵母細胞體外成熟有顯著影響，卵丘細胞的擴張受劑量依賴的FSH和LH的濃度的影響，在體內卵丘細胞的擴張有利於精子穿透、受精和合子發育。FSH以環腺苷酸(cAMP)作為細胞內第二信使，通過影響卵母細胞和卵泡中cAMP的濃度控制未成熟卵母細胞的核成熟和減數分裂的恢復。FSH對哺乳動物卵母細胞核和胞質的成熟均有作用，主要調節卵母細胞核成熟。FSH的最佳作用劑量為100IU/L。(2)E2。研究證實，卵泡液中留體類激素的存在對卵母細胞成熟至關重要。雌激素在多種哺乳動物中能促進卵母細胞的體外成熟。一定濃度的17 P-E2有促進卵細胞胞質成熟的作用，有利於受精和胚胎進一步發育，但濃度過高則會降低受精及卵裂能力。E2可保持卵母細胞減數分裂停滯，從而使細胞核及胞漿成熟同步化，有利於卵母細胞的發育。另外，在卵母細胞內有E2受體，說明E2可以直接與卵母細胞結合，調節卵母細胞胞質成熟。E2的最佳作用劑量為lmg/L或I. 5mg/L。但E2是類固醇激素，一般須要溶於特殊溶劑如二甲基亞碸(DMSO)或乙醇。考慮到DMSO有一定的細胞毒性，卵細胞對乙醇比較敏感，這兩種溶劑的濃度不易控制，加之前期預實驗也證實了這一點，故不採用E2作為陽性對照品。(3)PMSG。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin, PMSG)是取自早期妊娠馬血清中的糖蛋白促性腺激素，是由孕馬子宮內膜杯狀細胞合成分泌到血液中的糖蛋白性激素，兼有卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的作用，類似於人絕經期促性腺激素(HMG)。孕馬血清促性腺激素(PMSG)能使卵母細胞體外成熟。其最佳作用劑量在牛為40和50IU/mL，在狗為100IU/mL。目前還未見PMSG在小鼠卵母細胞體外成熟中的應用報導。(4)目前尚無其它公認的促卵母細胞體外成熟的藥物面世。
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左、右歸丸出自明代溫補名家張景嶽的《景嶽全書 新方八陣》，為補益腎陰、腎陽的經典方，臨床上均可用於治療女性絕經前後諸症。左歸丸治療圍絕經期症候群，可消除烘熱汗出、煩躁易怒、口乾咽燥等症狀，能增加陰道分泌物，改善外陰、陰道乾澀症狀，對雌激素不足的閉經也有較好的療效(朱玲，陳彬彬，黃泉智，等.左歸丸臨床與實驗研究進展[J].國醫論壇，2003，18(2) :51-53。)「左歸丸」治真陰腎水不足，不能滋養營衛，漸至衰弱，或虛熱往來，自汗盜汗，或神不守舍，血不歸原，或虛損傷陰，或遺淋不禁，或氣虛昏運，或眼花耳聾，或口燥舌幹，或腰酸腿軟，凡精髓內虧，津液枯涸等證，俱速宜壯水之主，以培左腎之元陰，而精血自充矣,宜此方主之。「右歸丸」治元陽不足，或先天稟衰，或勞傷過度，以致命門火衰，不能生土，而為脾胃虛寒，飲食少進，或嘔惡膨脹，或番胃噎膈，或怯寒畏冷，或臍腹多痛，或大便不實，瀉痢頻作，或小水自遺，虛淋寒疝，或寒侵溪谷而肢節痺痛，或寒在下焦而水邪浮腫。總之，真陽不足者，必神疲氣怯，或心跳不寧，或四體不收，或眼見邪祟，或陽衰無子等證，俱速宜益火之原，以培右腎之元陽，而神氣自強矣，此方主之。目前，有文獻報導左、右歸丸用於治療不孕症，如楊麗影，右歸丸在婦科疾病中的應用體會，《河北中醫》，2001年23卷8期，張君滿，左歸丸加減在婦科疾病中的應用，《四川中醫》，2007年25卷5期；韋豔萍，等，左歸丸治療黃體功能不健不孕症的臨床研究，《現代中西醫結合雜誌》，2010年19卷32期，方雲芸，等，右歸丸對雄激素致排卵障礙型不孕大鼠血清E2、T和IGF-I的水平影響，《環球中醫藥》，2010年3卷3期等。但是將左右歸丸用於輔助生殖，如卵母細胞的體外成熟(IVM)技術方面，目前尚無相關文獻報導。

發明內容
本發明的技術方案是提供了一種中藥複方藥物組合物的新用途。具體地，是在製備用於輔助生殖的藥物中的用途。本發明提供了含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途熟地18-30份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8_16份、鹿角膠8_16份。本發明還提供了含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途川牛膝1-16份、龜板膠1-16份。進一步優選地，所述的原料藥的重量配比為川牛膝9份、龜板膠12份。本發明還提供了含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途杜仲1-16份、肉桂1-9份、當歸1-16份、制附子1-16份。 進一步優選地，所述的原料藥的重量配比為杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。其中，所述的藥物是促卵母細胞體外成熟的藥物。其中，所述的藥物是治療不孕症的藥物。·其中，所述的藥物是提高精子活力或精子受精能力的藥物。其中，所述藥物是由下述重量配比的原料藥製備而成的藥劑熟地24份、山茱萸9-12份、山藥12份、枸杞子9_12份、菟絲子12份、鹿角膠12份。其中，所述的原料藥中還含有川牛膝9份、龜板膠12份。進一步優選地，所述的藥物是由下述重量配比的原料藥製備而成熟地24份、山茱萸12份、山藥12份、枸杞子12份、菟絲子12份、鹿角膠12份、川牛膝9份、龜板膠12份。其中，所述的原料藥中還含有杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。進一步優選地，所述的藥物是由下述重量配比的原料藥製備而成熟地24份、山茱萸9份、山藥12份、枸杞子9份、菟絲子12份、鹿角膠12份、杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。本發明還提供了一種促卵母細胞體外成熟的方法，它包括如下步驟a、取未成熟卵母細胞；b、置於含藥血清的M199培養液中培養24h，即得成熟卵母細胞；其中血清中含有2%的權利要求1-13任意一項所述的藥物。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術中獲得適當多數目、高質量的卵子是達到妊娠的關鍵環節之一，通常需要採用控制性超排卵(COH)來實現。但是，COH始終存在不可忽視的安全性問題，容易造成卵巢過度刺激症候群(0HSS)。一些卵巢反應不良、卵子成熟障礙或不能接受COH的患者仍無法解決生育問題，可通過IVF-ET的衍生新興技術之一一卵母細胞的體外成熟(IVM)技術獲得妊娠。本發明是將補腎中藥複方左右歸丸及其拆方組份用於促進卵母細胞體外成熟，具有重要意義，可以從一個側面反應中醫調經種子理論在輔助生殖技術中的指導價值，進而為試管嬰兒領域開拓新思路、新途徑，用於配合卵母細胞IVM技術治療不孕症，有助於拓展ART的應用空間。本發明藥物體外可以促進未成熟卵母細胞生長發育，主要是促進卵母細胞核成熟，並且不增加成熟卵母細胞細胞骨架的異常機率。本發明藥物對精子穿卵能力產生影響，為臨床應用防治男性精子功能障礙，提高IVF成功率，減少ICSI的使用率，提供可靠的實驗室依據。


圖I :含藥鼠血清對體外成熟卵母細胞Cyclin BI mRNA表達的影響圖2 :圖2A體內受精百分率；圖2B體外培養3天後囊胚生成百分率圖3:體外受精百分率圖4 :圖4A兩組完整頂體百分率圖4B頂體酶活性檢測
具體實施例方式實施例I本發明藥物組合物I的製備(左歸丸)稱取原料熟地黃200g、菟絲子100g、牛膝75g、龜板膠100g、鹿角膠100g、山藥100g、山茱萸100g、枸杞子IOOg ；製備方法以上八味，除鹿角膠、龜板膠外，其餘熟地黃等六味粉碎成細粉，過篩混勻。取鹿角膠、龜板膠烊化，與上述細粉混勻。每IOOg粉末加煉蜜IOg與適量的水，泛丸，·乾燥，即得；或不加蜜，僅為粉末散劑。實施例2本發明藥物組合物2的製備(右歸丸)稱取原料熟地黃24g、山藥12g、山茱萸9g、枸杞子9g、菟絲子12g、鹿角膠12g、杜仲12g、肉桂6g、當歸9g、制附子6g。製備方法將熟地蒸爛杵膏，餘為細末，烘乾密封保存，兌水服用，或加煉蜜為丸，如彈子大。每嚼服二三丸(6 9g)，以滾白湯送下。實施例3本發明藥物的製備稱取原料熟地24g、山茱萸12g、山藥12g、枸杞子12g、菟絲子12g、鹿角膠12g ；製備方法以上六味，除鹿角膠外，其餘熟地黃等六味粉碎成細粉，過篩混勻。取鹿角膠烊化，與上述細粉混勻，烘乾密封保存，兌水服用，或每IOOg粉末加煉蜜IOg與適量的水。實施例4本發明藥物的製備稱取原料熟地24g、山茱萸9g、山藥12g、枸杞子9g、菟絲子12g、鹿角膠12g ；按實施例3方法製備。實施例5本發明藥物的製備稱取原料熟地18g、山茱萸9g、山藥8g、枸杞子9g、英絲子8g、鹿角膠8g ;按實施例3方法製備。實施例6本發明藥物的製備熟地30g、山茱萸12g、山藥16g、枸杞子12g、英絲子16g、鹿角膠16g,按實施例3
的方法製備。實施例7本發明藥物的製備取川牛膝9g、龜板膠12g，按實施例I的方法製備。實施例8本發明藥物製備取杜仲12g、肉桂6g、當歸9g、制附子6g，按實施例3的方法製備。上述原料可以用原生藥,也可以用原生藥的炮製品。以下是通過藥效實驗及臨床實驗證明本發明的有益效果。試驗例I本發明藥物促卵母細胞體外成熟實驗I、材料與方法
I. I實驗材料I. I. I實驗動物清潔級ICR雌性小白鼠，6 8周齡，體重22 26g，90隻，清潔級ICR雄性小白鼠，8 10周齡，體重30 35g，6隻，分批次購自四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所，許可證號SCXK(川)2006-18。二級實驗室，室溫為22 250C，溼度為45 65%，照明晝夜明暗交替時間為12 :12，分籠餵養。I. I. 2實驗藥物高效液相色譜(HPLC)監測製備含左右歸丸及其拆方組份的鼠血清1#、2#、3# (其中1#組為實施例3、2#組為實施例7、3#組為實施例8)。陽性對照品r-hFSH:75IU, Laboratoires Serono S. A. , Y11A9874·主要試劑孕馬血清促性腺激素(PMSG)寧波市三生藥業有限公司獸藥字(2007)110044564 ；M199GIBC0 Lot: no. 507765 ;牛血清白蛋白(BSA) Sigma2039B054、透明質酸酶Sigma H3506、無水乙醇、三氯甲燒、異丙醇、瓊脂糖、Tris-醋酸(Tris-acetate, TAE)、GoldView、焦憐酸二乙酯(diethyl pyrophosphate, DEPC)處理水等。含藥鼠血清的製備分別取實施例I和實施例2製備的左歸丸、右歸丸原料藥，按標準方法加水煎煮，於4°C貯存。將製備的湯劑餵服小鼠14天，取血；血清通過HPLC檢測含有左歸丸或右歸丸的活性成分。含藥血清貯存於_80°C備用。I. I. 3主要儀器設備與耗材AIR-TECH 超淨工作檯、MiIIipore 純水儀、HERAEUS BB5060 培養箱、Olymbus SZX9體視顯微鏡、TOKAI HIT體視鏡用玻璃恆溫板、Olymbus CK40倒置顯微鏡、Olymbus BX51反射螢光顯微鏡等。I. 2實驗方法I. 2. I小鼠未成熟卵母細胞的採集小鼠處死前46 48h腹腔注射IOIU PMSG / 0. ImL /只，頸椎脫臼處死後，置於清潔託盤中，75%乙醇棉球擦拭消毒腹部，打開腹腔，取出卵巢，去除脂肪、輸卵管組織等附著物後放入盛有操作液的培養皿中，立即送至超淨工作檯。在解剖顯微鏡下，用Iml注射器針頭剔除卵巢周圍的脂肪結締組織，用操作液洗滌卵巢3次。用Iml注射器針頭刺破卵巢表面的卵泡，輕輕擠壓使丘細胞一卵母細胞複合體(COCs)溢出，並用吸卵管吸取。最後移入覆蓋石蠟油經預平衡後的微滴培養液中，準備體外成熟培養(IVM)。I. 2. 2實驗分組及觀測指標245個未成熟COCs體外成熟培養，分為空白組(在M199培養液中未添加鼠血清)、空白鼠血清組(在M199培養液中添加了 2%空白鼠血清)、含藥鼠血清1#、2#、3# (在M199培養液中分別添加了 2%含本發明藥物鼠血清1#、2#、3#)，共五組，體視顯微鏡和倒置顯微鏡下計數觀察本發明藥物對小鼠卵母細胞體外成熟的影響。約238個未成熟COCs體外成熟培養，分為空白組、FSH組(在M199培養液中添加了100IU/L FSH)、空白鼠血清組、含藥鼠血清1#組四組，實驗分四批進行，第一批，顯微鏡計數觀察本發明藥物對小鼠卵母細胞體外成熟、受精及卵裂的影響，重複3次實驗。第二批，免疫螢光標記法結合螢光檢測儀觀察並定量分析本發明藥物對體外培養小鼠卵母細胞MPF調節亞基Cyclin BI表達的影響。第三批，免疫螢光標記法結合反射螢光顯微鏡觀察本發明藥物對體外培養小鼠卵母細胞細胞骨架(紡錘體、染色體)的影響。第四批，半定量RT-PCR法觀察本發明藥物對體外培養小鼠卵母細胞MPF調節亞基Cyclin BI mRNA的表達的影響。上述未成熟卵母細胞即為初級卵母細胞。I. 2. 3卵母細胞成熟率的測定將礦物液滴入培養液上，各組丘細胞一卵母細胞複合體(COCs)於37°C、5%C02下微滴法培養24h後，用100IU / ml透明質酸酶溶液處理5min，用口徑略大於卵母細胞直徑的吹卵管反覆吹打卵丘細胞-卵母細胞複合體(cumulus oocyte complexes, COCs) Imin去除顆粒細胞，使之成為裸卵(denuded oocyte, DO)。顯微鏡下觀察卵母細胞形態，以生發泡破裂(GVBD)作為減數分裂啟動的標誌，第一極體排出(PBl)作為第一次減數分裂完成的標誌即卵母細胞核成熟標誌。分別計算GVBD發生率、PBl排出率和GVBD+PB1發生率。GVBD發生率=GVBD個數/卵母細胞總數·PBl排出率=PBl個數/卵母細胞總數GVBD+PB1發生率=GVBD+PB1個數/卵母細胞總數所述的成熟卵母細胞即為次級卵母細胞。L 2. 4小鼠精子的採集及處理ICR雄性小白鼠，周齡8 10周，體重30 35g，頸椎脫臼法處死，取附睪置於培養液中，用眼科剪剪開或注射針針頭刺破附睪並輕輕擠壓使精子釋出，將精子連同培養液一起轉移至培養板內，置37°C、5%C02培養箱內培養I 2h。將培養獲能後的精子計數並調整濃度至I X IO6個/ mL 5 X IO6個/ mL。按精卵比約為10000:1的比例將精子加入含有卵母細胞的培養液中繼續孵育5 6h。顯微鏡下觀察卵母細胞的形態，以出現2個原核(2PN)和第二極體為正常受精標誌，計算受精率。24h後觀察受精卵卵裂及早期胚胎發育情況。受精率=受精卵個數/PBI個數卵裂率=卵裂球個數/受精卵個數I. 2. 5免疫突光標記法免疫染色前將卵母細胞在0. 3%B-PBS液中洗滌3次，每次5min，4%多聚甲醛37°C固定Ih ;固定好的卵母細胞在0. 3%B-PBS液中洗滌3次，0. 5%Triton-10037°C下作用15min後，0. 3%B-PBS液洗滌3次，P/oB-PBS液封閉Ih ;再在0. 3%B-PBS液洗滌3次，在清洗間隙即可用0. 3%B-PBS稀釋一抗(I: 100)，並做成液滴，清洗好卵母細胞之後，將其置於加入一抗的PBS液滴中，放入暗溼盒，然後4°C孵育過夜；第二天用0. 3%B-PBS液滴清洗卵母細胞3次，每次5min，同樣在清洗間隙用0. 3%B-PBS稀釋二抗(FITC-山羊抗兔IgG) (1:100)，並做滴，然後將卵母細胞置於加入二抗的PBS液滴中，放入暗溼盒，37°C下孵育lh。二抗染色完成後，若要觀察染色體則用含0. 3%B-PBS清洗3次，用PI復染。用0. 3%B-PBS液洗滌3次，將卵母細胞在體視鏡下吸出，滴在載玻片上，吸去多餘液體，再用甘油與PBS(9:1)及含抗螢光淬滅劑的混合液封片，反射螢光顯微鏡下觀察卵母細胞的螢光著色情況。上述所有的清洗環節、抗體孵育和染色步驟均是在液滴中完成的，液滴做在培養皿中。
I. 2. 6螢光定量分析MPF調節蛋白B的表達強度免疫螢光染色步驟同I. 2. 5，二抗染色完成後，用PBS液洗滌3次，將卵母細胞在體視鏡下吸出，移至每孔預先滴有500 u I PBS液的24孔板內，每組6孔，每孔8個卵母細胞，螢光定量檢測儀分析MPF調節蛋白BI的表達強度。I. 2. 7卵母細胞細胞骨架的觀察方法應用免疫螢光標記法，在OLYMPUS BX51反射螢光顯微鏡下進行觀察。卵母細胞紡錘體分型正常紡錘體紡錘體呈對稱的桶型，且極性存在；異常紡錘體紡錘體極性消失、縱軸上微管減少或斷裂、紡錘體消失、微管消散。卵母細胞染色體分型正常染色體染色體緊密排列在赤道板；異常染色體染色體結構鬆散或凝結成團，從赤道板中脫落。I. 2. 8RT-PCR檢測卵母細胞MPF調節亞基Cyclin BI mRNA的表達·(I)卵母細胞總RNA的提取未成熟卵母細胞200個，分為含藥鼠血清1#組和空白鼠血清組，每組100個，體外培養24h後，分別從對照組和含藥鼠血清1#組取出卵母細胞，透明質酸酶去除卵丘細胞後，PBS洗兩次，採用Trizol法提取總RNA。(2)引物JhIiCyclin BI的特異片段為417bp，其引物序列參照文獻以Primer5. 0軟體設計，其序列為5， -GTAATCCTTGCAGTGAGTGACG(525-546)；5』 -CATCTCCATCTGTCTGATCTGG(920-941)。以廣泛存在於細胞中的甘油醒-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogease, GAPDH)作為內參照，其特異片段為321bp。(3)反應體系DEPC H2Ol. 75 u I, Bufferl. 25 u I, dNTPl. 25 u l,MgCl22. 5u I, AMV逆轉錄酶0. 25 u IjRAN酶抑制劑0. 25111，了&9酶0. 25 yl，正向及反向引物各0. 5 yl，RNA樣品 1，總體積 12. I。反應條件50°C 30min,94°C 2min,隨後 94 °C 10s, 55 °C 10s,70°C 20s 重複 20 個循環，72°C 5min,擴增 GAPDH片段。50°C 30min, 90°C 2min,隨後 94°C 30s,56°C 30s, 68°C Imin 重複 40 個循環，72°C lOmin，擴增 Cyclin BI 片段。4°C保存。(4)結果檢測PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳後，紫外圖象掃描儀掃描並採用KODAK ID圖像分析軟體分析電泳帶的平均灰度並照相。結果以特異泳帶與GAPDH泳帶平均灰度的比值表示。I. 2. 9 血清 FSH、E2 的測定採用酶聯免疫法測定大鼠血清FSH、E2水平。嚴格按照酶聯免疫試劑盒說明操作，於酶標儀450nm吸光度,讀取吸光度值(optical denstiy, 0D),根據標準品的濃度和OD值做出標準曲線，計算得出樣品中FSH、E2的濃度。I. 3統計學處理以下所有實驗數據均採用SPSS17. 0統計軟體處理，均數比較採用t檢驗，率的比較採用卡方檢驗，P < 0. 05為差異有統計學意義。2、結果2. I不同含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響表I不同含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響卵母
U1(驗H.m iiti PB! PB1% GVBD GVBD% GVBD+PB1 (GVBD+PBli%
_S_
空白組48816.672450.003266.67
空 Ii 鼠血淸組481122.922450.003572.92
本發明含藥血Ifi I 組522242.3K2242.314484.62*
本發明含藥血清 2 組471736.17*2144.683880.85
本發明含藥血清 3 組501326.002652.0039_78.00_注與空白組比，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ;與空白鼠血清組比，☆ P < 0. 05結果顯示，空白鼠血清、含藥鼠血清1#、2#、3#組均較空白組成熟率高；含藥鼠血清1#、2#、3#組均較空白鼠血清組成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、含藥鼠血清1#、2#、3#
組均較空白組高。2. 2含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響(重複3次實驗)結果見表2。表2含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響

受 m
試驗組卵母細胞數 PBl PBi% GVBD GVBD% GVBD+PB1 (GVBD+PB1)% 灶 __Th 裂
空內組58 813.792746.5535 60.34I0
空 ft 鼠 LflL清組60 1423.333151.6745 75.004I
FSH 組69 2028.99*3449.2854 78.26*II
本發明含藥血清 I 組59_2440.68*^2542.3749_83.05**9I注與空白組比，*P < 0. 05, **P < 0.01 ;與空白鼠血清組比，< 0. 05結果顯示，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組成熟率高。FSH、含藥鼠血清1#組均較空白鼠血清組成熟率高，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組高。2. 3含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響，結果見表3。表3含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響

受
空白組 _母細胞數 Pm PB1% CVBD GVBD% GVBD+PB1 (GVBD+PB1)% _ _裂
_Jg_
~ ft 闡
,' ^58 11 18.97 27 46.553865.22 2 0
血_組
FSH 組56 12 21.43 27 48.213969.64 4 I
本發明
含藥血5620 35.71* 26 46.434682.14* 6 I
清丨組
空白組_62 24 38.71*1^ 28 45.16_52_83.87* 9 3注與空白組比，*P < 0. 05 ;與空白鼠血清組比，< 0. 05結果顯示，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組成熟率高。FSH、含藥鼠血清1#組均較空白鼠血清組成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組聞。2. 4含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響，結果見表4。表4含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響3-1

權利要求
1.含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途 熟地18-30份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8_16份、鹿角膠8-16 份。
2.含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途川牛膝1-16份、龜板膠1-16份。
3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於所述的原料藥的重量配比為川牛膝9份、龜板膠12份。
4.含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途杜仲1-16份、肉桂1-9份、當歸1-16份、制附子1-16份。
5.根據權利要求4所述的用途，其特徵在於所述的原料藥的重量配比為杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。
6.根據權利要求1-5任意一項所述的用途，其特徵在於所述的藥物是促卵母細胞體外成熟的藥物。
7.根據權利要求1-5任意一項所述的用途，其特徵在於所述的藥物是治療不孕症的藥物。
8.根據權利要求1-5任意一項所述的用途，其特徵在於所述的藥物是提高精子活力或精子受精能力的藥物。
9.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於所述藥物是由下述重量配比的原料藥製備而成的藥劑 熟地24份、山茱萸9-12份、山藥12份、枸杞子9-12份、菟絲子12份、鹿角膠12份。
10.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於所述的原料藥中還含有川牛膝9份、龜板膠12份。
11.根據權利要求10所述的用途，其特徵在於所述的藥物是由下述重量配比的原料藥製備而成 熟地24份、山茱萸12份、山藥12份、枸杞子12份、菟絲子12份、鹿角膠12份、川牛膝9份、龜板膠12份。
12.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於所述的原料藥中還含有杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。
13.根據權利要求12所述的用途，其特徵在於所述的藥物是由下述重量配比的原料藥製備而成 熟地24份、山茱萸9份、山藥12份、枸杞子9份、菟絲子12份、鹿角膠12份、杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。
14.一種促卵母細胞體外成熟的方法，它包括如下步驟 a、取未成熟卵母細胞； b、置於含藥血清的M199培養液中培養24h，即得成熟卵母細胞；其中血清中含有2%的權利要求1_13任意一項所述的藥物。
全文摘要
本發明提供了含有下述重量配比的原料藥在製備用於輔助生殖的藥物中的用途熟地18-30份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8-16份、鹿角膠8-16份。本發明還提供了一種促卵母細胞體外成熟的方法，它包括如下步驟a、取未成熟卵母細胞；b、置於M199培養液中，採用微滴法培養24h，即得成熟卵母細胞；其中培養液中含有2%的藥物。本發明藥物體外可以促進未成熟卵母細胞生長發育，主要是促進卵母細胞核成熟，並且不增加成熟卵母細胞的細胞骨架異常的機率。本發明藥物還可以對精子穿卵能力產生影響，為臨床防治男性精子功能障礙，提高IVF成功率，減少ICSI的使用率，提供可靠的依據。
文檔編號C12N5/075GK102784267SQ20121029219
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月16日 優先權日2011年8月23日
發明者劉志斌, 陸華, 高小平 申請人:成都中醫藥大學