一種基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法
2023-05-23 03:32:21
一種基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法
【專利摘要】本發明屬於分子生物學【技術領域】，公開了一種利用DNAzyme探針來進行定性和定量檢測B肝病毒DNA的方法。本發明針對現有技術的局限性，以PCR擴增為基礎檢測平臺，通過引入3』-氨基修飾的DNAzyme探針，實現了B肝病毒的一步法定性及定量檢測。該技術具有靈敏度高，特異性強，檢測線性範圍廣，成本低廉，準確度高，方便操作等優點，為B肝病毒提供了簡單快速、準確高效、經濟實用的檢測方法。
【專利說明】—種基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種基於DNAzyme探針的B肝病毒DNA定性及定量檢測的方法。
【背景技術】
[0002]目前應用最為廣泛的B肝病毒DNA檢測方法是實時螢光定量PCR方法，螢光定量PCR有很多優勢，包括靈敏度高、特異性強，但是該技術需要依賴昂貴的螢光定量PCR儀和螢光探針，檢測成本遠遠高於普通PCR，不利於大範圍推廣。因此，開發一種簡單快速、準確高效、經濟實用的B肝病毒檢測方法具有重要的社會意義和科研價值。
[0003]脫氧核酶(DNAzyme)是通過體外篩選技術獲得的具有催化功能的單鏈DNA序列，迄今通過體外篩選已經獲得多種具有不同催化功能的脫氧核酶，包括能夠催化RNA剪切和連結、DNA的剪切和連接、DNA的磷酸化、卟啉的金屬化、碳-碳鍵形成以及氧化等反應。DNAzyme除了具有多功能性，相對於蛋白酶和核酶，還具有合成簡單、成本低、易保存、穩定性高等優勢。目前，DNAzyme已在生物分析、醫學診斷、納米技術以及基因治療等領域受到了廣泛關注並取得一系列先進的研究成果。因此，基於DNAzyme的獨特優勢進行B肝病毒檢測方法的開發將有望突破現有技術的一些障礙，為B肝病毒的檢測提供更為經濟實用的方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在 於提供一種簡單快速、準確高效、經濟實用的定性和定量檢測B肝病毒的方法。
[0005]本發明具體涉及一種在PCR檢測平臺上利用DNAzyme探針對B型肝炎病毒進行檢測的方法。方法以B肝病毒的基因保守區域為待檢測的目標核酸序列進行PCR引物及特異性DNAzyme探針的設計。本發明所涉及的DNAzyme探針為一髮夾探針，在常溫條件、未檢測到B肝病毒時呈封閉的髮夾狀態，不顯示DNAzyme活性，從而無檢測信號產生；當用正反向引物對B肝病毒S區保守序列即目標核酸序列進行擴增時，DNAzyme探針在PCR循環過程中可與目標核酸序列互補，並在引物延伸過程中由於核酸聚合酶5』 -3』外切酶活性而被部分消化從而釋放出DNAzyme探針中的活性DNAzyme序列。此時,被釋放的活性DNAzyme序列便能發揮其活性產生多種可讀的檢測信號，如肉眼可見的顏色信號及可準確定量的光吸收信號、螢光信號等，從而報告檢測結果。
[0006]本發明以B肝病毒S區的基因保守區域設計了相應的引物和特異性DNAzyme探針的設計:(I)正向引物 HBV-F: 5，-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3 』 ；( 2 )反向引物 HBV-R: 5 』 -GGACAAACGGGCAACATACCTT-3』 ；(3)特異性的 DNAzyme 探針:5』 -CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2-3，。
[0007]本發明具體包括兩個操作步驟:(1)PCR擴增目標核酸並釋放活性DNAzyme序列；
(2)比色/螢光報告檢測結果。[0008]與已有的相關檢測技術相比，本發明所涉及的DNAzyme探針的3』 -端進行了氨基修飾，使得目標核酸的檢測可以一步完成，無需在PCR過程中再開蓋加探針和補加引物便能獲得非常好的檢測信號，不僅使得操作過程更為簡單，更重要的是避免了 PCR過程中開蓋將引起的交叉汙染。此外，本發明在PCR反應中採用了 UNG體系，避免擴增產物的汙染，使得檢測結果更為真實可靠，也降低了對操作環境的要求。
[0009]本發明所涉及的DNAzyme是一種能夠產生信號的、具有催化功能的DNA序列。目前所發現的DNAzyme分為5大類:切割DNA的DNAzyme、切割RNA的DNAzyme、與卟啉鐵等結合具有過氧化物酶活性的DNAzyme、具有連接酶功能的DNAzyme、具有激酶活力的DNAzyme。
[0010]本發明所涉及的DNAzyme是與卟啉鐵等結合具有過氧化物酶活性的DNAzyme時，當DNAzyme釋放後，(I)通過加入hemin、顯色底物(ABTS、DAB等)、H202，在室溫下顯色，直接用肉眼觀察顏色變化或用分光光度計測得一定波長下的吸光值來檢測信號，從而判斷目標核酸序列是否存在。當顯色底物為ABTS時，存在目標核酸序列的樣品顯綠色，當顯色底物為DAB時，存在目標核酸序列的樣品顯棕紅色，不存在目標核酸序列的樣品都為無色；(2)向體系中加入hemin、鹽酸酪胺(Tyramine.HCl)>H2O2,以320nm為激發光激發反應產物，即可在410nm處觀察到檢測結果，從而實現對樣本的準確定量檢測。
[0011]本發明所涉及的DNAzyme為可與鋅原卟啉、結晶紫或孔雀石綠等螢光底物結合的DNAzyme時，當DNAzyme釋放後，可與體系中的螢光底物結合，通過DNAzyme與螢光底物結合與否的螢光強度變化可實現樣本的定量檢測。
[0012]本發明所申請保護的技術雖是針對B肝病毒檢測的，但也適用於其他核酸樣本的檢測。
[0013]本發明所涉及的核酸聚合酶是一種具有5』 -3』外切酶活性的耐熱性聚合酶。
[0014]本發明對待測核酸樣品的長度沒有限制，但對PCR反應中擴增的特異性序列長度有一定的限制，擴增片段不宜過長，通常為200個鹼基以內。
[0015]如本文所用，下列詞語/術語具有下列含義，除非另外說明。
[0016]「DNAzyme」:脫氧核酶(deoxyribozyme, Catalytic DNA)是人工合成的、利用體外分子進化技術篩選的一種具有催化功能的單鏈DNA片段，具有高效的催化活性和結構識別能力。據催化功能的不同，可以將脫氧核酶分為5大類:切割RNA的脫氧核酶、切割DNA的脫氧核酶、具有激酶活力的脫氧核酶、具有連接酶功能的脫氧核酶、催化卟啉環金屬螯合反應的脫氧核酶。
[0017]「UNG體系」:在PCR體系中，為了防止擴增產物的汙染，以dUTP代替dTTP進行PCR，使PCR產物都是含有dU的DNA鏈。當在這種「dU」取代「dT」PCR體系中加入尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)，在PCR擴增前一定溫度下保溫5-10min，UNG酶即可將反應體系中已有的U-DNA汙染物中的尿嘧啶鹼基降解。在隨後熱變性的過程中DNA鏈斷裂，從而消除可能汙染到的上一輪的擴增產物，以保證擴增結果的特異性、準確性。同時，熱變性還使UNG酶失活，無法再對新的擴增產物進行降解。這樣的PCR體系即為「UNG體系。
[0018]「Hemin」:血紅素，Spn 卜啉鐵。
[0019]「ABTS」:2，2，-Azinobis- (3~ethyIbenzthiazoIine-6-sulphonate)，2，2_ 聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)。
[0020] 「DAB」:Diaminobenzidine, 二氨基聯苯胺。[0021]本發明具有明顯優於現有技術的優點，其主要優點包括:
[0022]1.簡便性。本發明通過對DNAzyme探針進行改進，使得整個檢測反應可以一步完成，大大降低了操作複雜性。
[0023]2.準確性。本發明的一步法操作及UNG體系，最大程度避免了樣品間的交叉汙染和來自擴增產物的汙染，使得檢測結果更為準確，可信度更高。
[0024]3.快速性。本發明用於檢測很快速，3-4小時即可得到檢測結果。
[0025]4.通用性。本發明所涉及的PCR檢測方法，適用於各種基因型的B肝病毒樣本的檢測,也可用於檢測其它核酸樣本.[0026]5.實用性。現有的實時螢光PCR技術通常對檢測設備和檢測條件具有較高的要求，從而使檢測具有一定的局限性，而本發明檢測方法僅需要普通PCR儀。再加上本發明是基於DNAzyme而開發的技術，能夠進行比色檢測，肉眼即可觀察到檢測結果。因此，方法本身對檢測條件要求低，實用性強，使得B肝病毒檢測變得更加簡單、實用、經濟、方便。
[0027]6.經濟性。現有的實時螢光PCR技術，試劑和探針的合成費用都較高，而本發明中所涉及的DNAzyme探針序列和標記物都由普通的核苷酸組成，合成方便，試劑較為廉價，因此,大大降低了檢測成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為B肝病毒血清樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中泳道1、2、3分別為陰性B肝血清樣本、受試B肝血清樣本以及B肝陽性對照的PCR擴增產物，擴增片段大小為116bp ;泳道M為DL-2000分子量Marker，片段從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。
[0029]圖2是B肝病毒血清樣本的比色檢測結果，其中:1為陰性對照，陰性B肝血清標本；2為陽性B肝血清標本；3為陽性對照，含S區基因質粒。
[0030]圖3是對IO1-1O7B肝病毒DNA拷貝數的標準品進行PCR擴增後l_13min顯色反應的動力學檢測曲線圖。其中，橫坐標代表顯色反應檢測時間，縱坐標代表414nm處的吸收光強度。
[0031]圖4是從圖3中選取第4min時IO1-1O8拷貝8個梯度的吸收值繪製的B肝血清標準曲線。其中，橫坐標代表B肝血清樣本中B肝病毒DNA拷貝數，縱坐標代表414nm處的吸收光強度。
[0032]圖5為使用本發明所述方法測定的B肝血清樣本中B肝病毒DNA的拷貝數(Ig值)與Taqman方法測定的B肝血清樣本中B肝病毒DNA的拷貝數(Ig值)的折線圖。橫坐標代表B肝血清樣本編號，縱坐標代表測定的B肝血清臨床樣本中B肝病毒DNA的拷貝數(Ig值)。「?」表示本發明所述檢測方法測得的樣本值。「□」表示Taqman方法測得的樣本值。
[0033]圖6為該顯色方法測定B肝血清樣本與Taqman方法測定B肝血清樣本測定值的相關曲線。橫坐標代表該顯色方法測定的B肝血清樣本的拷貝數(Ig值)，縱坐標代表Taqman方法測定的B肝血清樣本的拷貝數(Ig值)。
【具體實施方式】
[0034]下面結合附圖，通過實例進一步說明本發明。本領域的技術人員應理解，這些實例僅用於說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。
[0035]實施例1、B肝血清標本的定性檢測
[0036] 1.PCR 反應
[0037]
【權利要求】
1.一種基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:在PCR體系中加入檢測B型肝炎病毒基因保守區域的特異性引物和DNAzyme探針對B肝病毒基因保守區域進行擴增，擴增過程中利用核酸聚合酶5』 -3』外切酶活性對DNAzyme探針進行部分消化使其產生大量活性DNAzyme序列，最終通過檢測由活性DNAzyme序列產生的比色或螢光信號實現對B肝病毒感染樣本的定性和定量檢測；該方法還適用於其他核酸樣本的檢測。
2.根據權利要求1所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:所述DNAzyme探針為一髮夾探針，在常溫下或未檢測到B肝病毒基因序列時，通過探針的DNA鹼基互補作用，活性DNAzyme序列被封閉在髮夾中，不產生檢測信號；而在PCR過程中檢測到B肝病毒基因序列時，DNAzyme探針打開並與目標核酸序列互補，引物延伸時核酸聚合酶利用其5』 -3』外切酶活性部分消化與目標核酸序列互補的DNAzyme探針並產生大量活性DNAzyme序列，從而獲得可檢測的顏色或螢光信號。
3.根據權利要求1所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:所述DNAzyme探針為經3』 -端氨基修飾的探針。
4.根據權利要求1、3所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:一步反應即可完成樣本 檢測，大大降低了操作複雜性，提高了方法的可靠性和實用性。
5.根據權利要求1所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:當待擴增的目標核酸序列為B肝病毒S區的基因保守區域時，其特異性的正反向引物可以是(I)正向引物 HBV-F: 5，-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3 』 ；( 2 )反向引物 HBV-R: 5，-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3』。
6.根據權利要求1、3所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:當待擴增的目標核酸序列為B肝病毒S區的基因保守區域時，其特異性的DNAzyme探針可以是5，-CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2-3，。
7.根據權利要求1所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是引入了UNG防汙染體系，進一步提高了方法的可靠性和實用性。
8.根據權利要求1所述的基於DNAzyme探針的B肝病毒檢測方法，其特徵是:當活性DNAzyme為與hemin結合可以發揮具有過氧化物酶活性的DNAzyme時,可在B肝病毒樣本的擴增產物中加入hemin以及如ABTS這樣的顯色底物和H2O2,利用DNAzyme/hemin複合物催化H2O2氧化顯色底物發生顏色變化，通過觀察顏色差異對B肝病毒進行定性檢測，也可通過測定溶液在414nm處的光吸收值進行定量檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK103952497SQ201410161277
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】楊麗, 唐卓 申請人:中國科學院成都生物研究所