牛膝粗多糖、多糖組分和均一多糖、其製備方法及其用途與流程

2023-05-12 03:30:11 7

本發明屬於醫藥
技術領域：
，具體地，涉及疫苗和免疫領域。具體地，本發明涉及從牛膝中提取的粗多糖、多糖組分以及均一多糖。本發明還涉及含有它們的藥物組合物、其製備方法、以及其用於疫苗佐劑、免疫調節劑或製備疫苗輔料、疫苗製劑、疫苗組合物或抗體的用途。
背景技術：
：牛膝(achranthisbidentata和cyathulaofficinalis)是莧科植物牛膝的乾燥根，具有活血、通經、補肝腎、強筋骨之功用。牛膝含有多種次生代謝產物，如齊墩果酸及其皂苷、蒽醌類化合物等，還含有較高含量的多糖[李金亭,等.牛膝類藥材的生物學與化學成分的研究進展.中草藥，2006，37(6):952-956]。近年來與本發明領域相關的研究和報導歸納如下：(1)牛膝多糖製備方法及化學成分的研究許海丹等將牛膝粉末用80％乙醇加熱回流，殘渣加水煎煮提取,合併濾液、濃縮。濃縮液中加入乙醇至含醇量達到80％。靜置12h後分離沉澱，再水溶解，採用sevage方法去除蛋白。收集清液，再加入4倍乙醇醇析，沉澱部分用乙醚、丙酮反覆洗滌，乾燥，製備牛膝粗多糖。(許海丹，等.牛膝多糖的提取與含量測定.科學技術與工程，2009，9(1)：107-109.)劉傳敏等首先將纖維素酶和牛膝粉末一起加水在恆溫搖床上保持一段時間，然後沸水浴煎煮10min，再超聲20min，離心，上清合併、濃縮，然後加乙醇至含醇量為80％。靜置、離心，沉澱加蒸餾水溶解， 三氯乙酸脫蛋白，上清液揮幹溶劑，即得牛膝多糖粗品(劉傳敏，等.酶解超聲法提取川牛膝多糖的正交試驗研究.中獸醫醫藥雜誌，2009，5：51-53)。魏濤等採用以下工藝製備牛膝粗多糖：懷牛膝→70℃乾燥→粉碎過40目篩→石油醚脫脂，體積分數80％乙醇回流→超聲波輔助水浸提→離心取上清液→sevage法除蛋白→濃縮→乙醇沉澱→過濾洗滌→低溫乾燥→懷牛膝粗多糖(魏濤，等.懷牛膝多糖的超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性活性.食品與發酵工業，2011，37(2)：191-194)。方積年等將牛膝水煎煮、去除游離蛋白、透析、乙醇醇沉、再水溶解後，依次進行cellexd和sephadexg-150柱層析，得到一個肽多糖abab，abab分子量為2.3×104，有d-葡萄糖酸、d-半乳糖、d-半乳糖酸、l-阿拉伯糖和l-鼠李糖組成，摩爾比為12:2:3:1:1。多糖主鏈結構為(1→4)-d-葡萄糖酸和(1→4)-d-半乳糖酸組成。肽含量為24.7％，主要有甘氨酸、穀氨酸、門冬氨酸和絲氨酸組成(方積年，張志花，劉柏年.牛膝多糖的化學研究.藥學學報，1990，25(7)：526-529)。劉穎華等採用水提、醇沉法提取川牛膝粗多糖cpc(無具體操作方法)，cpc再經685弱鹼陰離子交換柱層析分離和bio-gelp2凝膠柱層析純化，得到川牛膝均一多糖rcp。rcp的分子量(mr)主要分布在1000-2200，單糖組成為d-果糖和d-葡萄糖(劉穎華，何開澤，張軍峰，蒙義文.川牛膝多糖的分離、純化及單糖組成.應用與環境生物學報，2003，9(2)：141-145)。陳曉明等將牛膝粗多糖abps(具體製備方不詳)經deae-cellulose和sephadexg-50兩次柱色譜純化得到一小分子量的果聚糖。單糖組成分析表明牛膝多糖由果糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8：1，其數均分子量為1400u，含有4至21糖。糖鏈中含有1,2-連接和2,6-連接的果糖殘基(陳曉明，等.牛膝多糖的理化性質研 究及結構確證.藥學學報，2005，40(1):32-35)。chen等牛膝水煎煮3次，水煎液採用sevage方法(正丁醇：氯仿＝4:1)脫色素和蛋白後、透析、醇沉(乙醇終濃度80％)。沉澱部分水溶解、h2o2脫色、透析、再醇沉(乙醇終濃度75％)。沉澱部分水溶解部分進行deae-纖維素和sephadexg-50柱層析，獲得牛膝多糖(abp)。該abp有甘露糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8:1(chen,etal.achyranthesbidentatapolysaccharideenhancesimmuneresponseinweanedpiglets.immunopharmimmunotoxicol,2009,31(2):253-260)。(2)牛膝粗多糖免疫活性的研究倪青松等採用水煎、醇沉法製備川牛膝粗多糖(具體操作不詳)，給7日齡仔雞飼餵400mg/kg的川牛膝多糖，在14、21和28日齡採頸靜脈血，分別檢測血清抗體(igg、iga、igm)和血液生化指標(谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶、鹼性磷酸酶、鈣、白蛋白)。結果顯示：川牛膝多糖400mg/kg劑量組與對照組相比，igg、iga和igm差異均顯著(0.01＜p≤0.05)，而白蛋白、穀草轉氨酶、谷丙轉氨酶、鹼性磷酸酶、鈣的差異均不顯著(倪青松，等.川牛膝多糖對雞血清抗體和血液生化指標的影響.四川畜牧獸醫，2011，248：27-28)。王宇學等研究牛膝根多糖abps(本院中藥研究所，純度99.9％，理化性質不詳)在體外對單核細胞活性的調節及誘導單核細胞hla-dra表面分子的表達。結果顯示abps能誘導單核細胞胞漿溶酶體和胞漿量增多和吞噬能力增強，同時上調單核細胞hla-dra表面分子的表達(王宇學，等.牛膝根多糖上調單核細胞免疫功能實驗.中國醫院藥學雜誌，2005，25(10)：940-942)。封海波等採用超聲輔助下水提、醇沉法(具體方法不詳)製備川牛膝粗多糖(rcps)，硫酸苯酚法-測定其糖含量為78.9％。rcps和o型口蹄疫滅活疫苗協同免疫icr小鼠，研究了其對免疫小鼠體內樹突狀細胞成熟的影響。小鼠在二次免後2周處死，無菌取脾，制 備脾細胞懸液，測定共刺激信號分子(cd40，cd80，cd86)的表達水平，檢測了mhcⅰ、mhcⅱ類分子，cxc型趨化因子受體4(cxcr4)和cc趨化因子受體7(ccr7)mrna表達水平。結果顯示：與對照組相比，在二次免疫後14d，rcps明顯增強了共刺激信號分子cd40，cd80，cd86的表達水平，同時提高了mhc-i，mhc-ii，cxcr4和ccr7mrna表達水平(封海波，等.川牛膝多糖對口蹄疫疫苗受免小鼠樹突狀細胞成熟的影響.中國獸醫雜誌，2014，50(3)：18-21)。邱妍等採用水煎煮、乙醇沉澱方法提取懷牛膝粗多糖，硫酸-蒽酮法測定其多糖含量為54％(理化性質不詳)。14d齡蛋在雞新支二聯弱毒苗點眼滴鼻免疫的同時，分別肌肉注射懷牛膝粗多糖3和6mg/ml二個劑量(每羽注射0.3ml)，每天注射1次，連續注射3次。分別於免疫後第7、14、21、28、35和42天靜脈採血，測定新城疫血凝抑制(hi)抗體效價及免疫功能。結果表明懷牛膝多糖高劑量組的hi抗體效價、cd4+/cd8+比值和免疫器官指數都明顯高於對照組，並且可以顯著促進t淋巴細胞增殖(邱妍，等.懷牛膝多糖對雛雞疫苗免疫效果的影響.畜牧獸醫學報，2007，38(7)：723-727)。牛膝多糖經水煎、醇沉方法提取牛膝粗多糖(具體製備方法不詳)，研究對雛雞進行禽流感滅活苗免疫的影響。肉仔雞於2和6周齡分別進行禽流感滅活苗的首免和二免。免疫同時每羽雞肌肉注射0.5ml4mg/ml和8mg/ml牛膝粗多糖。結果表明二免後聯用牛膝多糖-禽流感組雛雞血凝抑制抗體的滴度顯著升高，脾、胸腺和法氏囊指數均顯著提高(劉永華，等.牛膝多糖對雛雞禽流感免疫效果的影響.飼料研究，2014，9：52-53)。孫麗莎等研究牛膝多糖(質量分數50％，購自山東泰安醫藥有限公司)與鋅單用及合用體外在負載人食管癌ec9706製備的凍融抗原條件下對小鼠樹突狀細胞(dc)增殖分化和抗原提呈能力的影響。結果表明小鼠骨髓細胞體外在粒細胞-巨噬細胞刺激因子(gm-csf)和白細 胞介素-4(il-4)誘導下骨髓細胞生成dc，同時培養液中加入不同質量濃度的牛膝多糖(200、300、400μg/ml)、鋅(0.02μg/ml)。結果表明牛膝多糖和鋅單用在腫瘤抗原負載下能夠促進小鼠骨髓源性dc的分化、成熟及表面標記cd86、cd11a的表達，增強dc誘導的細胞毒性t淋巴細胞反應，能夠使荷瘤小鼠免疫器官脾臟和胸腺的質量增加，明顯抑制腫瘤的生長。牛膝多糖和鋅合用並不協同增強效應(孫麗莎，等.牛膝多糖與鋅對小鼠樹突狀細胞增殖分化和抗原提呈能力的影響.中草藥，2010，41(8)：1319-1322)。(3)牛膝成分的免疫活性研究chen等牛膝水煎煮3次，水煎液採用sevage方法(正丁醇：氯仿＝4:1)脫色素和蛋白後、透析、醇沉(乙醇終濃度80％)。沉澱部分水溶解、h2o2脫色、透析、再醇沉(乙醇終濃度75％)。沉澱部分水溶解部分進行deae-纖維素和sephadexg-50柱層析，獲得牛膝多糖(abp)。該abp有甘露糖和葡萄糖組成，單糖摩爾比為8:1。該多糖口服給3-4周齡幼豬，每天按500、1000和1500mg/kg劑量摻入食物中，連續餵養至14天和28天時，採血，測定對免疫功能的影響。結果顯示abp1000和1500mg/kg劑量能提高外周血淋巴細胞的增殖及血清igg、iga,、igm、c3、c4、il-2和ifn-γ(chen,etal.achyranthesbidentatapolysaccharideenhancesimmuneresponseinweanedpiglets.immunopharmimmunotoxicol,2009,31(2):253-260)。zhou等研究了從牛膝中分離純化的一種多糖abp，分子量1400da，由果糖和葡萄糖構成，摩爾比為8:1。果糖連接方式有：1,2-fru、1,2,6-fru以及末端1-fru和1-glc。該abp能刺激小鼠樹突細胞成熟(dc)和增殖，增加cd86、cd40和mhc-ii的表達。功能評價試驗顯示當dc細胞內的acp酶下調時，dc的胞吞作用下降，抗原呈遞能力升高，促進il-12的分泌(zou,etal.modulationofphenotypicandfunctionalmaturationofmurinedendriticcells(dcs)bypurifiedachyranthesbidentatapolysaccharide(abp).inter immunopharm,2011,11:1103-1108)。zhu等將牛膝多糖abps(分子量1400da，由果糖和葡萄糖構成，摩爾比為8:1)按50mg/kg劑量腹腔注射小鼠，連續10天和15天，然後感染p.y17xl瘧原蟲。感染3天和5天時，預先注射abps能提高th1免疫反應，增加f4/80+cd36+巨噬細胞數量，提高ifn-γ、tnf-α和no的水平，抵抗瘧原蟲的感染。另外abps還能增加骨髓cd11c+cd11b+樹突細胞和cd11c+cd45r+/b220+類漿細胞，調節cd11c+樹突細胞表達mhc-ii、cd86和tlr-9。預處理abps不影響中性treg的數量或抗炎因子il-10的生成(4.zhu,etal.polysaccharidesfromthechinesemedicinalherbachyranthesbidentataenhanceanti-malarialimmunityduringplasmodiumyoelii17xlinfectioninmice.malariaj,2012,11:49-55)。陳清華等採用水煎煮、sevage法脫蛋白、h2o2脫色、透析和醇沉製備牛膝粗多糖。粗多糖經deae-纖維素和sephadexg-50柱色譜純化後，獲得分子量均一多糖abp。abp由果糖和葡萄糖組成，兩者的摩爾比為8：1。斷奶乳豬在飼餵基礎日糧中添加500、1000、1500mg/kgabp，試驗第14和28天外周血淋巴細胞轉化率和血清中細胞因子tnf、il-1b、il-2、il-6的含量。結果表明與對照組相比，試驗第14天和28天abp三個劑量組的淋巴細胞si值分別提高了8.04％(p>0.05)、11.32％(p<0.01)和24.11％(p<0.01)；19.81％(p<0.01)、69.64％(p<0.01)和43.40％(p<0.01)。試驗第14天時，abp中劑量和高劑量組細胞因子tnf、il-1β、il-2和il-6含量極顯著高於對照組(p<0.01)，低劑量組的tnf和il-2含量顯著高於對照組(陳清華，等.牛膝多糖對仔豬淋巴細胞增殖作用和細胞因子分泌量的影響.動物營養學報，2008，20(6):712-717)。何桂萍等從牛膝根中分離提取得到的一種小分子水溶性的多糖(abps，製備方法不詳)，由果糖和葡萄糖組成，摩爾比為8.7:1.0，平均分子量為1400。牛膝多糖濃度分別為0.1mmol/l、0.05mmol/l、 0.025mmol/處理成熟dc細胞72h。結果：牛膝多糖處理組dc的同種mlr能力明顯增強(p<0.05)，il-12p70、il-17、tnf-α的分泌能力有顯著提高(何桂萍，等.牛膝多糖對人樹突狀細胞功能影響的體外研究.九江學院學報，2011，(3)：49-52)。王劍等從川牛膝(cyathulaofficinali)中分離一種多糖cp(具體製備方法不詳)。cp主要由d-β-果糖組成，含有少量的d-α-葡萄糖，平均相對分子量(mr)為1.6×103－2.7×103。體外研究表明，川牛膝多糖cp在10－300μg/ml濃度範圍內能夠促進b淋巴細胞增殖(p<0.01)，增強小鼠nk細胞活性(p<0.05)和腹腔巨噬細胞吞噬中性紅活性(p0.05)。王劍等又將該川牛膝多糖cp按25、50和100mg/kg.d的劑量腹腔注射小鼠，連續注射10d後，能增強正常小鼠遲髮型變態反應和nk細胞活性，提高小鼠碳粒廓清速率、抗體生成細胞數量和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞百分率，且隨多糖濃度增高而增強。cp還能顯著改善由環磷醯胺導致的白細胞數減少，但其對脾淋巴細胞轉化率無促進作用(王劍，等.川牛膝多糖的體外免疫活性研究.應用與環境生物學報，2008，14(4)：481-483；王劍，等.川牛膝多糖的體內免疫活性研究.中藥藥理與臨床，2007，23(6)：31-33)。xiang等評價牛膝多糖abp(製備方法不詳)，其分子量1.34kda，單糖組成為葡萄糖：甘露糖＝2:1。該多糖體外100-800μg/ml能協同lps刺激外周血巨噬細胞和腹腔巨噬細胞分泌il-1。abp按50和100mg/kg劑量灌胃小鼠5d，也能刺激腹腔巨噬細胞分泌il-1(xiang,etal.effectsofachyranthesbidentatpolysaccharidesoninterleukin-1andtumornecrosisfactor-alphaproductionfrommouseperitonealmacrophages.中國藥理學報，1993,14(4)：332-336)。向道斌等研究懷牛膝多糖abp(製備方法不詳)對體內外t淋巴細胞和天然殺傷(nk)細胞功能的影響。abp相對分子量為1360da， 由d-β-葡萄糖和d-α-甘露糖組成，摩爾比為2:1。結果表明abp50-800mg/l在體外增強天然殺傷(nk)細胞活性和促進伴刀豆球蛋白a(cona)誘導的tnf-β產生，但不能提高cona誘導的t淋巴細胞增殖反應和il-2的產生。abp按50和100mg/kg劑量腹腔注射小鼠，能明顯提高正常小鼠nk細胞活性和tnf-β生成，增強二硝基氟苯誘導的遲髮型超敏反應和對抗環磷酞胺對nk活性的抑制作用，但時cona誘導的t淋巴細胞增殖反應和il-2的產生無明顯影響(向道斌，等.牛膝多糖對t淋巴細胞和天然殺傷細胞功能的影響.中國藥理學與毒理學雜誌，1994，8(3)：209-212)。向道斌等又研發現該abp按50mg/kg劑量腹腔注射小鼠5天能明顯提高血清總igg及特異性抗體溶血素的含量，增加脾臟空斑形成細胞含量。abp體外0.2－0.8g/l能刺激小鼠脾細胞增殖，也能增強lps刺激的b淋巴細胞的增殖(向道斌，等.牛膝多糖對小鼠體液免疫反應的增強作用.上海免疫學雜誌，1994，14(3)：134-136)。呂建新等研究牛膝多糖(中科院上海有機化學研究所提供，具體製備方法和理化性質不詳)對巨噬細胞的激活作用。0.312、0.625、1.250、2.500和5.000mg/ml牛膝多糖體外與人胸腔巨噬細胞誘導培養24h，測定胸腔巨噬細胞內tnf-α與il-6的含量。結果表明牛膝多糖能上調胸腔巨噬細胞內乳酸脫氫酶和酸性磷酸酶活性，顯著誘導胸腔巨噬細胞表達tnf-α和il-6(呂建新，等.牛膝多糖對人胸腔巨噬細胞的激活作用.中國免疫學雜誌，1999，15：422-424)。王德成等研究牛膝多糖abps(中科院上海有機化學研究所提供，具體製備方法和理化性質不詳)對小鼠巨噬細胞的活化作用。結果顯示，濃度為100、200μg/ml的abps對巨噬細胞tnf-α分泌均有顯著的促進作用，200μg/ml的abps對巨噬細胞il-12分泌也有明顯的促進作用。abps能明顯上調巨噬細胞tlr-4mrna的表達(王德成，等.牛膝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的活化作用.微生物學雜誌，2013，33(4)：59-61)。王德成等又研究該牛膝多糖對巨 噬細胞細胞毒作用及機制。以200mg/l濃度的abps體外刺激小鼠腹腔來源巨噬細胞，結果表明濃度為200mg/l的abps對巨噬細胞細胞毒作用和no表達有顯著的促進作用，對inosmrna和蛋白表達均有明顯的促進作用(王德成，等.牛膝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞毒作用影響及機制.微生物學雜誌，2014,34(6)：70-73)。季敬璋等研究牛膝多糖abps(中國科學院上海有機化學研究所提供，具體製備方法和理化性質不詳)體外在終濃度為0、100、200、400、800μg/ml或在不同時間內對人t細胞培養上清液的ifn-γ及il-4的蛋白表達影響。結果表明人t細胞ifn-γ分泌水平隨abps濃度遞增，在400μg/ml時，ifn-γ表達量最高(p1000；[13]步驟(3)中的膜過濾為超濾。本發明還涉及另外一種製備牛膝粗多糖(粗多糖2)的方法，包括下述步驟：1)將牛膝藥材(例如懷牛膝或川牛膝)或者前面步驟(1)中提取後得到的牛膝藥材殘渣用水進行浸泡或者煎煮，保持溫度為81－100℃，得到水提液；2)將水提液進行減壓濃縮，濃縮液進行乙醇沉澱，沉澱部分加入水溶解，得到上清液；3)取上清液進行水透析或膜過濾；4)取透析液或濾液進行濃縮，濃縮液進行冷凍乾燥；在本發明的一些實施方案中，所述的製備牛膝粗多糖的方法，其特徵在於如下的[1]－[13]項中的任意一項或者多項:[1]將所述藥材牛膝或者所述牛膝藥材殘渣進行粉碎；[2]步驟(1)中所用水為蒸餾水或去離子水；[3]步驟(1)中，所述溫度為82℃－100℃；優選為85℃－100℃、90℃－100℃、95℃－100℃、96℃－100℃、97℃－100℃、98℃－100℃、99℃－100℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃；[4]將步驟(1)中的操作重複一次或者多次，合併水提液；[5]步驟(1)中水的用量為1－50倍量(l/kg)，優選為5－30倍量，優選為50－20倍量或者10－20倍量，例如15倍量；[6]步驟(1)中的浸泡或煎煮的時間為至少1小時、至少2小時、2－24小時、3－12小時或者5小時；[7]步驟(2)中，醇沉後乙醇的終濃度為60％－90％，例如70％－80％；[8]步驟(2)中所用乙醇的量為濃縮液的1－4倍體積；[9]步驟(2)中醇沉的時間為至少12小時、至少24小時、24－72小時或者48小時；[10]步驟(2)中，乙醇沉澱後離心，得到的沉澱用水進行一次或多次溶解，離心，合併上清液；[11]步驟(2)和/或(4)中減壓濃縮的溫度為50℃－55℃；[12]步驟(3)中透析或者膜過濾的截留分子量>1000；[13]步驟(3)中的膜過濾為超濾。本發明還涉及一種牛膝粗多糖，其由前面本發明中任一項所述的製備牛膝粗多糖的方法製得。本發明的牛膝粗多糖含有下面的本發明的牛膝多糖組分以及牛膝均一多糖。(二)牛膝多糖組分及其製備方法本發明的再一方面涉及一種牛膝多糖組分，其選自如下的牛膝多糖組分1－5：牛膝多糖組分1：主要由果糖組成；含有或者為一個均一多糖(一種果聚糖)，分子量為1900±1000da；優選地，還含有少量葡萄糖；優選地，多糖的峰高分子量為1860da；牛膝多糖組分2：主要由阿拉伯糖(ara)、木糖(xyl)、葡萄糖(glc)和半乳糖(gal)組成；含有峰高分子量大於200,000da的多糖i、分子量為48,300±25,000da的多糖ii以及寡糖(1000－5000da)等成分；優選地，多糖ii的峰高分子量48,300da。牛膝多糖組分3：主要由阿拉伯和葡萄糖組成；含有分子量為3300±2000da的多糖；優選地，多糖的峰高分子量為3300da；牛膝多糖組分4：主要由阿拉伯糖、鼠李糖(rha)、半乳糖和半乳糖醛酸(gala)組成；含有二個多糖，分子量分別為55,000±30,000da、7300±4000da；優選地，多糖的峰高分子量分別為55,000da和7300da；牛膝多糖組分5：主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成；為不對稱糖分布，主要峰的分子量為97,100±40,000da；優 選地，主要峰的峰高分子量為97,100da。本發明還涉及一種製備牛膝多糖組分的方法，包括下述步驟：將本發明的牛膝粗多糖1用水溶解後，通過選自deae-纖維素柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、瓊脂糖凝膠柱層析和丙烯葡聚糖凝膠柱層析中的至少一種進行分離，採用水或鹽洗脫。例如採用deae-纖維素柱層析，依次用水和nahco3溶液洗脫，檢測糖峰並收集含糖流份，分別得到水洗脫的多糖組分1和nahco3溶液洗脫的多糖組分2。在本發明的一個實施方案中，所述deae-纖維素柱為deae-纖維素(hco3-)柱。優選地，nahco3溶液的濃度為0.1-0.4mol/l，0.2-0.3mol/l，進一步優選為0.25mol/l。優選地，用苯酚-硫酸法或蒽酮法檢測糖峰。本發明還涉及另外一種製備牛膝多糖組分的方法，包括下述步驟：將本發明的牛膝粗多糖2用水溶解後進行deae-纖維素柱層析，依次用水、0.2-0.3mol/lnahco3溶液和0.4-0.6mol/lnahco3溶液洗脫，檢測糖峰並收集含糖流份，分別得到水洗脫的多糖組分3、0.2-0.3mol/lnahco3溶液洗脫的多糖組分4(優選使用0.25mol/lnahco3溶液洗脫)0.4-0.6mol/lnahco3溶液洗脫的5(優選使用0.5mol/lnahco3溶液洗脫)。在本發明的一個實施方案中，所述deae-纖維素柱為deae-纖維素(hco3-)柱。優選地，用苯酚-硫酸法檢測糖峰。本發明還涉及一種牛膝多糖組分，其由前面本發明中任一項所述的製備牛膝多糖組分的方法製得。本發明的牛膝多糖組分含有下面的本發明的牛膝均一多糖。(三)牛膝均一多糖及其製備方法本發明的再一方面涉及一種牛膝均一多糖，其選自如下的牛膝多糖1－4：牛膝均一多糖1：分子量2.0×103±1.0×103da，是一種果聚糖，主要含有果糖，即為一種果聚糖，還含有少量葡萄糖；優選地，峰高分子量為1860da。牛膝均一多糖2：分子量1.05×106±0.50×106da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80－1.20)：(4.00－6.50)：(4.00－5.50)：(6.00－9.00)；優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90－1.10)：(5.10－5.50)：(4.50－4.90)：(8.00－8.50)；更優選地鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.00：5.26：4.86：8.27；優選地，峰高分子量為1.05×106da；在本發明的一個實施方案中，所述的牛膝均一多糖2，其中，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80-1.20)：(5.00-5.50)：(4.50-5.00)：(8.00-8.50)；優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90-1.10)：(5.10-5.30)：(4.70-4.90)：(8.10-8.40)。牛膝均一多糖3：分子量5.35×105±2.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80－1.20)：(1.50－3.00)：(2.00－3.50)：(40.00－70.00)；優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90－1.10)：(1.80－2.20)：(2.30－2.60)：(50.00－60.00)；更優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.00：2.06：2.42：56.02；優選地，峰高分子量為5.35×105da；在本發明的一個實施方案中，所述的牛膝均一多糖3，其中，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80-1.20)：(1.8-2.30)：(2.20-2.70)：(52.00-60.00)；優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90-1.10)：(1.9-2.20)：(2.30-2.60)：(54.00-58.00)。牛膝均一多糖4：分子量2.78×105±1.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80－1.20)：(0.50 －1.50)：(0.20－0.80)：(0.50－2.00)：(12.00－20.00)；優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90－1.10)：(0.80－1.00)：(0.30－0.50)：(0.80－1.50)：(13.00－18.00)；更優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.00：0.93：0.34：0.91：16.67；優選地，峰高分子量為2.78×105da；在本發明的一個實施方案中，所述的牛膝均一多糖4，其中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.80-1.20)：(0.70-1.20)：(0.25-0.55)：(0.70-1.20)：(12.00-20.00)；優選地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝(0.90-1.10)：(0.80-1.00)：(0.30-0.40)：(0.80-1.00)：(15.00-18.00)。本發明還涉及一種製備牛膝均一多糖的方法，包括下述步驟：將本發明的多糖組分1用水溶解後進行sephadexg-25或sephadexg-50凝膠柱層析，採用水洗脫，檢測糖峰並收集含糖流份分，得到均一多糖1。優選地，用蒽酮-硫酸或苯酚-硫酸法檢測糖峰。本發明還涉及另外一種製備牛膝均一多糖的方法，包括下述步驟：將本發明的多糖組分5用水溶解後進行sephadexg-75或sephadexg-100凝膠柱層析，採用h2o或0.05－0.25mol/lnacl洗脫，檢測糖峰並收集含糖流份，得到均一多糖2、均一多糖3和均一多糖4。優選地，用苯酚-硫酸法檢測糖峰。優選地，用0.1mol/lnacl洗脫。本發明還涉及一種牛膝均一多糖，其由前面本發明中任一項所述的製備牛膝均一多糖的方法製得。本發明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含選自本發明的一種或幾種牛膝粗多糖、一種或幾種牛膝多糖組分和/或一種或幾種牛膝均一多糖，以及任選的藥學上可接受的輔料。在本發明的一個實施方案中，所述藥物組合物為疫苗製劑。在本發明的一個實施方案中，所述藥物組合物為疫苗佐劑。在本發明的一個實施方案中，所述藥物組 合物為免疫調節劑(用於上調或者下調免疫活性)或者提高免疫力的藥物。本發明的再一方面涉及本發明牛膝粗多糖、牛膝多糖組分或者牛膝均一多糖在製備疫苗、疫苗佐劑、抗體、調節細胞免疫活性的藥物或者提高動物免疫力的藥物中的用途；所述調節例如為上調或者下調；優選地，所述調節細胞免疫活性選自如下：促進脾臟細胞增殖，促進脾臟b細胞、ctl細胞、t細胞和/或th細胞的分化，以及提高cd3+、cd4+細胞、cd19+和/或cd8+細胞的比例。所述抗體例如為單克隆抗體或多克隆抗體。在本發明的一個實施方案中，所述動物為哺乳動物，例如鼠(例如小鼠或者大鼠)、豬、牛、羊、兔、狗、猴或人，優選為人。在本發明的一個實施方案中，所述動物為家禽，例如雞、鴨或鵝。本發明的再一方面涉及一種在體內或體外調節細胞免疫活性或者提高動物免疫力的方法，包括使用有效量的本發明的牛膝粗多糖、牛膝多糖組分或者牛膝均一多糖的步驟；所述調節例如為上調或者下調；優選地，所述調節細胞免疫活性選自如下：促進脾臟細胞增殖，促進脾臟b細胞、ctl細胞、t細胞和/或th細胞的分化，以及提高cd3+、cd4+細胞、cd19+和/或cd8+細胞的比例。在本發明的一個實施方案中，所述動物為哺乳動物，例如鼠(例如小鼠或者大鼠)、豬、牛、羊、兔、狗、猴或人，優選為人。在本發明的一個實施方案中，所述動物為家禽，例如雞、鴨或鵝。本發明還涉及一種製備抗體的方法，其包括使用有效量的本發明 的一種或幾種牛膝粗多糖、一種或幾種牛膝多糖組分和/或一種或幾種牛膝均一多糖的步驟。本發明中，術語「粗多糖」(crudepolysaccharides)是指將藥材或者植物水提和醇沉後得到的產物，本領域中有時也稱為「總多糖」。本領域技術人員知悉，如果藥材中含有多糖，藥材經過水提取、乙醇沉澱獲得的沉澱部分中一定含有多糖，但可能還含有其他非糖成分。本領域技術人員能夠理解，總多糖並非是指藥材或者植物的全部多糖，因為無論怎樣提取也很難獲得植物的全部多糖。術語「均一多糖」(homogeneouspolysaccharide)具有本領域公知的含義，是指分子量和電荷均一的多糖。可以採用本領域技術人員知悉的方法來測定分子量均一和電荷均一。例如，分子量均一可以通過hpgpc圖譜對稱峰型來確定；電荷均一可以經過離子交換柱層析測定，一般電泳圖譜為單一對稱峰。術語「多糖組分」(polysaccharidecomponent，有時在具體實驗中也稱為fraction)是指含有一種以上均一多糖的混合物。在特殊的情況下，多糖組分只含有一種均一多糖甚至即為一種均一多糖。本發明中的粗多糖、均一多糖、多糖組分亦分別稱為牛膝粗多糖、牛膝均一多糖、牛膝多糖組分。這樣命名的考慮是其可以從藥材牛膝中提取得到，但是並不排除以其它方式或者來源獲得。所述牛膝包括但不限於懷牛膝(achyranthesbidentata)、川牛膝(cyathulaofficinalis)等。本發明中，對於涉及粗多糖、均一多糖、多糖組分的結構、組成、成分或者含量等的描述中，術語「主要」是指含量≥50％，例如≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或者≥99％。術語「少量」是指含量≤50％、≤45％、≤40％、≤35％、≤ 30％、≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％或者≤1％。上述百分比是指質量百分比。在本發明中，所述疫苗為減毒疫苗、滅活疫苗、蛋白質亞單位疫苗、嵌合載體疫苗、dna疫苗、rna疫苗、多肽疫苗或小分子-蛋白偶合物疫苗。在本發明的一個實施方案中，所述疫苗為h1n1流感疫苗；在本發明的另一個實施方案中，所述疫苗為B肝疫苗。在本發明的再一個實施方案中，所述疫苗為小分子-蛋白偶合物疫苗。在本發明中，疫苗佐劑是指能夠用於疫苗的佐劑，其它疫苗佐劑例如氫氧化鋁或磷酸鋁或白油等佐劑。在本發明中，疫苗與疫苗製劑含義相同，是指所有用減毒或殺死的病原生物(細菌、病毒、立克次體等)或其它抗原性物質所製成，可使機體產生特異性免疫，用於預防接種或治療的生物製劑。本發明中，所述乙醇的濃度，如果沒有特別說明，均指重量百分比濃度(w/w％)。本發明中，術語「寬峰」一般指多糖在色譜柱中保留時間間隔長，而且峰型對稱性不好的色譜峰。發明的有益效果本發明的牛膝粗多糖、多糖組分、以及均一多糖均具有良好的免疫佐劑活性和免疫調節作用，為疫苗佐劑和免疫調節功能提供了新的選擇。附圖說明下面的附圖5、6、7、9、11、13、15、17、19、21中縱坐標mv均是指電信號毫伏。圖1：牛膝粗多糖abp-50在deae-纖維素柱層析洗脫曲線。圖2：牛膝粗多糖abp-100在deae-纖維素柱層析洗脫曲線。圖3：多糖組分abp-50-a在sephadexg50柱層析洗脫曲線。圖4：多糖組分abp-100-c在sephadexg100的洗脫曲線。圖5：牛膝粗多糖abp-50的gpc圖譜。圖6：牛膝粗多糖abp-100的gpc圖譜。圖7：多糖組分abp-50-a的gpc圖譜。圖8：多糖組分abp-50-a的ce圖譜。圖9：多糖組分abp-50-b的gpc圖譜。圖10：多糖組分abp-50-b的ce圖譜。圖11：多糖組分abp-100-a的gpc圖譜。圖12：多糖組分abp-100-a的ce圖譜。圖13：多糖組分abp-100-b的gpc圖譜。圖14：多糖組分abp-100-b的ce圖譜。圖15：多糖組分abp-100-c的gpc圖譜。圖16：多糖組分abp-100-c的ce圖譜。圖17：均一多糖abp-100-c-1的gpc圖譜。圖18：均一多糖abp-100-c-1的ce圖譜。圖19：均一多糖abp-100-c-2的gpc圖譜。圖20：均一多糖abp-100-c-2的ce圖譜。圖21：均一多糖abp-100-c-3的gpc圖譜。圖22：均一多糖abp-100-c-3的ce圖譜。圖23：圖23a，牛膝粗多糖abp-50對B肝抗原免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖23b，牛膝粗多糖abp-50對B肝抗原免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。圖24：圖24a，牛膝粗多糖abp-100對B肝抗原免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖24b，牛膝粗多糖abp-100對B肝抗原免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。圖25：圖25a，牛膝多糖組分abp-50-a對h1n1流感疫苗免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖25b，牛膝多糖組分abp-50-a對 h1n1流感疫苗免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。圖26：圖26a，多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c對B肝抗原免疫小鼠初次免疫的抗體滴度影響。圖26b，多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c對B肝抗原免疫小鼠二次免疫的抗體滴度影響。圖27：圖27a，均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對B肝抗原免疫小鼠初次免疫抗體滴度的影響。圖27b，均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對B肝抗原免疫小鼠二次免疫抗體滴度的影響。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1：牛膝粗多糖abp-50和abp-100的製備1.牛膝粗多糖abp-50的製備取中藥材懷牛膝(購於北京同仁堂藥店)1kg，粉碎，向其中加入蒸餾水15l，50℃條件下浸泡5小時，期間不時攪拌；然後二層紗布過濾，濾液離心(3000r/min×20min)，浸提後的殘渣在同樣條件下進行第二次提取，得到牛膝藥材殘渣(殘渣用於後面abp-100的製備)和水提液。合併兩次提取的水提液，50－55℃減壓濃縮獲得水提濃縮液。然後加入濃縮液的4倍體積95％乙醇進行醇沉48小時(上清液乙醇濃度80％)。離心，分離沉澱部分，向沉澱部分中加入水攪拌溶解，離心，再將沉澱同樣操作3次；合併溶解的上清液，裝入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；將得到的袋內透析液減壓濃縮後，進 行冷凍乾燥，獲得牛膝粗多糖abp-50。2.牛膝粗多糖abp-100的製備向前面得到的牛膝藥材殘渣中加入蒸餾水15l，100℃條件下煎煮1.5小時，期間不時攪拌；然後放涼，二層紗布過濾，濾液離心(3000r/min×20min)，上清液50℃－55℃減壓濃縮，獲得水提濃縮液。然後加入濃縮液的3倍體積95％乙醇進行醇沉48小時(上清液乙醇濃度70％)。離心，分離沉澱部分，向沉澱部分中加入水攪拌溶解，離心，再將沉澱同樣操作3次；合併溶解的上清液，裝入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；將得到的袋內透析液減壓濃縮後，進行冷凍乾燥，獲得牛膝粗多糖abp-100。實施例2：牛膝多糖組分abp-50-a、abp-50-b，以及abp-100-a、abp-100-b、abp-100-c的製備1.牛膝多糖組分abp-50-a、abp-50-b的製備稱取實施例1得到的牛膝粗多糖abp-501g，加入20ml水溶解後上樣於deae-纖維素層析柱(φ7.0cm×50cm)，依次用h2o和0.25mol/lnahco3洗脫，洗脫速度1ml/min，每隻試管收集10ml，蒽酮-硫酸法檢測流出的糖吸收峰(od620nm)。分別獲得abp-50-a(h2o洗脫)和abp-50-b(0.25mol/lnahco3洗脫)二個多糖組分，洗脫曲線見圖1。abp-50-b流份蒸餾水透析除鹽。2.牛膝多糖組分abp-100-a、abp-100-b、abp-100-c的製備稱取實施例1得到的牛膝粗多糖abp-1001g，加入20ml水溶解後上樣於deae-纖維素層析柱(φ7.0cm×50cm)，依次用h2o、0.25和0.5mol/lnahco3洗脫，洗脫速度1ml/min，每隻試管收集10ml，苯酚-硫酸法檢測流出的糖吸收峰(od620nm)。分別獲得abp-100-a(h2o洗脫)、abp-100-b(0.25mol/lnahco3洗脫)和abp-100-c(0.5mol/lnahco3洗脫)三個 多糖組分，洗脫曲線見圖2。分別收集三個含糖流份，用蒸餾水透析除鹽，在減壓濃縮和冷凍乾燥製得。實施例3：牛膝均一多糖abp-50-a-1，以及abp-100-c-1、abp-100-c-2、abp-100-c-3的製備1.牛膝均一多糖abp-50-a-1的製備稱取多糖組分abp-50-a200mg，加入2ml水溶解，上樣sephadexg50凝膠層析柱(ф2.0cm×120cm)，蒸餾水洗脫(洗脫曲線見圖3)，硫酸-蒽酮法檢測流出的糖吸收峰(od620nm)，減壓濃縮和冷凍乾燥，獲得均一多糖abp-50-a-1。2.牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2、abp-100-c-3的製備稱取多糖組分abp-100-c200mg，加入3ml水溶解，上樣sephadexg100凝膠層析柱(ф2.0cm×120cm)，0.1mol/lnacl洗脫(洗脫曲線見圖4)，硫酸-苯酚法檢測流出的三個含糖吸收峰(od490nm)，分別收集、蒸餾水、減壓濃縮和冷凍乾燥，獲得三個均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3。實施例4：牛膝粗多糖abp-50和abp-100的理化性質研究1.實驗用品實施例1方法製備得到牛膝粗多糖abp-50和abp-100。2.實驗方法採用硫酸－苯酚法測定糖含量(以葡萄糖計算)；採用hpgpc方法測定多糖組分分子量分布(儀器：hplc，waters公司；色譜柱：tsksw3000；流動相：0.1mna2so4；流速：0.6ml/min；檢測器：示差)。3.實驗結果牛膝粗多糖abp-50的糖含量為94.29％，abp-100的糖含量為 29.03％。abp-50主要含有峰高分子量為2000da的寡糖，分子量2000±1000da；abp-100主要含有一個峰高分子量為6.60×104da的寬色譜峰，分子量6.60×104±3.50×104da。abp-50和abp-100的分子量分布見圖5和圖6。實施例5：多糖組分abp-50-a、abp-50-b以及abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c的理化性質研究1.實驗樣品實施例2方法製備得到牛膝粗多糖abp-50的兩個多糖組分(abp-50-a、abp-50-b)及abp100的三個多糖組分(abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c)。2.實驗方法採用hpgpc方法測定多糖組分分子量分布(儀器：hplc，waters公司；色譜柱：tsksw3000；流動相：0.1mna2so4；流速：0.6ml/min；檢測器：示差)。多糖完全酸水解和pmp衍生化，採用毛細管電泳方法測定單糖的摩爾比(儀器：美國貝克曼公司，緩衝鹽溶液：50mmol/l硼砂溶液(ph＝10.57)；毛細管柱：φ50μm×60cm；分離電壓：15kv；檢測波長：245nm；進樣壓力：0.5psi；進樣時間：10s；柱溫：25℃)。3.實驗結果(1)abp-50-a：是一個分子量均一的均一多糖，峰高分子量為1,860da，主要含有果糖，即為一種果聚糖，還含有少量葡萄糖，結果見圖7和圖8。(2)abp-50-b：分子量分布較寬，其中含有峰高大於200,000da的多糖、峰高48,300da及高含量寡糖成分。該組分由阿拉伯糖(ara)、木糖(xyl)、葡萄糖(glc)和半乳糖(gal)組成，結果見圖9和圖10。(3)abp-100-a：主要含有一個峰高分子量為3,300da的多糖， 主要由阿拉伯和葡萄糖組成，單糖摩爾比為：ara：glc＝1.00：0.90，結果見圖11和圖12。(4)abp-100-b：含有二個多糖峰，峰高分子量分別為55,000da和7,300da，主要由阿拉伯糖、鼠李糖(rha)、半乳糖和半乳糖醛酸(gala)組成，單糖摩爾比為：ara：rha：gal：gala＝1.00：0.24：0.54：1.71，結果見圖13和圖14。(5)abp-100-c：為不對稱糖分布，主要峰的峰高分子量為97,100da，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：gal：gala＝1.00：2.85：3.37：8.90，結果見圖15和圖16。實施例6：牛膝均一多糖abp-50-a-1、abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3的理化性質研究1.實驗樣品實施例3方法製備得到牛膝均一多糖abp-50-a-1、abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3。2.實驗方法採用hpgpc方法測定多糖組分分子量分布(儀器：hplc，waters公司；色譜柱：tsksw3000；流動相：0.1mna2so4；流速：0.6ml/min；檢測器：示差)。多糖完全酸水解和pmp衍生化後，採用毛細管電泳方法測定單糖的摩爾比(儀器：美國貝克曼公司，緩衝鹽溶液：50mmol/l硼砂溶液(ph＝10.57)；毛細管柱：φ50μm×60cm；分離電壓：15kv；檢測波長：245nm；進樣壓力：0.5psi；進樣時間：10s；柱溫：25℃)。3.實驗結果(1)均一多糖abp-50-a-1：與abp-50-a相同。(2)均一多糖abp-100-c-1：峰高分子量為1.05×106da，分子量1.05×106±0.50×106da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖 醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：gal：gala＝1.00：5.26：4.86：8.27，結果見圖17和圖18。(3)均一多糖abp-100-c-2：峰高分子量為5.35×105da，分子量5.35×105±2.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：gal：gala＝1.00：2.06：2.42：56.02，結果見圖19和圖20。(4)均一多糖abp-100-c-3：峰高分子量為2.78×105da，分子量2.78×105±1.50×105da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，單糖摩爾比為rha：ara：glc：gal：gala＝1.00：0.93：0.34：0.91：16.67，結果見圖21和圖22。實施例7：牛膝粗多糖abp-50和abp-100對B肝抗原佐劑活性評價實施例1製備的牛膝粗多糖abp-50和abp-100作為佐劑，以B肝蛋白亞單位(hbsag)為抗原(大連漢信生物製藥有限公司生產)，abp-50和abp-100按照0.2mg/鼠劑量分別與B肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。實驗分為生理鹽水對照組、單獨hbsag抗原組、hbsag+abp-50組(0.2mg/鼠)、hbsag+abp-100組(0.2mg/鼠)和hbsag+鋁佐劑組(0.2mg/鼠)。配伍肌肉注射免疫小鼠。小鼠初次免疫後14天，elisa方法測定B肝抗原特異性抗體滴度。初次免疫後28天進行二次免疫，劑量同初次。二次免疫後14天測定B肝抗原特異性抗體滴度。採用elisa測定血清中抗體滴度，具體操作如下：elisa法所用試劑配製：(1)抗原包被液：50mmol/l碳酸鹽緩衝液ph9.6。稱取無水na2co31.696g，nahco32.856g加水溶解到1000ml，調節ph至9.6。(2)洗滌液(10×pbst，ph7.4)：稱取nacl80g，kcl2g，na2hpo429g，kh2po42g，tween-2010ml，雙蒸水至1000ml，調節ph7.4，10倍稀釋使用。(3)封閉液：1％bsa，用50mmol/lpbsph7.4溶解。(4)底物液(tmb-h2o2)：使用時將底物液a和b等體積混合，加入30％h2o2，終濃度0.5％。底物液a(tmb)：稱取tmb200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。底物液b(0.1mol/l檸檬酸-0.2mol/lna2hpo4緩衝液)：na2hpo424.8g，檸檬酸19.33g，加雙蒸水至1000ml，調節ph5.0－5.4。(5)2nh2so4。(6)hbsag溶解於抗原包被液，濃度為4μg/ml，包被96孔板(costa)100μl/孔，4℃過夜。pbst洗3遍，1％bsa-pbs37℃封閉1小時。pbst洗3遍後加入以pbst稀釋的小鼠血清樣品，100μl/孔，37℃孵溫1小時。pbst洗3遍，加入hrp-羊抗小鼠igg(1:1000，pbst)37℃孵溫1小時，pbst洗6遍，加入100μl底物液顯色後，加入50μl2nh2so4終止反應測定a450。實驗結果：初次免疫後14天，各免疫組小鼠的抗體滴度均較低，各組之間無明顯差異(圖23a和24a)。二次免疫後14天，與生理鹽水組相比，單獨抗原免疫組小鼠抗體滴度明顯升高(p<0.01)，聯用牛膝粗多糖abp-50或abp-100組小鼠血清抗體滴度顯著高於單獨抗原組(p<0.01)，但二者之間佐劑效果相似(圖23b和圖24b)。結果顯示，abp-50和abp-100對B肝抗原有明顯的佐劑活性，但活性低於鋁佐劑。實施例8：牛膝多糖組分abp-50-a對h1n1流感疫苗的佐劑活性評價按實施例2製備牛膝多糖組分abp-50-a，研究對h1n1流感滅活疫苗(病毒裂解液，北京科興生物製品有限公司生產)的佐劑活性。h1n1流感疫苗劑量3μg/鼠，以上四個多糖佐劑的劑量均為0.2mg/鼠，採用肌肉注射免疫小鼠。實驗分為生理鹽水對照組、單獨h1n1抗原組、h1n1+abp-50-a組和h1n1+鋁佐劑組。小鼠初次免疫後14天，elisa方法測定h1n1流感抗原特異性抗體滴度。初次免疫後28天進行二次免疫，劑量同初次免疫。二次免疫後14天測定h1n1流感抗原特異性抗體滴度。具體測定方法參考實施例7。實驗結果：初次免疫後14天，單獨抗原組及聯用所有多糖組分組小鼠的特異性抗體滴度均較低，各組之間無明顯差異(圖25a)。二次免疫後14天，與生理鹽水組相比，單獨h1n1抗原組小鼠血清抗體滴度明顯升高(p<0.01)(圖25b)。結果顯示，抗原聯用abp-50-a能更顯著升高抗體滴度(p<0.01)，表明abp-50-a對h1n1流感疫苗具有顯著佐劑活性。實施例9：牛膝粗多糖abp-100的三個多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c對B肝抗原佐劑活性評價實施例2製備的牛膝粗多糖abp-100的三個多糖組分abp-100-a、abp-100-b和abp-100-c分別與B肝蛋白亞單位(hbsag)為抗原聯用(大連漢信生物製藥有限公司生產)免疫小鼠。多糖佐劑按照0.2mg/鼠劑量與B肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。實驗分為生理鹽水對照組、單獨hbsag抗原組、hbsag+abp-100-a組、hbsag+abp-100-b組、hbsag+abp-100-c組和hbsag+鋁佐劑組(0.2mg/鼠)。小鼠初次免疫後14天，elisa方法測定B肝抗原特異性抗體滴 度。初次免疫後28天進行二次免疫，劑量同初次。第二次免疫後14天測定B肝抗原特異性抗體滴度。實驗結果：abp-100的三個多糖組分分別與B肝抗原聯用免疫小鼠初次免疫後14天，各組血清特異性抗體滴度均較低。(圖26a)。經過二次免疫後，三個多糖組分均能提高免疫小鼠血清特異性抗體滴度水平(p<0.05)，但佐劑活性弱於鋁佐劑(圖26b)。實施例10：均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對B肝抗原免疫小鼠體液免疫的評價實施例3製備的三個牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3作為佐劑，以B肝重組蛋白(hbsag)為抗原(2μg/鼠，大連漢信生物製藥有限公司生產)，abp-50和abp-100按照0.2mg/鼠劑量分別與B肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。實驗分為生理鹽水對照組、單獨hbsag抗原組、hbsag+abp-100-c-1組(0.2mg/鼠)、hbsag+abp-100-c-2組(0.2mg/鼠)、hbsag+abp-100-c-3組(0.2mg/鼠)和hbsag+鋁佐劑組(0.2mg/鼠)。配伍肌肉注射免疫小鼠。小鼠初次免疫後14天，elisa方法測定B肝抗原特異性抗體滴度。初次免疫後28天進行二次免疫，劑量同初次。二次免疫後14天測定B肝抗原特異性抗體滴度。採用elisa測定血清中抗體滴度，具體操作同實施例7。結果如圖27a和27b所示。結果表明：abp-100-c的三個多糖組分中的abp-100-c-1和abp-100-c-2成分與B肝抗原聯用，均能顯著提高B肝抗原特異性抗體滴度，佐劑活性優於鋁佐劑，abp-100-c-3佐劑效果與鋁佐劑相近。實施例11：牛膝粗多糖abp-50和abp-100對免疫小鼠細胞免疫功能的評價按實施例7方法分別將實施例1製備的牛膝粗多糖abp-50和abp-100與B肝疫苗抗原聯用免疫小鼠二次。二次免疫後14天處死小鼠，無菌去脾臟，製備脾細胞，調整細胞密度為5×109個/l。將計數後的脾細胞懸液按每孔100μl加入到96孔細胞培養板，各孔分別加入100μl細胞培養液，然後各孔再分別加入100μl細胞培養液，每組設3復孔。將培養板置於含5％co2培養箱中，37℃孵育48h。加入20μlmtt(5mg/ml)，繼續孵育4h。棄上清液後，每孔中加入150μldmso酶標儀檢測a570nm，測定脾細胞增殖能力。實驗結果見表1。表1：牛膝多糖abp-50和abp-100對B肝免疫小鼠脾細胞增殖的影響組別od570nmsaline(生理鹽水)0.482±0.058hbsag0.417±0.087＊hbsag+abp-500.484±0.037#hbsag+abp-1000.589±0.045###hbsag+al(oh)30.465±0.021#註：與抗原對照組比較，#p<0.05，###p<0.01，n＝6.結果表明：與生理鹽水組相比，單獨hbsag抗原組小鼠脾臟細胞增殖能力降低(p<0.05)；與抗原組相比，abp-100能顯著促進小鼠脾臟細胞的增殖(p<0.001)，abp-50也能提高增殖能力，達到生理鹽水組增殖水平。實施例12：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對免疫小鼠細胞免疫功能的評價按實施例10方法將B肝抗原分別與實施例3製備的牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2或abp-100-c-3聯用，免疫小鼠二次後14d，頸椎脫臼處死。無菌條件下取出脾，製備脾細胞懸液，調整細胞 密度為5×109個/l。將計數後的脾細胞懸液按每孔100μl加入到96孔細胞培養板，各孔分別加入100μl細胞培養液，然後各孔再分別加入100μl細胞培養液，每組設3復孔。將培養板置於含5％co2培養箱中，37℃孵育48h。加入20μlmtt(5mg/ml)，繼續孵育4h。棄上清液後，每孔中加入150μldmso酶標儀檢測a570nm，測定脾細胞增殖能力。另取脾細胞懸液100μl(2×107/ml)，加入100μl混合抗體(含percp-倉鼠抗小鼠cd3e抗體0.25μg，apc-大鼠抗小鼠cd19抗體0.5μg，pe-大鼠抗小鼠cd4抗體0.125μg，fitc-大鼠抗小鼠cd8a抗體0.5μg)，每組設3個平行管。另外設4個相應的單標抗體對照。室溫下避光孵育25min，然後各管加入洗液1.5ml，混勻。4℃離心10min(600×g)，棄上清，再離心和洗滌3次，重懸細胞，然後加入pbs500μl，搖勻，進行流式細胞儀分析，測定cd3+、cd19+、cd4+和cd8+細胞的百分率。實驗結果如表2、表3以及表4所示。表2：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對B肝免疫小鼠脾細胞增殖的影響註：與抗原對照組比較，##p<0.01，n＝6.表3：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對免疫小鼠脾臟cd3+和cd19+細胞的影響註：與正常對照組相比，＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.001；與模型組相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。表4：牛膝均一多糖abp-100-c-1、abp-100-c-2和abp-100-c-3對免疫小鼠脾臟cd4+和cd8+細胞的影響註：與正常對照組相比，＊＊p<0.01,＊＊＊p<0.001；與模型組相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。結果表明：abp-100-c-2與B肝抗原聯用免疫小鼠，能顯著提高脾臟細胞的增殖活性(見表2)。進一步流式細胞儀分析表明abp-100-c-1能提高受免小鼠脾臟cd3+和cd4+細胞比例，升高及cd3+/cd19+和cd4+/cd8+的比值，提示abp-100-c-1能促進脾臟t細胞及th細胞分化；abp-100-c-2減少能提高受免小鼠脾臟cd19+和cd8+細胞比例，降低cd3+/cd19+和cd4+/cd8+的比值，提示abp-100-c-2能促進脾臟b細胞及ctl細胞分化(見表3和表4)。上述實驗結果顯示，本發明的牛膝均一多糖特別是abp-100-c-1和abp-100-c-2能提高免疫小鼠細胞免疫的能力。儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附權利要求及其任何等同物給出。當前第1頁12