人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建及高密度發酵生產方法
2023-05-11 23:55:46 1
人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建及高密度發酵生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建及高密度發酵生產方法，包括人鐵蛋白輕鏈基因編碼序列的合成，經過酶切和連接，克隆至表達載體pPIC9k中，再將重組載體轉化至畢赤酵母GS115中，通過篩選得到高水平分泌表達的重組畢赤酵母，然後利用發酵罐實現人鐵蛋白輕鏈在發酵罐中高密度生長並得到高效分泌表達。本發明改變了傳統的原核宿主大腸桿菌表達人鐵蛋白輕鏈，通過真核宿主畢赤酵母在發酵罐中的高密度發酵得到了大量人鐵蛋白輕鏈，既保證了人鐵蛋白輕鏈的生物學活性，又節約了成本。
【專利說明】人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建及高密度發酵生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及高水平分泌表達人鐵蛋白輕鏈的重組畢赤酵 母的構建方法及利用該重組畢赤酵母高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法。
【背景技術】
[0002] 鐵蛋白輕鏈（ferritinlightchain，FTL)是鐵蛋白的一種亞基。鐵蛋白 (ferritin)是一種普遍存在於生物體內的保守性較高的多功能多亞基生物蛋白，是細胞內 主要的鐵儲存蛋白。在體內，鐵蛋白的主要生理功能是儲存機體中的過剩鐵，避免產生鐵中 毒和釋放鐵給需鐵的細胞，用於體內生物合成含鐵的蛋白質或酶。因此它可以避免過量鐵 通過Fenton反應產生活性氧（ROS)，從而起到保護機體免受氧化損傷的作用。目前，DNA的 氧化損傷與腫瘤之間的關係已較明確，因此，鐵蛋白與腫瘤之間關係的研究也備受人們關 注。鐵蛋白含有2種不同的亞基，分別為肝臟型（L型）和心臟型（H型），也稱為輕鏈L(? 19500)和重鏈H(?21000)。鐵蛋白H亞基與腫瘤之間關係的研究已有很多，二者關係已 較確定，而與之具有55%序列同源性的鐵蛋白L基是否具有類似作用，此問題也開始引起 一些研究人員的重視。目前，在肝癌、胃癌等腫瘤的研究中都發現有鐵蛋白L亞基的異樣表 達。由於鐵蛋白與炎症病變、血液病、肝病、心腦血管疾病、腎病以及惡性腫瘤等密切相關， 在這些疾病的臨床診斷、治療、監測中都起到重要的作用。因此，有必要開發一種鐵高質量 的鐵蛋白檢測試劑盒，因此就需要開發高質量的校準與質控以及抗原抗體原材料。
[0003]目前，在試劑盒開發的過程中多以組織純化的鐵蛋白作為校準、質控或抗體的制 備原料，但是組織純化的鐵蛋白其活性、線性、穩定性、特異性、敏感性以及保存時間等都 有可能受到來源不同而差異巨大，因此需要開發利用基因工程手段製備的高特異性重組蛋 白。
[0004] 在專利申請文件《一種基因重組人鐵蛋白輕鏈的製備方法》（專利申請號： CN200910141974. 0)中曾經提到用大腸桿菌重組表達人鐵蛋白輕鏈。在多種表達系統中，大 腸桿菌表達系統是目前研究最為深入，發展最迅速的原核表達系統。作為生命科學研究的 模式生物之一，大腸桿菌不僅在遺傳學背景，基因表達調控機理方面的研究已經非常清晰， 而且擁有多種適應不同表達的載體和宿主菌，但是作為原核生物，大腸桿菌的外源表達依 舊具有以下缺點：（1)大腸桿菌系統不具有真核細胞翻譯後修飾加工的功能，無法幫助真 核蛋白糖基化，磷酸化，正確摺疊和分泌等；（2)大腸桿菌無轉錄後剪切過程，無法識別真 核基因內含子區域。因此對於需要進行糖基化修飾或其他翻譯後修飾的真核生物的蛋白， 用大腸桿菌表達系統還是會存在一定的缺陷。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為了解決上述問題而提供一種畢赤酵母高密度發酵生產人鐵蛋 白輕鏈的方法，更具體的是提供一種高水平分泌表達人鐵蛋白輕鏈的重組畢赤酵母的構建 方法及利用該重組畢赤酵母高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是：
[0007] 人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建，具體如下：
[0008] 1)人鐵蛋白輕鏈基因編碼序列的合成：根據人鐵蛋白輕鏈基因編碼序列，合成 人鐵蛋白輕鏈基因，並在兩側引入酶切位點，回收片段並連接到pet23a載體，得到質粒 pet23a/ferritinL，經測序為正確序列；
[0009] 2)真核表達載體的構建：將質粒pet23a/ferritinL和載體Ppic9k經過雙酶切後 回收，再進行連接，連接完成後轉入XL-GOLD菌株，找到重組子，得到質粒Ppic9k/ferritin L；
[0010] 3)轉化真核宿主畢赤酵母：用SacI單酶切質粒Ppic9k/ferritinL線性化後溶 液回收，轉化到畢赤酵母GSl15中，然後篩選重組畢赤酵母，再通過菌落PCR的方法來驗證。
[0011] 進一步地，所述質粒pet23a/ferritinL和載體Ppic9k在SolutionI溶液中進 行連接，連接溫度為12-20°C，連接時間為2-4小時。
[0012] 利用上述的重組畢赤酵母高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法：
[0013] 接種所述的重組畢赤酵母於Yro液體培養基中培養至0D600在4-6之間時，將上 述培養液接種到發酵罐培養基BSM中發酵，發酵過程分為兩個階段：
[0014] 第一階段，發酵參數為：溫度26-28°C，pH值5. 0-6. 0,攪拌速度300-700rpm，溶氧 量40 %以上；待發酵罐中的甘油被消耗盡時，流加PTMl的甘油溶液，當菌體密度0D600等 於300時停止，進入第二階段；
[0015] 第二階段，發酵參數為：溫度26-28°C，pH值5. 0-6. 0,攪拌速度500-750rpm，溶氧 量20-30%;流加甲醇進行發酵90-100h，發酵結束。
[0016] 進一步地，所述培養液的接種量為5-10%，發酵罐的裝液量為40-60%。
[0017] 進一步地，所述的PTMl的甘油溶液為：每IL50%W/V甘油水溶液中含有10-15mL PTMl。
[0018] 進一步地，發酵結束後，收集發酵液中人鐵蛋白輕鏈：將發酵培養液在4°C下， 15000r/min離心 15min。
[0019] 本發明提供的人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建及高密度發酵生產方法，改變了 傳統的原核宿主大腸桿菌表達人鐵蛋白輕鏈，通過真核宿主畢赤酵母在發酵罐中的高密度 發酵得到了大量人鐵蛋白輕鏈，既保證了人鐵蛋白輕鏈的生物學活性，又節約了成本，可為 抗體製備或診斷試劑盒的校準品的製備提供批量的、高質量的原材料。
[0020] 本發明選用畢赤酵母作為重組人鐵蛋白輕鍊表達的宿主，主要是利用了畢赤酵母 表達系統的以下優勢：（1)畢赤酵母具有最強啟動子-AOX啟動子，在甲醇存在下即可高效 誘導外源基因高水平表達；(2)畢赤酵母適合高密度培養，適宜大批量發酵生產外源蛋白， 有利於工業化應用；（3)外源蛋白可進行胞內表達也可分泌表達，是否分泌表達與信號肽 的存在與否有關，Ppic9k載體系列已經包含有酵母信號肽的畢赤酵母表達載體，適用於外 源基因的分泌表達；（4)外源蛋白在畢赤酵母系統中為整合表達，不存在游離的質粒，因此 遺傳也很穩定；（5)可以進行轉錄翻譯後的加工修飾，翻譯後修飾與高等真核生物相近，糖 基化程度與哺乳動物相同；(6)基因水平操作簡單，適合工程菌構建。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明實施例提供的Western-Blot驗證發酵產物結果圖，圖左邊的多條帶 為marker帶，右邊的一條帶為重組人鐵蛋白輕鏈目的條帶。
【具體實施方式】
[0022] 本實施例所用的實驗素材如下：
[0023]菌株和載體：菌株P.pastorisGS115 和XL-G0LD，載體pet23a和pPIC9k購自 invitrogen公司。
[0024] 培養基的製備：培養基包括YPD、斜面培養基和BSM培養基。
[0025] Yro培養基中含有如下組分：1.0%酵母抽提物、2. 0%蛋白腖和1. 0%葡萄糖；
[0026] 斜面培養基含有的組分如下：1. 0%酵母抽提物、2.0%蛋白腖、I.0%葡萄糖和 1.5 %瓊脂；
[0027]BSM培養基含有如下組分：
[0028] 85%磷酸26.7ml/L 二水合硫酸鈣0.93g/L 硫酸鉀18.2g/L 二水合硫酸鎂14.9g/L 氫氧化鉀4.13g/L 甘油40g/L
[0029] PMTl 4.0ml/L
[0030]PTMl是一種微量元素鹽溶液，具體的配方及配置方法如下：
[0031] 五水硫酸銅 6.0g/L 碘化鈉 0.08g/L 一水合硫酸錳 3.0g/L 鉬酸鈉 0.2g/L 硼酸 0.02g/L 氯化鈷 0.5g/L 氯化鋅 20.0g/L 七水合硫酸亞鋏 65.0g/L 生物素 0.2g/L 硫酸 5.0ml
[0032] 加水定容至終體積為1升，並過濾消毒，於室溫下儲存備用。
[0033]PTMl的甘油溶液：每IL50% (W/V)甘油水溶液中含有10-15mLPTMl。
[0034] 具體的人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母構建及高密度發酵生產方法包括如下步驟 ：
[0035] 1)人鐵蛋白輕鏈（ferritinL)基因編碼序列的合成
[0036] 首先，在NCBI資料庫中查找人鐵蛋白輕鏈基因編碼序列，通過兩步法合成人鐵蛋 白輕鏈（ferritinL)基因並在兩側引入XhoI和NotI酶切位點，回收和純化片段並連 接到pet23a載體，轉化感受態XL-GOLD菌株，塗布於含氨苄青黴素的LB固體培養基，篩選 陽性克隆菌株，並進行測序鑑定得到質粒pet23a/ferritinL，經測序為正確序列；
[0037] 2)真核表達載體的構建
[0038] 分別以質粒pet23a/ferritinL和空質粒pPIC9k為模板，用XhoI和NotI雙 酶切，再分別回收和純化，按1 :2的比例混合，加入SolutionI16°C下連接3小時，轉化 感受態XL-GOLD菌株，塗布於含氨苄青黴素的LB固體培養基，篩選陽性克隆菌株，得到質粒 Ppic9k/ferritinL〇
[0039] 3)重組質粒轉化真核宿主畢赤酵母。
[0040] 將10微克用SacI線性化的質粒Ppic9k/ferritinL和80微升的GS115感受態 混合，轉至預冷的電轉杯中，按照Invitrogen公司操作手冊電轉化法將重組載體轉化到宿 主畢赤酵母GS115中。轉化後，用含lmg/mlG418抗性平板篩選重組畢赤酵母，再通過菌落 PCR的方法來驗證，驗證正確的重組畢赤酵母GSl15接種保存至斜面培養基備用。
[0041] 4)人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母高密度發酵
[0042]A、將含有Ppic9k/ferritinL的重組酵母菌株劃線於YPD平板上，並置於28°C培 養2天；
[0043]B、挑取YPD平板上單菌落接種到種子Yro液體培養基中培養至菌體濃度0D600 = 6,再將上述培養液以初始發酵體積8 %的接種量接種發酵罐培養基BSM中，發酵罐中BSM培 養基的裝液量為50% ;
[0044]C、整個發酵過程分為兩個階段：
[0045] 第一階段為提高生物量階段，即菌體生長階段；發酵參數為：溫度28°C，用28%氨 水調節至PH5. 5,通氣量為0. 5vvm，攪拌速度300-700rpm，溶氧量40 %以上。從接種開始 16-20h後，發酵罐中的甘油被消耗盡，此時開始流加PTMl的甘油溶液（每1L50%W/V甘油 水溶液中含有IOmLPTMl)。當菌體密度0D600 = 300時停加甘油，準備進入第二階段；
[0046] 第二階段為誘導階段；發酵參數為：溫度26°C，pH5. 3,通氣量為0. 5vvm，攪拌速 度500-750rpm，溶氧量20-30%。當停加甘油後，流加甲醇，在初始的2-3h，是菌體對甲醇的 適應期，甲醇會在發酵罐中積累，DO值不穩定，當菌體完全適應利用甲醇後2-4h，並以甲醇 為限制性碳源時，DO值會達到穩定狀態。在適應期後，繼續保持低速（3ml/h)流加甲醇至 少2h，之後將流加速度提高1倍並保持至發酵結束，整個甲醇流加過程持續誘導95h，發酵 結束，發酵液在4°C條件下15000r/min離心15min，取上清液。
[0047]D、Western-Blot驗證發酵產物
[0048] 通過Western-Blot驗證發酵中的產物，驗證結果見附圖，通過驗證的結果可以發 現通過該重組畢赤酵母可以良好的表達人鐵蛋白輕鏈。
[0049] 最後所應說明的是，以上【具體實施方式】僅用以說明本發明的技術方案而非限制， 儘管參照實例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明 的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋 在本發明的權利要求範圍當中。
【權利要求】
1. 人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母的構建，其特徵在於： 1) 人鐵蛋白輕鏈基因編碼序列的合成：根據人鐵蛋白輕鏈基因編碼序列，合成人鐵蛋 白輕鏈基因，並在兩側引入酶切位點，回收片段並連接到pet23a載體，得到質粒pet23a/ ferritin L，經測序為正確序列； 2) 真核表達載體的構建：將質粒pet23a/ferritin L和載體Ppic9k經過雙酶切後回 收，再進行連接，連接完成後轉入XL-GOLD菌株，找到重組子，得到質粒Ppic9k/ferritin L ； 3) 轉化真核宿主畢赤酵母：用Sac I單酶切質粒Ppic9k/ferritin L線性化後溶液回 收，轉化到畢赤酵母GS115中，然後篩選重組畢赤酵母，再通過菌落PCR的方法來驗證。
2. 如權利要求1所述的人鐵蛋白輕鏈重組畢赤酵母構建，其特徵在於：所述質粒 pet23a/ferritin L和載體Ppic9k在Solution I溶液中進行連接，連接溫度為12-20°C, 連接時間為2-4小時。
3. 利用權利要求1-2任一項重組畢赤酵母高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法，其特 徵在於： 接種所述的重組畢赤酵母於YH)液體培養基中培養至0D600在4-6之間時，將上述培 養液接種到發酵罐培養基BSM中發酵，發酵過程分為兩個階段： 第一階段，發酵參數為：溫度26-28°C，pH值5. 0-6. 0,攪拌速度300-700rpm，溶氧量 40 %以上；待發酵罐中的甘油被消耗盡時，流加 PTM1的甘油溶液，當菌體密度0D600等於 300時停止，進入第二階段； 第二階段，發酵參數為：溫度26-28°C，pH值5. 0-6. 0,攪拌速度500-750rpm，溶氧量 20-30% ;流加甲醇進行發酵90-100h，發酵結束。
4. 如權利要求3所述的高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法，其特徵在於：所述培養 液的接種量為5-10%，發酵罐的裝液量為40-60%。
5. 如權利要求3所述的高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法，其特徵在於：所述的 PTM1的甘油溶液為：每1L 50% W/V甘油水溶液中含有10-15mL PTM1。
6. 如權利要求3所述的高密度發酵生產人鐵蛋白輕鏈的方法，其特徵在於：發酵結束 後，收集發酵液中人鐵蛋白輕鏈：將發酵培養液在4°C下，15000r/min離心15min。
【文檔編號】C12R1/84GK104357477SQ201410640019
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】沈鶴霄, 華權高, 楊琥 申請人:武漢金開瑞生物工程有限公司