一種螢光標記試劑的製作方法

2023-04-23 19:22:31

專利名稱：一種螢光標記試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種螢光標記試劑(或稱螢光標記探針)。
背景技術：
近年來，螢光染料作為功能性色素在科學技術的各個領域得到廣泛應用。尤其作為分子探針在生命科學、超分子光化學方面的研究在全世界範圍內備受矚目，是目前熱門的研究課題之一。眾所周知，化學，生物學裡的關鍵過程是分子識別和組裝，對這些分子水平的微觀過程的觀測與研究對人類認識整個世界有極其重要的意義。經過特殊設計的螢光分子探針具有高靈敏度，高特異選擇性，可進行實時單分子檢測，安全方便等特點，可將微環境的變化信息轉變為光信號，從而使人-分子的對話成為可能，架起宏觀世界與微觀世界的橋梁。除了作為強大的分析檢測工具而外，螢光分子的另一個重要應用是作為分子開關中的光信號單元，由於能夠對環境刺激作出螢光發射的「開」或「關」的控制，因此可能被應用為未來分子計算機的信息處理邏輯開關。
螢光團(即螢光染料母體)上引入活性基團，如琥珀醯亞胺，異硫氰酸酯，馬來醯亞胺等，可以與生物分子上的氨基，巰基等基團通過共價鍵特異性結合，從而對生物分子進行螢光標記。二十世紀九十年代中期的重要科技成果基因晶片的關鍵技術之一就是核苷酸的螢光標記。螢光標記技術的飛速發展，尤其近年來以螢光染料為標示劑的生物晶片的出現，使螢光染料在DNA自動測序、免疫分析、臨床診斷、新藥設計和開發中有了更加廣闊的應用前景。染料的螢光性能、穩定性、溶解性是影響其在生物分析領域中應用的重要因素。目前在生命科學領域應用極為廣泛的Cy3-dutp、Cy5-dutp就是典型的核酸標記螢光探針。該類染料具有良好的螢光性能，其結構特點是吲哚環中N原子上的取代基至少有一個為羧戊基。吲哚環5位上的磺酸使該染料具有良好的水溶性，它們是目前應用最好的螢光探針之一，但光穩定性差，影響分析的可靠性，仍是其不足。與此同時，Cy3-NHS、Cy5-NHS作為蛋白質標記用螢光染料也被廣泛使用，但由於其遇水極易分解，長期保存十分困難。另外，由於Cy3、Cy5系列螢光染料的原料價格昂貴，合成路線較長，產品收率很低，導致最終目標化合物的生產成本太高。這些缺點大大限制了此類螢光標記探針的進一步推廣應用。

發明內容
本發明目的在於，提供一種價格相對低廉且具有良好螢光性能和光穩定性的螢光標記試劑(或稱螢光標記探針)，克服現有技術中的不足。
發明概述由於8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈分子結構強化了其剛性共平面性，具有較強的缺電子性，擴大了共軛體系，非常容易與親核試劑發生親核取代反應，本發明利用此特點，將含有不同取代基的氨基化合物與8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈分子進行親核取代反應，開發新型的螢光標記探針。通過在氨基化合物中引入羧基，進而生成染料—琥珀醯亞胺活化酯或染料—萘醯亞胺活化酯，藉此，此活化酯就可以與烷胺基核苷中的胺基結合，形成本發明所指的用於核苷酸標記的螢光標記探針；當然，烷胺基核苷中的胺基也可以直接與與8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈分子發生親核取代反應，得到本發明所指的螢光標記探針。
本發明所說螢光標記試劑(或稱螢光標記探針)，其為式(1)所示的化合物 式(1)中R1為H或C1-C8烷基；R2為 或 其中m，n分別為1-8中一整數；R3為 或 R3』為H、SO3H或C1-C8的烷基；A為核苷。
在本發明中，優選的R1為H或C1～C4的烷基，最佳的R1為H；優選的m，n分別為1～4中一整數；優選的R3』為H或C1～C4的烷基。
所說的核苷(A)由式(2)所示的四個鹼基中任何一個與式(3)所示的戊糖組成
(2)式中，Z是H或NH2，折線為與式(1)中「乙炔基」連接端，R4是戊糖，其結構如式(3)所示 (3)式中，R5為H，PO3H2，P2O6H3或P3O9H4，或為所述磷酸的鹽；R6為H，OH，F，N3或NH2；R7為H或OH；R8為H或OH；且(a)當R7＝R8＝H時，則R6＝H，OH，F，N3或NH2；(b)當R7＝H且R8＝OH時，則R6＝H或OH；(c)當R7＝OH且R8＝H時，則R6＝OH。
(3)式中折線為與式(2)中「鹼基」連接端。
製備本發明所述螢光標記試劑的方法是以8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈為起始原料，將8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈與帶有氨基連接臂的核苷(α)進行反應，得到染料(8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈)-三磷酸核苷化合物(目標化合物之一)；或由8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈先與R1NH(CH2)nCOOH反應，所得產物再與N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)或碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)或N-羥基1，8-萘醯亞胺縮合，得(8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈)-琥珀醯亞胺活化酯(目標化合物之二)，最後將所得(8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈)-琥珀醯亞胺活化酯與帶有氨基連接臂的核苷(β)進行反應，得到染料(8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈)-三磷酸核苷化合物(目標化合物之三)。
其中帶有氨基連接臂的核苷(α)為R1NH(CH2)mC≡CA，帶有氨基連接臂的核苷(β)為NH2(CH2)mC≡CA，R1，m和A的含義與前文所述相同。8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈(起始原料)的製備參見ZL 02148400.7，帶有氨基連接臂的核苷製備參見US 5,047,519，其它原料及試劑為市售品。
所說製備方法的合成路線如下 其中R1，R3，m，n和A的含義與前文所述相同。
與現有的螢光標記試劑相比，本發明所說的螢光標記試劑具有價格低廉、製備簡單且具備良好螢光性能和光穩定性等優點。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明作進一步闡述，其目的僅在於更好理解本發明之目的。因此，所舉之例並不限制本發明的保護範圍實施例13-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈的合成 20mmol 8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈加入到20ml乙腈中，再加入22mmol 6-氨基己酸，常溫攪拌半小時，減壓蒸去溶劑，矽膠柱層析分離，洗脫液二氯甲烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)，收集Rf＝0.35的深紅色強螢光譜帶，蒸去溶劑得到產品。MS(ESI-)358.0。
3-(ε-羧戊基琥珀醯亞胺酯)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物1)的合成 10mmol 3-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於2ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，加入30mmol碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)和0.1ml絕對無水吡啶，氬氣保護下55-60℃攪拌反應4小時，減壓蒸去溶劑，矽膠柱層析分離，洗脫液二氯甲烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)，收集Rf＝0.42的深紅色強螢光譜帶，蒸去溶劑得到產品。MS(ESI+)457.2。
實施例23-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈-dUTP(化合物2)的合成 5-(3-炔丙胺)-2』-脫氧尿苷三磷酸30μmol溶於1ml Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)中，將45μmol的3-(ε-羧戊基琥珀醯亞胺酯)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於1ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，並加入到前述溶液中，室溫攪拌反應12小時後，用Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)稀釋到10ml，半製備HPLC分離純化得到目標化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脫)，冷凍乾燥後-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基質CHCA)862.1。
實施例33-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈-dCTP(化合物3)的合成
5-(3-炔丙胺)-2』-脫氧胞苷三磷酸30μmol溶於1ml Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)中，將45μmol的3-(ε-羧戊基琥珀醯亞胺酯)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於1ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，並加入到前述溶液中，室溫攪拌反應12小時後，用Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)稀釋到10ml，半製備HPLC分離純化得到目標化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脫)，冷凍乾燥後-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基質CHCA)861.1。
實施例43-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈-ddUTP(化合物4)的合成 5-(3-炔丙胺)-2』，3』-二脫氧尿苷三磷酸30μmol溶於1ml Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)中，將45μmol的3-(ε-羧戊基琥珀醯亞胺酯)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於1ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，並加入到前述溶液中，室溫攪拌反應12小時後，用Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)稀釋到10ml，半製備HPLC分離純化得到目標化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脫)，冷凍乾燥後-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基質CHCA)846.2。
實施例5[8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈]-dUTP(化合物5)的合成 5-(3-炔丙胺)-2』-脫氧尿苷三磷酸30μmol溶於1ml Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)中，將45μmol的8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於1ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，並加入到前述溶液中，室溫攪拌反應12小時後，用Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)稀釋到10ml，半製備HPLC分離純化得到目標化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脫)，冷凍乾燥後-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基質CHCA)749.1。
實施例6[8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈]-ddUTP(化合物6)的合成 5-(3-炔丙胺)-2』，3』-二脫氧尿苷三磷酸25μmol溶於1ml Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)中，將40μmol的8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於1ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，並加入到前述溶液中，室溫攪拌反應12小時後，用Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)稀釋到10ml，半製備HPLC分離純化得到目標化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脫)，冷凍乾燥後-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基質CHCA)733.1。
實施例7[8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈]-dCTP(化合物7)的合成 5-(3-炔丙胺)-2』-脫氧胞苷三磷酸30μmol溶於1ml Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)中，將45μmol的8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於1ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，並加入到前述溶液中，室溫攪拌反應12小時後，用Na2CO3-NaHCO3緩衝溶液(pH9.4)稀釋到10ml，半製備HPLC分離純化得到目標化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脫)，冷凍乾燥後-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基質CHCA)748.1。
實施例83-(ε-羧戊基萘醯亞胺酯)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物8)的合成 10mmol 3-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊並[1，2-b]吡咯-9-腈溶於2ml絕對無水的二甲基甲醯胺(DMF)中，加入30mmol N-羥基1，8-萘醯亞胺和0.1ml絕對無水吡啶，氬氣保護下55-60℃攪拌反應4小時，減壓蒸去溶劑，矽膠柱層析分離，洗脫液二氯甲烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)，收集Rf＝0.42的深紅色強螢光譜帶，蒸去溶劑得到產品。MS(ESI+)555.2。
權利要求
1.一種螢光標記試劑，其特徵在於，所說的螢光標記試劑為具有式(1)所示的化合物 式(1)中R1為H或C1-C8烷基；R2為 或 其中m，n分別為1-8中一整數；R3為 或 R3』為H、SC3H或C1-C8的烷基；A為核苷。
2.如權利要求1所述的螢光標記試劑，其特徵在於，其中R1為H或C1～C4的烷基。
3.如權利要求2所述的螢光標記試劑，其特徵在於，其中R1為H。
4.如權利要求1所述的螢光標記試劑，其特徵在於，其中m，n分別為1～4中一整數。
5.如權利要求1所述的螢光標記試劑，其特徵在於，R3』為H或C1～C4的烷基。
6.如權利要求1～5所述的任意一種螢光標記試劑，其特徵在於，其中所用的核苷(A)為由式(2)所示的四個鹼基中任何一個與式(3)所示的戊糖組成 (2)式中，Z是H或NH2，R4是戊糖，其結構如式(3)所示 (3)式中，R5為H，PO3H2，P2O6H3或P3O9H4，或所述磷酸的鹽；R6為H，OH，F，N3或NH2；R7為H或OH；R8為H或OH；且(a)當R7＝R8＝H時，則R6＝H，OH，F，N3或NH2；(b)當R7＝H且R8＝OH時，則R6＝H或OH；(c)當R7＝OH且R8＝H時，則R6＝OH。
7.如權利要求6所述的螢光標記試劑，其特徵在於，所說的螢光標記試劑為化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7或化合物8。
全文摘要
本發明涉及一種螢光標記試劑，所說的螢光標記試劑為式(1)所示的化合物。與現有的螢光標記試劑相比，本發明所說的螢光標記試劑具有價格低廉、製備簡單且具備良好螢光性能和光穩定性等優點。式(1)中R
文檔編號G01N33/52GK1940563SQ200510030078
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月28日 優先權日2005年9月28日
發明者錢旭紅, 朱維平, 徐玉芳, 張佩琢, 徐曉勇, 肖義, 陳卓, 段春曉 申請人:華東理工大學, 上海吉瑪製藥技術有限公司