B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及其應用方法
2023-04-23 19:11:41 2
專利名稱：B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及其應用方法
技術領域：
本發明屬醫學領域，涉及B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及慢性B肝患 者使用拉米夫定抗病毒治療後耐藥情況的臨床監測。
背景技術：
以拉米夫定(lamivudine，LAM)為代表的核苷類似物類抗B型肝炎病毒 (hepatitis B virus,HBV)藥物的臨床應用是慢性B型肝炎治療史上的裡程碑。迄今為止， 已經有100多萬慢性B型肝炎患者接受了拉米夫定治療，使慢性B型肝炎的治療取得了巨 大的進步。抗HBV藥物的廣泛應用在為慢性B型肝炎患者(chronic hepatitis B,CHB)帶 來福音的同時，也帶來了嚴重的耐藥問題。例如拉米夫定治療1 4年的耐藥率可分別高 達14%、38%、49%和66%。引起HBV對拉米夫定耐藥主要原因是在HBV的聚合酶基因的 逆轉錄B區的180位胺基酸由亮氨酸(L)替換成了蛋氨酸(M)和C區的204位胺基酸由蛋 氨酸M替換成了纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)。即造成YIDD或YVDD變異，LAM與其的結合 力就會下降，導致HBV對LAM產生耐藥性。除了 YMDD變異之外，在LAM選擇壓力下，還會在 YMDD基序之外出現補償性變異。目前，國內尚無同時用於多個變異位點檢測的試劑盒。為 此，我們研發了液相晶片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能懸浮點陣儀)技術，可 快速、簡便和高通量地檢測LAM耐藥變異株。對於LAM耐藥相關性變異的檢測，除了 DNA測序分析之外，國外報導可使用聚合 酶鏈反應_限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)、INNO-LiPA探針檢測法、特異性PCR 及固相晶片等方法。測序分析方法需要昂貴的測序儀，檢測過程耗時較長，且只有當病毒 群中HBV變異株至少佔30%以上時(通常需50 %以上)，才能檢測到變異株，用於變異株 的早期檢測有較大的局限性；基於PCR-RFLP的方法可能一次只能檢測一種類型的變異；而 INNO-LiPA探針檢測法雖然靈敏度較高，但檢測成本較高，且操作複雜耗時，檢測通量較低， 同時價格昂貴，推廣應用受到限制。
發明內容
本發明的目的是提供一種B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及相應的乙 肝病毒拉米夫定相關變異應用檢測方法。本發明提供了一種B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針，該檢測探針可以是 SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID N016、SEQ ID NO 17、 SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種。較好的，該探針由SEQ ID NO 12、SEQID NO 13、SEQ ID NO 14中的一種或者幾種 和 SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19 中的一種 或者幾種組成。將序列SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14中的一種寡聚核苷酸 分子與序列如 SEQID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19中的一種寡聚核苷酸分子組合，進行檢測可同時獲得兩個耐藥性位點的測試結果，能夠更準確地獲得樣本的拉米夫定耐藥性特徵。本發明的探針也可由SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ IDNO 15、 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 全部八種寡核苷酸分子組 成。同時使用八種寡核苷酸分子作為檢測探針，不僅能準確地獲得樣本的拉米夫定耐藥性 特徵，而且可以確定B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的類型。上述這些探針可以根據其核苷酸編碼序列，採用化學合成方法，也可以採用從乙 肝病毒拉米夫定耐藥變異株的基因組DNA通過多次PCR獲得。本發明還提供了將該檢測探針用於確定B肝病毒拉米夫定耐藥變異株方面的應
用。
實際應用中，可以將本發明的B肝病毒拉米夫定耐藥變異株檢測探針與液相晶片 技術結合。液相晶片技術(MASA)是美國納斯達克上市公司Luminex研製出的新一代生物芯 片技術平臺，它既能為後基因組時代科學研究提供強大的技術支持，又能提供高通量的新 一代分子診斷技術平臺。其技術原理是用聚苯乙烯製成的大小均一的圓形小球(微球)， 直徑在IOnm IOOOum之間，按照不同的比例摻入兩種不同的紅色分類螢光，將微球進行染 色，使每個微球都有了一個特定的光譜地址。將不同的探針分別以共價方式結合到不同的 具有特定顏色的微球上，然後和待測樣品進行液相雜交，再將微球成單列通過Luminex平 臺的檢測通道，用兩束不同顏色的雷射進行掃描，一束雷射檢測特定光譜地址的微球，確定 探針的種類；另一束雷射檢測微球上探針信號的強弱，以確定靶基因的含量。所得到的數據 經電腦處理後可以直接用來判斷樣本中是否含有某種特定的變異位點及靶基因相對含量。 利用上述系統可同時完成上百種變異的檢測，並可以同時檢測96個樣本；從標本採集、DNA 抽提到檢測完畢，僅需5-7小時即可完成。和固相晶片方法相比，它具有以下優點1.重複 性好；2.敏感性高；3.靈敏度好；4.特異性高因為只讀微粒上的信號；5.檢測迅速液相 懸浮雜交比固相擴散雜交快；6.價格低設備和試劑的價格都低於晶片；7.檢測結果易分 析。本發明中確定B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的方法包括如下步驟(1)將探針與微球結合；(2)擴增樣本核酸序列中拉米夫定耐藥位點；(3)將(1)所得的產物與(2)的產物雜交，根據雜交反應結果判斷樣本的拉米夫定 耐藥性。上述步驟(1)中，較好的是探針中每一種特定寡聚核苷酸與特定微球結合。雜交 後，通過檢測微球的種類就能夠確定寡聚核苷酸的種類。所述的微球也可以由類似大小的顆粒狀物質代替。顆粒狀物質的直徑可以採用 10-1000 μ m。如果需要採用兩種及兩種以上的微球置於同一反應液中，可以將微球偶聯歐 聯不同的顯色劑或者螢光物質進行區分，通過檢測微球在一定條件下的顯色或者所發射的 螢光就可以確定微球的種類。通常採用有機材料製作微球，例如本發明實施例中的聚苯乙 烯。也可以採用其它帶有羧基功能基團的材料製作微球，以便偶聯探針。也可以修飾探針， 以便其能與微球較好偶聯。步驟(2)中，採用聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增。進行PCR反應在拉米夫定耐藥 位點相應的核苷酸編碼序列的上遊和下遊設計引物，從而擴增樣本中拉米夫定耐藥位點相
RTSlRTASlRTS2RTAS2
應序列。所用的弓I物可以按照常規方法設計，例如採用下表的引物。引物序列
名稱序列(5』 一3』 ) 5』 -CTAGGACCCCTGCTCGTGTT-3』 (SEQ ID NO 20) 5， -GCAAACCCCAAAAGACCCA-3， (SEQID NO 21) 5』 -ATTCCTATGGGAGTGGGCCT-3(SEQ ID NO 22) 5』 -Biotin-CCCAAAAGACCCACAATTCG-3(SEQ ID NO 23)步驟(3)中，根據雜交後微球所結合探針的種類和數量判斷樣本的拉米夫定耐藥 性。雜交過程中，通常在PCR產物、探針或者微球上有顯色或者螢光標記物，用於識別。雜 交後，洗去未結合的PCR產物，重懸反應液中的微球，然後檢測所結合探針種類甚至數量即 可分析樣本的拉米夫定耐藥性。上述的拉米夫定耐藥位點是HBV RT區的第180位或者第250位胺基酸殘基，變異 株的密碼子突變詳見表1。本發明具體涉及建立一種快速、準確測定B型肝炎病毒拉米夫定相關耐藥變異株 檢測系統，可用於臨床標本的檢測。在NA治療之前進行檢測，有助於針對性地選用合適的 NA和療效預測，節約治療成本。在治療過程中對HBV不同變異株進行監測，將有助於早期發 現基因型耐藥，並及時給予更換或加用其他NA，防止出現病毒學突破及臨床耐藥，阻止由耐 藥所引起的療效喪失和病情的惡化，提高療效。總之，敏感、特異的NA變異株檢測系統的建 立將有助於針對性地選用NA，使B肝的治療個體化，優化治療方案，提高我國慢性B肝治療 的整體水平。本方法可以根據患者血液甚至體液，判斷患者體內是否存在拉米夫定耐藥變異 株，以決定是否需及時調整治療藥物找到合適的治療方案，從而實現臨床常見HBV耐藥位 點的檢測，並為臨床抗病毒治療提供一定的參考。具體而言，本發明的檢測方法可以通過以下方案進行1.基本原理用聚苯乙烯製成的大小均一的圓形小球(微球，購自Luminex公 司)，直徑在IOnm IOOOum之間，按照不同的比例摻入兩種不同的紅色分類螢光，將微球進 行染色，使每個微球都有了一個特定的光譜地址。2.探針的設計、合成與固定(1)探針是針對不同的基因突變位點而設計的特異性序列，主要包括拉米夫定常 見的兩個耐藥位點(rtl80和rt204位胺基酸)，通過分析我國不同地區B肝患者(包括治 療和未治療的患者)血清標本中HBV RT區的核苷酸序列，進一步了解自然變異情況以及拉 米夫定誘導的核苷酸變異情況，以確保本檢測系統的準確性，使之適合於不同的地區、種族 和基因型的患者。通過對GenBank中HBVRT區核苷酸多態性分析RT180和RT204位的自然 變異情況，從而設計耐藥相關型核苷酸變異，包括同義突變(見表1)；(2)突變位點儘可能位於探針的中間，探針長度21bp左右，雜交溫度54°C (見表 2)。(3)不同光譜地址的微球與以上特定的探針偶聯，因微球的主要化學成分為聚苯 乙烯，其表面修飾的羧基功能集團在一定條件下可以共價結合任何含有氨基的目標分子， 故通過設計探針的5』端氨基修飾，它就可以和微球表面的羧基等基團偶聯並能與被檢測物
5特異性結合，每種微球可固定結合一種探針，使每個微球都結合IO5個探針。3.靶基因的擴增①由於拉米夫定耐藥相關性突變主要集中在HBV RT區第180位到第250位氨基 酸之間，故把選定此段序列作為PCR擴增的靶基因。②設計、合成上述靶基因擴增的引物，並對下遊引物進行生物素標記，使得擴增的 PCR產物都標記有生物素，便於後繼的螢光檢測。③在檢測低病毒載量的臨床標本時，可在此對引物的內側再設計一對套式引物， 用於變異株的定性檢測。4.基於液相晶片技術的HBV耐藥變異株定性上機檢測(即檢測整個病毒群有無某 種變異株)①在96孔板中分別加入生物素化的PCR產物及變性液，在每個孔中加入2000個 微球及雜交液，在54°C下，懸液中微球上的探針與PCR產物雜交結合。②經過幾次洗滌，洗去未結合的PCR產物，在每個孔中都加入鏈黴素_藻紅蛋白報 告分子(SAPE)顯色。緊接著離心、洗滌，將微球重懸。 ③在Luminex平臺檢測每個孔中微球的信號(隨機讀取100個微球)，當微球成單 列通過Luminex平臺的檢測通道時，用兩束不同顏色的雷射進行掃描，一束雷射檢測特定 光譜地址的微球，確定探針的種類；另一束雷射檢測微球上探針信號的強弱，判斷有無變異 株(針對每種類型的變異株，電腦都會獲得一組數據)。而Luminex系統會自動將100個微 球讀取結果的中位數作為輸出結果。本發明具有以下優點1.本發明的拉米夫定耐藥相關HBV突變位點的檢測可以監測臨床上CHB抗病毒的 治療，該方法特異性高、靈敏度好、檢測通量大、速度快，微球直徑很小、容易混懸在液體中， 反應快速、充分、需要時間短，雜交後無需洗脫，可同時檢測約96種變異情況和96個臨床樣 本，因此可同時設計其他核苷類似物(阿德福韋和恩替卡韋等)特異性耐藥探針，與特異微 球混合後直接加入整個體系後雜交，整個雜交過程約1-2小時可以完成，不需要晶片製作 等其他繁瑣過程；2.本發明的晶片MASA檢測臨床LAM耐藥CHB標本結果顯示(表4)，MASA可同時 檢測rtl80和rt204胺基酸變異，並能準確判斷變異的類型及混合變異；用此方法對25例 LAM耐藥的CHB患者相關耐藥位點的檢測發現有15例樣本與20411探針雜交信號明顯升高 (陰性和陽性螢光值中位數分別為5和106)，有11例樣本與204V探針雜交信號較高(陰 性和陽性螢光值中位數分別為9和114) (Z值=-4. 588和-4. 520,P < 0. 05差異有統計學 意義)；有2例發現與以上兩種探針雜交信號均很高，即有YIDD和YVDD混合變異株存在； 僅有一例樣本與20412探針雜交信號明顯較高。同樣用該方法檢測20例未治療患者的血 清標本，均未發現LAM相關性變異。晶片檢測結果與常規測序結果的符合率為100%，即本 方法特異性可達100%，但該方法較測序法敏感，可以檢測到常規測序無法檢測到的混合變 異，如可同時檢測到YIDD合併YVDD混合變異類型，而常規測序通常只能檢測到混合變異中 比例較高的變異；3.該方法具有很高的靈敏度，當病毒群中含有大於5%的某種LAM耐藥相關HBV 變異株時，即可被本方法檢測到(附圖)，微球表面積大，單個微球可結合多達約(1 2) Xl06個目標分子，探針和螢光信號強度高，兩束雷射同時分別檢測微球分類螢光(特異 性)和報告螢光(敏感性)，只有與分類螢光同時出現的報告螢光信號才被檢測記錄，信噪 比高，只需極少量PCR產物(5ul)就可以檢測。4.本發明操作簡單、經濟，便於臨床大樣本的應用，液相晶片技術洗脫步驟的減少 使操作省時、省力，能同時進行多種突變的檢測而樣品用量極少，同時試劑用量少，節約成 本，提高了效率。5.從臨床標本處理、PCR擴增、上機檢測到獲得檢測結果僅需5-7小時的時間，可 大大縮短的診斷時間，為患者的救治贏得寶貴時間。
圖1-圖4是變異株質粒敏感性檢測圖(圖中變異株佔病毒群的比例分別為0%、 5%、10%、20%、40%、60%、80%和100% ；野毒株佔病毒群的比例分別為100%、95%、 90%、80%、60%、40%、20%和 0% ) 。
具體實施例方式本發明方法所採用儀器包括1. 10 μ 1,100 μ 1,200 μ 1 及 1000 μ 1 單通道可調移液器，10 μ 1,200 μ 1 八通道可
調移液器各一把2. Luminex 100分析儀及配套設備，Luminex version 1. 7以上版本軟體3. PCR 儀(PTC-100，Bio-Rad 公司)、電泳儀，電泳槽4.高速離心機，配備96孔板水平轉頭5.水浴鍋實施例1B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針的確定本發明利用生物信息學確定B肝病毒拉米夫定耐藥位點如表1所示，在HBV的RT 區180位、204位及其附近的核苷酸序列。表1構建的HBV全基因質粒RT區180位、204位及其附近的核苷酸序列
權利要求
B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針，其特徵在於，所述的檢測探針是SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ IDNO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種。
2.如權利要求1所述的檢測探針，其特徵在於，該探針由SEQID NO 12,SEQ ID NO 13、 SEQ ID NO 14 中的一種或者幾種和 SEQ ID NO 15,SEQ ID N016、SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種組成。
3.如權利要求1所述的檢測探針，其特徵在於，該探針由SEQID NO 12,SEQ ID NO 13、 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19八種寡核苷酸分子組成。
4.權利要求1所述檢測探針的應用，其特徵在於，將該檢測探針用於確定B肝病毒拉 米夫定耐藥變異株。
5.權利要求1所述檢測探針的應用方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟(1)將探針與微球結合；(2)擴增樣本核酸序列中拉米夫定耐藥位點；(3)將(1)所得的產物與(2)的產物雜交，根據雜交反應結果判斷樣本的拉米夫定耐藥性。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，探針中每一種特定寡聚核苷酸與特定微球結合。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中採用聚合酶鏈反應進行擴增。
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中根據雜交後微球所上探針的種類 和數量判斷樣本的拉米夫定耐藥性。
9.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的拉米夫定耐藥位點是HBVRT區的第 180位或者第250位胺基酸殘基。
全文摘要
本發明屬醫學領域，涉及B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針及其應用方法。本發明的B肝病毒拉米夫定耐藥變異株的檢測探針，是SEQ ID NO12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQIDNO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一種或者幾種。將本發明的檢測探針與液相晶片技術結合，可以快速、準確確定樣本的B肝病毒拉米夫定耐藥性，特異性高、靈敏度好、檢測通量大，大大節約了確定耐藥變異株種類所需的成本。
文檔編號C12R1/93GK101988130SQ20091005583
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月3日 優先權日2009年8月3日
發明者劉紅豔, 夏佳慧, 尹永喜, 張繼明, 李義良, 李新豔, 毛日成, 範麗麗 申請人:復旦大學附屬華山醫院