血管緊張素Ⅱ化學發光免疫定量檢測試劑盒及其製備方法
2023-04-23 22:55:06 1
專利名稱：血管緊張素Ⅱ化學發光免疫定量檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及免疫分析醫學領域，具體的涉及血管緊張素II (Ang II)化學發光免疫定量檢測試劑盒及其製備方法。
背景技術：
血管緊張素II (Angiotensin II，Ang II)是血管緊張素中最重要的組成部分，是由血管緊張素I在血管緊張素轉換酶的作用下形成的，是一種8肽物質。血管緊張素II與人體的血管平滑機、腎上腺皮質球狀帶細胞、心臟、腎臟器官的細胞上的血管緊張素受體結合，引起相應的生理效應。血管緊張素作用於血管平滑肌，可使全身微動脈收縮，動脈血壓升高。血管緊張素II是已知最強的縮血管活性物質之一。
血管緊張素II是一種可通過內分泌、自分泌/旁分泌以及胞內分泌發揮作用的激素。它具有強烈收縮血管的作用，全身微動脈收縮，外周阻力增加，血壓升高；靜脈收縮，回心血量增多。Ang II介導交感神經系統而促進去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)釋放,減少NE的再攝取，提高血管對NE的反應性，促進腎上腺釋放兒茶酚胺，從而加強心功能同時通過血管的外周作用而提升血壓。Ang II可強烈刺激腎上腺皮質球狀帶細胞合成和分泌醛固酮，後者促進遠曲小管和集合管重吸收氯化鈉及水並排鉀；此外，Ang II尚可直接刺激近球小管重吸收氯化鈉、刺激垂體後葉釋放抗利尿激素而增加水的重吸收；引起入球及出球小動脈收縮，導致腎小球血流量減少，濾過係數降低。故Ang II有調節水鹽平衡、保證循環血量、維持血壓和減少尿生成的作用。所以血漿中血管緊張素II含量的測定，可為多種高血壓和腎臟疾病的分型與診斷提供依據。目前，國內外對血管緊張素II的檢測較少，其中有放射免疫分析法，酶免法，化學發光法等。放射免疫分析法有放射性汙染、標記物半衰期短、對操作者具有放射性損傷等缺點。隨著標記免疫技術的迅速發展，各種新的檢測方法層出不窮，例如ELISA方法、時間分辨免疫分析法、免疫螢光法、化學發光發等。其中化學發光免疫分析法具有敏感性高、特異性強、檢測範圍廣、速度快等優點，越來越受到人們的關注。
發明內容
本發明要解決的問題是提供血管緊張素II的化學發光免疫定量檢測試劑盒及其製備方法，解決了靈敏度低，檢測範圍窄的缺陷。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種血管緊張素I化學發光免疫定量檢測試劑盒包括Ang II抗體包被板、辣根過氧化物酶標記的Ang II > Ang II校準品、Ang II質控品、發光液A液和B液、20倍濃縮洗液。。所述的血管緊張素II抗體包被板的固相載體為96孔或48孔的白色微孔板。所述的血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的辣根過氧化物酶純度要求RZ彡3. 0,活性彡250U/mL。所述的發光液A包含0. IgL魯米諾和0. 165gL對碘酚；發光液B包含0.675gL過氧化脲。所述的20倍濃縮洗液包括75. 5gL Tris, 120gL NaCl,5mL / L Tween-20, IgLProclin300o一種製備上述試劑盒的方法，包括以下步驟I) Ang II抗體包被板製備將Ang II抗體加到pH9. 6碳酸鹽緩衝液中混勻，在每個微孔板的孔中加IOOuL,於4°C冰箱中放置過夜，用洗滌液洗滌五次之後，用牛血清蛋白溶液對微孔板進行封閉，棄去孔內液體後，將酶標板乾燥，密封，即得經Ang II抗體包被的微孔板； 2)辣根過氧化物酶標記Ang II,得Ang II酶結合物；利用高碘酸鈉氧化法，將Ang II與辣根過氧化物酶連接在一起，形成經辣根過氧化物酶標記的Ang II ；
3) Ang II 校準品；將Ang II抗原用校準品稀釋液配製成不同濃度的校準品(濃度分別為0，20，50，150，400，1000pg/mL),分裝，貼標籤，儲存於2 8°C。4)Ang II質控品的配製在正常人血清中加入適量的Ang II純品，配製低值質控品(QcL)和高值質控品(QcH)，其濃度的平均值分別為78. 50pg/mL和492. 94pg/mL。5)配製發光液A液和B液；A 液是含有 0. 7g / L 魯米諾和 0. 165g / L 對碘酚的 pH8. 6 的 5mmol / LTris .HCl緩衝液為液是濃度為0. 675g / L的過氧化脲，用工藝用水配製。6)配製20倍濃縮洗液；20倍濃縮洗液的配方如下75. 5gL Tris, 120g / L NaCl，5mL / L Tween-20, Ig /LProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存於2 8V ;其中包含發光液A、發光液B、20倍濃縮洗液、Ang II酶結合物各I瓶，Ang II抗體包被板I塊，Ang II校準品6瓶、Ang II質控品2瓶。8)對採用該方法製得的試劑盒進行物理檢查，準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品測定值和穩定性進行測定；進一步所述的包被板為包被含有Ang II抗體的96孔或48孔白色微孔板。本發明方法製備的試劑盒採用如下具體形式，其包括Ang II抗體包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根過氧化物酶標記的Ang II、不同濃度的Ang II校準品、發光底液A為魯米諾和對碘酚、發光底液B為過氧化脲、20倍濃縮洗液為配方為75. 5g / L Tris，120g /L NaCl,5mL / L Tween-20, Ig / LProclin300oProClin300以其廣譜活性、優越的兼容性和穩定性及其在使用濃度下的低毒性，ProClin300成為用於診斷試劑的理想高效防腐劑。Proclin300防腐劑可在更長的時間內根除細菌、真菌及酵母，從而延長產品的儲存時間。其水溶性確保其可輕易溶入所需試劑中。特別是，ProClin300防腐對大多數的酶或抗體交聯反應的功能無影響，所以不會干擾檢驗指示劑。本專利發明的血管緊張素II定量檢測試劑盒，採用目前最為敏感的免疫測定方法——化學發光免疫分析技術，具有以下有點(1)本產品分析靈敏度不高於0. 05pg / mL；
(2)本產品的特異性良好，與血管緊張素I及血管緊張素1-7的交叉特異性均小於1%。(3)精密度良好，批內精密度不高於15%，批間精密度不高於20%。(4)穩定性良好，本產品在37°C可存放7天以上，在疒8°C可存放I年。(5)特異性強，反應快速，可在65分鐘內判斷檢測結果，操作簡便，安全無環境汙染。此外，本發明還具有檢測樣品的濃度範圍寬、試劑有效期長、穩定性好、等優點。性能優於國內同類產品，達到了國際先進水平，成本較國外的產品低。
圖I是本發明的博奧賽斯化學發光試劑盒測定Ang II與放免試劑盒測定Ang II的測定結果比較圖，其中縱坐標為博奧賽斯測得的Ang II值，橫坐標為放免試劑盒測定Ang II值，兩種方法相關係數(r) =0. 9754，直線方程y=0. 9861x_0. 2961。
具體實施例方式實施例I :製備血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括 Ang II抗體包被板、辣根過氧化物酶標記的Ang II、Ang II校準品、Ang II質控品、發光液A液和B液、20倍濃縮洗液。通過下述方法製備血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒I)包被將Ang II抗體加到pH=9. 6碳酸鹽緩衝液中混勻，在每個微孔板的孔中加IOOuL,於4°C冰箱中放置過夜，用洗滌液洗滌五次之後，用牛血清蛋白溶液對微孔板進行封閉，棄去孔內液體後，將酶標板乾燥，密封，即得經Ang II抗體包被的微孔板。2)利用高碘酸鈉氧化法，將Ang II與辣根過氧化物酶連接在一起，形成經辣根過氧化物酶標記的Ang II。3 ) Ang II校準品的配製將Ang II抗原用校準品稀釋液配製成不同濃度的校準品(濃度分別為0，20，50，150，400，1000pg/mL),分裝，貼標籤，儲存於2 8°C。4)Ang II質控品的配製在正常人血清中加入適量的Ang II純品，配製低值質控品(QcL)和高值質控品(QcH)，其濃度的平均值分別為78. 50pg/mL和492. 94pg/mL。5 )配製發光液A液和B液；A 液是含有 0. 7g / L 魯米諾和 0. 165g / L 對碘酚的 pH8. 6 的 5mmol / LTris .HCl緩衝液為液是濃度為0. 675g / L的過氧化脲，用工藝用水配製。6)配製20倍濃縮洗液；20 倍濃縮洗液的配製方法如下75. 5g / L Tris, 120gL NaCl，5mL / LTween-20，lgLProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存於2 8°C ;其中包含發光液A、發光液B、20倍濃縮洗液、Ang II酶結合物各I瓶，Ang II抗體包被板I塊，Ang II校準品6瓶、Ang II質控品2瓶。8)對採用該方法製得的試劑盒進行物理檢查，準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品測定值和穩定性進行測定。說明指標檢測準確性試劑盒校準品與企業標準品系列同時進行分析測定，用Log(X)-Logit(Y)數學模型擬合，要求兩條劑量-反應曲線不明顯偏離平行(t檢驗，11|〈2. 447);以企業標準品為對照品，用Log(X)-Logit(Y)數學模型擬合，試劑盒校準品的實測值與標示值比值的平均值應在0. 90 1. 10範圍內。企業校準品的配製將高純度的Ang II用稀釋液(含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液)稀釋為系列梯度，經WHO標準品(NIBSC編號86/538)標定，其濃度分別為20、50、150、400、1000pg/mL，並以不含Ang II的稀釋液作為零值對照。劑量-反應曲線的線性用Log(X)-Logit(Y)數學模型擬合，劑量-反應曲線在(Tl2ng/mL濃度範圍內相關係數r絕對值不低於0. 9900。分析靈敏度分析靈敏度不高於0. 05ng/mL。精密度批內不精密度(CV%)應不高於15.0%;批間不精密度(CV%)應不高於20. 0%。
質控品測定值平行測定10孔高值和低值的質控品，用Log(X)-Logit(Y)數學模型擬合，質控品測值應在允許範圍內，QcL和QcH的允許範圍分別為62. 80 94. 21pg/mL和394. 36 591. 53pg/mL。特異性交叉反應應符合下表要求。
權利要求
1.血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括:AngII抗體包被板、辣根過氧化物酶標記的Ang II、Ang II校準品、Ang II質控品、發光液A液和B液、20倍濃縮洗液。
2.根據權利要求I所述 的血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的血管緊張素II抗體包被板為包被含有Ang II抗體的96孔或48孔白色微孔板。
3.根據權利要求I所述的血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的辣根過氧化物 酶純度要求RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根據權利要求I所述的所述的血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的Ang II質控品包括低值質控品和聞質質控品兩種，其中低值質控品的濃度範圍是62. 80 94. 21pg/mL,高質質控品的濃度範圍是394. 36 591. 53pg/mL。
5.根據權利要求I所述的血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的發光液A包含0. 7g / L魯米諾和0. 165gL對碘酚；發光液B包含0. 675g / L過氧化脲。
6.根據權利要求I所述的血管緊張素II化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的 20 倍濃縮洗液包括 75. 5g / L Tris，120g/L NaCl,5mL / LTween-20，Ig /LProclin300o
7.一種製備所述權利要求I的試劑盒的方法，其特徵在於包括以下步驟 1)Ang II抗體包被板製備 將Ang II抗體加到pH9. 6碳酸鹽緩衝液中混勻，在每個微孔板的孔中加IOOuL,於4°C冰箱中放置過夜，用洗滌液洗滌五次之後，用牛血清蛋白溶液對微孔板進行封閉，棄去孔內液體後，將酶標板乾燥，密封，即得經Ang II抗體包被的微孔板； 2)辣根過氧化物酶標記AngII,得Ang II酶結合物 利用高碘酸鈉氧化法，將Ang II與辣根過氧化物酶連接在一起，形成經辣根過氧化物酶標記的Ang II ； 3)Ang II校準品 將Ang II抗原用校準品稀釋液配製成不同濃度的校準品，濃度分別為0，20，50，150，·400，1000pg/mL,分裝，貼標籤，儲存於2 8°C ； 4)AngII質控品的配製在正常人血清中加入適量的Ang II純品，配製低值質控品和高值質控品，其濃度的平均值分別為78. 50pg/mL和492. 94pg/mL ； 5)配製發光液A液和B液 A液是含有0. 7g / L魯米諾和0. 165g / L對碘酚的pH8. 6的5mmol / LTris *HC1緩衝液為液是濃度為0. 675g / L的過氧化脲，用工藝用水配製； 6)配製20倍濃縮洗液 ·20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g / L NaCl,5mL / L Tween-20,1g/LProclin300 ； 7)組裝 將上述試劑組裝成盒，儲存於2 8°C ; 8)對採用該方法製得的試劑盒進行物理檢查，準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品測定值和穩定性進行測定。
8.根據權利要求7所述的試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述的包被板為包被含有有Ang II抗體的96孔或48孔白色微孔板。
全文摘要
本發明公開了一種血管緊張素Ⅱ化學發光免疫定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括AngII抗體包被板、辣根過氧化物酶標記的AngII、AngII校準品、AngⅡ質控品、發光液A液和B液、20倍濃縮洗液。另外本發明還公開了一種血管緊張素Ⅱ化學發光免疫定量檢測試劑盒的製備方法。本發明試劑盒與現有試劑盒相比操作簡便，安全無環境汙染。此外，本發明還具有檢測樣品的濃度範圍寬、試劑有效期長、穩定性好等優點。
文檔編號G01N33/68GK102749455SQ20121021401
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月26日 優先權日2012年6月26日
發明者劉萍, 宋啟超, 張影, 範利花 申請人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司