一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法
2023-04-24 04:13:01
一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法
【專利摘要】本發明公開了一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法。該方法包括：獲得非人類生物針對某一抗原的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區序列；將其與人胚系抗體的胺基酸序列對比；分別選擇與非人源抗體重鏈可變區和輕鏈可變區同源性最高的人胚系抗體胺基酸序列；分別構建人胚系抗體重鏈和輕鏈可變區框架的文庫並組裝為完整的框架組裝文庫；表達所述的框架區組裝文庫，從中篩選能夠與所述的抗原結合的人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區，製備人源化重鏈可變區和輕鏈可變區的人源化抗體或抗原結合片段。本發明避免了在抗體工程化過程中對抗體結構分析的依賴，同時能夠對抗體的表達、穩定性進行篩選，能最大程度保持人源化抗體的親和力。
【專利說明】一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物免疫領域，涉及一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法。
[0002]發明背景
[0003]自從雜交瘤技術[1]建立後，人們生產並鑑定了大量鼠單克隆抗體(mAb)。其中很多被用於人類疾病的診斷，如癌症、傳染性疾病、自身免疫病和其它疾病。然而，由於其能在人類患者中廣泛引發人抗鼠抗體(HAMA)反應[2]，使其在治療上述疾病的臨床應用中受到限制。高達50%的患者在服用鼠雜交瘤來源的抗體後，發生了 HAMA反應[3]，這嚴重危及這些抗體藥物的安全性、功效和生物學半衰期。另外，鼠源抗體的恆定區也無法直接誘導人免疫效應器官產生治療效應。期望通過人雜交瘤技術[4]和人類皰疹病毒(EBV)介導B淋巴細胞轉化M來生產人用抗體的努力獲得有限的成功，其廣泛應用分別受到缺乏富有活力的人雜交瘤融合伴侶及EBV轉化克隆不穩定性的限制[6]。由於大量圍繞非人源抗體用於人的限制探討，多種轉化非人源抗體序列進入人源抗體序列並被稱為人源化的策略，被用於開發製造針對人類疾病的有效治療試劑。
[0004]鼠源抗體人源化的兩種主要方法為理論推理法(Rational method)和實驗設計法 (Empirical method)。抗體人源化的理論推理方法特徵為通過抗體結構建模、設計多種抗體突變體並評估其靶點結合力或其它功能特性。如果設計的突變體未產生所期許的結果， 則開始新一輪的設計和功能評估。推理方法包括但不局限於互補決定區(CDR)移植、表面重塑和表面人源化(super-humanization)及人遞呈肽段(human string content)優化等。在上述推理方法中，CDR移植是使用最廣泛的方法。使用CDR移植方法生產的人源化抗體，含有被移植到人源抗體框架區上的來自親本鼠源mAb的6個CDR的胺基酸序列。業已證實，人源化抗體中低含量(飛%)的非人源序列能有效降低人源化抗體在人體中的免疫原性及延長血清半衰期[7]。
[0005]遺憾的是， 單純的⑶R序列移植產生的抗體通常比親本鼠源mAb結合抗原能力弱， 有時候親和力降低高達幾百分之一 [8]。為了恢復人源化抗體的高親和力，必須進一步改造以優化其抗原結合區域的結構通常用來自親本鼠源抗體的匹配序列取代抗體可變區中框架區的關鍵胺基酸來實現。這些框架區胺基酸通常參與維持⑶R環構象，儘管某些框架區胺基酸本身也可直接與抗原接觸[9]，由此可見，由理論推理方法進行抗體人源化面臨著相當多的不確定因素。此外，由於該技術依賴結構生物學，這對於很多實驗室來說並不容易， 其廣泛應用亦受到限制。
[0006]與推理方法相比，實驗法不需要抗體的結構信息，其依賴大庫容文庫的構建和富集淘篩技術如噬菌體展示、核糖體展示，酵母菌展示或通過高通量篩選技術等。這些實驗方法依賴於篩選技術而非推測突變對抗體結構的影響，包括但不限於構建框架區文庫、靶向淘篩、框架區置換和抗體人源化工程(humaneering)。然而，這些方法的成功主要依賴於大容量文庫的構建，因為大容量的抗體庫更容易分離高親和力抗體。
[0007]因此，抗體人源化需要一種更好的方法。本發明中將闡述一種新的人源化方法和利用該方法產生的人源化抗體。
【發明內容】
[0008]本發明針對現有技術的上述不足，提供一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法。
[0009]本發明的另一目的是提供利用該方法製備的人源化抗體或抗原結合片段。
[0010]本發明的又一目的是提供含有該人源化抗體或抗原結合片段的組合物。
[0011]本發明的目的可通過如下技術方案實現:
[0012]本文闡述了一種新穎的人源化方法，該法避免了對抗體結構研究及構建大容量文庫的要求相比以前的方法更能有效地產生人源化抗體。
[0013]一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法，包括:
[0014](I)獲得非人類生物針對某一抗原的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區序列，
[0015](2)將非人源抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列與人胚系抗體的胺基酸序列對比，
[0016](3)分別選擇與非人源抗體重鏈可變區和輕鏈可變區同源性最高的人胚系抗體胺基酸序列，
[0017](4)構建人胚系抗 體重鏈可變區框架的文庫，包含編碼多個重鏈可變區的核酸序列，其中每個重鏈可變區包含框架I (FR1)、框架2 (FR2)、框架3 (FR3)和框架4 (FR4)，所述的每一個核酸序列獨立地選自同源的人胚系抗體重鏈可變區的相應框架區和非人源抗體的互補決定區(⑶R)，
[0018](5)構建人胚系抗體輕鏈可變區框架的文庫，包含編碼多個輕鏈可變區的核酸序列，其中每個輕鏈可變區包含框架I (FR1)、框架2 (FR2)、框架3 (FR3)和框架4 (FR4)，每一個核酸序列獨立地選自同源的人胚系抗體輕鏈可變區的相應框架區和非人源抗體的互補決定區(CDR)，
[0019](6)將所述的人胚系抗體重鏈可變區框架文庫和輕鏈可變區框架文庫組裝為完整的框架組裝文庫，
[0020](7)表達所述的框架區組裝文庫，
[0021](8)從表達的框架組裝文庫中篩選能夠與所述的抗原結合的人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區，
[0022](9)製備包含人源化重鏈可變區和輕鏈可變區的人源化抗體或抗原結合片段。
[0023]所述的框架組裝文庫的表達和人源化重鏈可變區和人源化輕鏈可變區的篩選通過噬菌體展示技術進行。在本發明中，框架區組合文庫被表達後通過噬菌體展示篩選人源化的抗體可變區，兩輪或更多輪為好。
[0024]在本發明的所選用的具體操作中，不止一個的人源化抗體重鏈可變區、輕鏈可變區從框架區組合庫中篩出；該方法還包括從宿主細胞中篩選出高表達量的人源化抗體重鏈可變區、輕鏈可變區。
[0025]在本發明的所選用的具體操作中，至少一個人源化的重鏈可變區和人源化的輕鏈可變區在宿主細胞中具有高表達水平，即表達量>5mg/L。
[0026]在本發明的所選用的具體操作中，不止一個的人源化抗體重鏈可變區、輕鏈可變區用於FASEBA系統(表達、生物物理性質和親和力快速篩選系統，Fast Screen for Expression, Biophysical-properties and Affinity system)篩選。
[0027]本發明具體實施例包含嚙齒類動物抗體的人源化，特別是鼠源抗體的人源化。
[0028]與人源化抗體相關的本發明的其它方面或根據本發明實施例而產生的抗原結合片段，也包括使用該抗體和片段的方法。
[0029]有益效果:本發明避免了在抗體工程化過程中對抗體結構分析的依賴，同時能夠對抗體的表達、穩定性進行篩選，極大程度提高抗體人源化的成功率，並能最大程度保持人源化抗體的親和力。
[0030]本發明的其它方面特徵，優勢從下列描述來說是不言自明的，包括本發明的詳細描述，首選實施例和附加的要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1.用標準單字母密碼給出aM可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)的胺基酸序列。下劃線是如Kabat等定義的CDR1、2和3區。c為常規殘基；s為體細胞突變；r為稀有殘基；v為微調區殘基。 [0032]圖2.用於產生框架區組裝庫的PCR策略。
[0033]圖3.用於構建框架區組裝庫的噬菌粒載體。將\和Vh基因插入LacZ啟動子控制下的載體。然後分別在含人IgGl重鏈第一恆定區和人K輕鏈恆定區的框架內表達
八基因。
[0034]圖4.首次噬菌體展示篩選。對C-Myc肽進行兩輪噬菌體展示淘選。在每輪淘選後， 從洗脫的噬菌體合併物中隨機挑選約100株噬菌體克隆。擴增每一株噬菌體克隆，ELISA測定其與C-Myc的結合。
[0035]圖5.親和力排序。A.FASEBA載體的初始結構，其含有捕獲標籤(BSA12)和檢測標籤(His標籤)。BSA12能夠以高親和力結合BSA。可通過BSA12和BSA之間的相互作用將 BSAl2-融合蛋白捕獲到BSA-包被的固態表面，例如ELISA板上。可易於通過用抗His-標籤抗體測定捕獲在ELISA板上的BSA12融合蛋白的量。B.來自FASEBA庫的Fab克隆的親和分級。將BSA固定在CM-5傳感器晶片的表面上。然後將待捕獲的Fab-BSA12融合蛋白注入晶片表面。注入含c-Myc的重組蛋白，記錄SPR圖譜。用BIA評估3.0軟體分析不同 Fab-BSA12蛋白的SPR數據。
[0036]圖6.可溶性人源化Fab的表徵。A.可溶性Fab與抗原的結合能力的ELISA分析。 B.Fab的SRP圖譜的測定。非紅色線代表真實的SPR圖譜，而紅色線代表其1:1擬合曲線。
[0037]圖7.通過ELISA進行人化評估。將純化的鼠和人源化Fab包被在ELISA板上。洗滌和封閉後，通過山羊抗人IgG/HRP檢測結合在板上的Fab。在450nm處測量OD值。
[0038]圖8.篩選得到的克隆與野生型表達水平的對比。在所檢測的約1，000株克隆中， 720株克隆顯示出比野生型Fab克隆(橫線表示野生型表達水平)更高的表達水平。
【具體實施方式】
[0039]本發明從分析待人源化的親本單克隆抗體的序列信息開始，通過大量人源序列比對,從大部分同源的人類種系抗體序列中選擇框架區序列建模。將重組後人類種系框架區與原始鼠源⑶R重組構建噬菌體展示文庫。然後通過噬菌體展示技術篩選與抗原高親結合的卩遼菌體克隆。接著用 FASEBA(Fast Screening for Expression, Biophysical-proper ties and Affinity,快速篩選表達、生物物理學性質和親和力)系統進行淘選後曬菌體庫的表達篩選。FASEBA系統是種專利技術平臺(參考文獻:W02011020183 ；US20120178110), 其能夠以高通量方式篩選針對靶點的高表達水平、高生物物理學性質和高親和力抗體。經 FASEBA系統篩選後,採用親和力排序(affinity ranking)來進一步分離對抗原具有高親和力的抗體。
[0040]實施例1
[0041]1.1.親本單克隆抗體的克隆及序列測定
[0042]抗c-Myc多肽的鼠源雜交瘤單克隆抗體樣品來源於GenScript Inc (貨號 RP11731)。該鼠源mAb在下文中簡稱為aM。
[0043]使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)從 aM 雜交瘤細胞 aM 中提取總 RNA。使用Omniscript反轉錄試劑盒(QIAGEN, Shanghai, China)反轉錄產生cDNA。以得到的cDNA 為模板，通過如下引物PCR擴增aM的V1^P'基因:用於'基因擴增的正向引物為5』-TT ATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC-3』 (SEQ ID N0.1)，反向引物為 5』-GGTGCAGCCACCGTACGITTGAITT C-3』(SEQ ID N0.2);用於丫11基因擴增的正向引物為 5』-CATGGCCGAGGTGCAGCTGGCTAGC_3』(S EQ ID N0.3)，反向引物為 5』-TGCGGCCCCAITTGCGGCCGCAGAG-3』 (SEQ ID N0.4)。隨後將 Vh 和\基因的PCR產物克隆到pUC57-T載體(GenScript)中並測序。
[0044]1.2.人框架區序列的選擇
[0045]為選擇用於aM人源化的人Vh和\框架區，分別對aM的Vh和\胺基酸序列進行 IRBlast (www.1MGT.0rR)分析。基於其與鼠源aM框架區的最高序列同源性選擇人重鏈和輕鏈框架區基因序列。
[0046]1.3.人源框架區組裝庫的構建
[0047]首先，分別對選 擇的人源Vh框架區和\框架區構建文庫，然後將其構建為組裝到噬菌粒載體中的Fab框架區組裝文庫。為了構建人源性Vh框架區文庫，分別PCR合成FRl、 FR2、FR3和FR4，4個人源抗體框架區序列。然後，通過重疊PCR法將FRl、FR2、FR3和FR4 擴增產物混合，退火形成完整的Vh片段。Vh基因的重疊PCR擴增策略如圖2所示。構建人源性\框架區文庫的方法與構建人源性Vh框架區文庫的方法相同。用於構建Vh和\框架區文庫的引物詳見表1，具體實驗外包至GeneArt公司進行。
[0048]1.4.將V區克隆到噬菌粒載體
[0049]使用SfiI酶切上一步PCR擴增的人源性片段，並將其分別連接到 GenScript Inc.設計的噬菌粒載體(噬菌粒載體全序列為SEQ ID N0.9)中，以產生人源性 Fab噬菌體展示文庫。該載體插入Vh和\序列後，可在LacZ啟動子調控下表達Fab片段 (圖3)，所述Fab片段含有人重鏈的第一恆定區(hIgGlCHl)和人輕鏈的恆定區(hlgKCj。
[0050]轉化感受態細胞TGl (購自Stratagene公司)後，讓含有噬菌體庫的細菌在37°C， 含IOOii g/ml氨卞青黴素和25ii g/ml卡那黴素的液體培養基中培養，並通過輔助噬菌體 (M13K07)(購自NEB，目錄號N0315S)侵染拯救噬菌粒包裝phage的能力。通過向離心收集的培養物上清液中加入0.2體積的聚乙二醇(PEG) 8000和2.5M NaCl，沉澱噬菌體，並將其重懸於PBS中。
[0051]1.5.卩遼菌體展不庫淘選[0052]抗原(c-Myc多肽(序列為EQKLISEEDLEQKLISEEDL由P印scan公司合成)生物素化處理後，固定在用鏈黴親和素預包被的微孔板上。然後用2%(w/v)脫脂奶粉的PBS(2%MPBS) 封閉抗原包被板。將含IO11個曬菌體的曬菌體庫加入抗原包被板中，室溫孵育2小時。棄孵育物，用含0.l%Tween20的PBS (PBS-T)洗滌10 - 20次，接著用PBS洗滌10~20次，除去未結合與非特異結合的噬菌體。隨後使用100 ill的IOOmM三乙胺(TEA)孵育10分鐘，洗脫與抗原結合的噬菌體，接著立即用50iU的IM Tris-HCl, pH7.5中和收集的洗脫產物。用洗脫的噬菌體侵染對數生長期TGl大腸桿菌(Stratagene)，37°C靜置培養30分鐘。將侵染後的細胞均勻塗布在含氨卞青黴素(100 ii g/ml)，葡萄糖(l%w/v)的TYE固體平板上，37°C 孵育過夜。挑取噬菌體侵染的單克隆，在96-孔板中培養以擴增噬菌體顆粒。添加M13K07 輔助噬菌體拯救噬菌粒包裝phage的能力。通過ELISA方法檢測噬菌體與抗原結合能力， 或在相似條件下擴增淘篩後噬菌體並開始隨後輪次的篩選。通常進行兩輪淘篩。
[0053]1.6.嗤菌體ELISA篩選
[0054]為了檢測篩選克隆的抗原識別能力，使用IOy g/ml抗原c-Myc多肽包被微孔板。 經4°C過夜孵育後，用2%MPBS室溫封閉I小時，接著用PBS洗滌3次。用4%MPBS將所淘篩的噬菌體培養上清稀釋1:2後，加到各包被抗原孔中，室溫孵育I小時。用PBS-T將板洗滌 3次，再用PBS洗滌3次，接著加入1: 5，000稀釋到2%MPBS中的小鼠抗M13噬菌體-辣根過氧化物酶(HRP)結合物(GE Healthcare, Uppsala, Sweden),室溫孵育I小時。用PBST洗滌板3次，接著將IOOiU四甲基聯苯胺(TMB)溶液加入到各孔中，孵育15分鐘。最後加入 100 ill的IM硫酸終止反應。通過在ELISA讀數器中檢測450nm處的吸收光值記錄ELISA 讀數。
[0055]1.7.表達量篩選
[0056]在大腸桿菌TGl細胞中擴增從淘篩獲得的噬菌體，隨後製備噬菌粒，將噬菌粒載體中的Fab片段亞克隆到FASEBA載體(參考文獻:W02011020183)中用於隨後的表達篩選。 該載體可將表達抗體與BSA12融合表達，BSA12為駱駝單域抗體，其能與BSA以4pM的高親和力結合(圖5A)。
[0057]隨後將含Fab-BSA12_His片段的FASEBA載體，轉化到大腸桿菌TGl中用於可溶性表達。將過夜培養的大腸桿菌培養物，1:10轉接到含2%葡萄糖的2x YT培養基中，並在 30°C培養I小時。然後中速離心收穫細菌沉澱並重懸於含ImM IPTG，無葡萄糖等體積的新鮮2x YT培養基中，過夜振蕩培養。離心收集含Fab的培養物上清液。
[0058]從各孔轉移IOOul上清`液到用3%BSA包被的對應ELISA板孔中。由於BSA12和 BSA之間的高親作用Fab被捕獲到ELISA板上。然後利用ELISA檢測法，通過山羊抗His標籤抗體測定捕獲的Fab的量。
[0059]1.8.親和分級和動力學分析
[0060]通過BIAcore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)表面等離子共振技術測量人源化Fab變構體和親本抗體與抗原的結合親和力。從GE Healthcare購買研究級的CM5 傳感器晶片和胺偶聯試劑盒用於親和分級。將BSA固定到CM5晶片上，用於親和分級分析。 用含c-Myc標籤的重組蛋白作為抗原用於親和篩選和檢測。通過BSA12與BSA的相互作用， 在包被BSA的晶片表面捕獲Fab-BSA12融合蛋白。然後以30 y 1/min的流速將c_Myc抗原注入Fab表面(結合I分鐘，解離5分鐘)。[0061]為了準確分析純化的Fab，將含c-Myc的重組蛋白固定到傳感器晶片上。通過注入各種濃度的可溶性Fab施行結合測定。在每一次結合測量後，用20 ill的IOmM甘氨酸-鹽酸(PH1.5)以20iil/min的流速去除殘留的Fab。用BIA評估軟體3.0 (GE Healthcare, Uppsala Sweden)將每一數據集擬合到簡單的1:1Langmuir結合模型中。
[0062]1.9.通過Z記分分析及ELISA評估「人源化(humanness) 」
[0063]Abhinandan和Martin (10)提出了評估抗體序列「人源化程度」的方法，所述方法提供了可幫助預測免疫原性的工具。Z記分為最終界定序列在人源譜中同源性的檢測方法。 我們通過基於該網站(http://www.bioinf.0rR.uk/abs/shab/)的服務,將我們的人源化 Fab序列(Vh和\)的Z記分與原始鼠源aM_VH和\序列的Z記分進行了比較。
[0064]ELISA測定，將親本鼠源或人源化Fabs直接包被在ELISA板上。用PBS徹底洗滌後，用山羊抗人IgG/HRP來測定ELISA板上吸附的Fab的量。通過用酶標儀檢測450nm處吸光值來記錄ELISA讀數。
[0065]2.結果
[0066]2.1.aM Vh 和 Vl 的序列
[0067]選擇得到的人aM基因重鏈框架區基因序列如SEQ ID N0.5,人aM基因輕鏈框架區基因序列如SEQ ID N0.6,人aM基因重鏈框架區胺基酸序列如SEQ ID N0.7,人aM基因輕鏈框架區胺基酸序列如SEQ ID N0.8。
[0068]根據參考文獻[11- 14]測定了 aM的關鍵胺基酸殘基，包括常規殘基、體細胞突變、 稀有殘基和微調區殘基，並標不在圖1中。基於Kabat等的方法[15]確定抗體的CDR和殘
基數量。
[0069]2.2.框架區選擇
[0070]為了選擇適合人可變區的框架區，利用IgBlast搜索法，分別將aM V1^P Vl的胺基酸序列在IMGT資料庫(http://www.1mgt.0rg/vquest/refseqh.html)中與人源抗體序列全譜比對。為排除體細胞突變的潛在免疫原性，我們用種系序列而不是非種系序列作為模板。按照與親本鼠源抗體序列同一性排列人抗體序列。我們獨立選擇與親本鼠源抗體顯示最高序列同源性的多種種系模板，從該列表中排除具有與親本鼠源抗體CDR長度不同的人源序列。進一步排除含有以下情況的序列:(a)罕見的脯氨酸(將剛性引入多肽鏈中)；(b) 半胱氨酸(引入潛在氧化性損傷)殘基；和(C)潛在的N-糖基化位點。通過核對上述所有數據並比較每一錯配殘基對保守性的改變，，分別選擇了 4個人Vh種系和15個人'種系序列作為最佳候選序列。這些序列分別是:重鏈IGVH7-4-101、IGVH7-4-102、IGVH7-4-103 和 IGVH7-81-01 ;輕鏈 IGKV2-3002、IGKV2D-2902、IGKV2-300U IGKV2-2903、IGKV2-2902、 IGKV2-2401、 IGKV2D-2901、 IGKV2D-3001、 IGKV2D-2401、 IGKV2D-2801、 IGKV2-2801、 IGKV2D-400U IGKV2-400U IGKV2D-2601 和 IGKV2D-2602。
[0071]2.3.框架區組裝庫的構建
[0072]在所選擇的15種八種系中，有10種不同的FR1、7種不同的FR2和5種不同的 FR3。所有 '種系中的FR4都相同。在所選擇的4種Vh種系中，有2種不同的FRl、兩種不同的FR2和4種不同的FR3。所有Vh種系的FR4都相同，各FR片段的序列如表5所示。
[0073]用表1所列引物PCR擴增所有￥11和八基因的FR片段。每一個八或Vh的FR與aM ⑶Rs隨機組裝，多個FRs與⑶Rs的隨機組裝共同產生了 '/Vh框架區組裝庫。\框架區庫多樣性為350 (10x7x5)，Vh庫的多樣性為16 (2x2x4)。將Vh和\庫有序地組裝到噬菌粒載體中，產生多樣性達5，600種不同克隆的Fab噬菌體展示庫(圖2和圖3)。通過單次轉化， 我們獲得5xl06個克隆，其約為理論庫容大小的1000倍，足以覆蓋整個文庫的多樣性。
[0074]2.4.首次噬菌體展示篩選
[0075]在c-Myc肽包被的微孔板上淘篩構建的aM框架組裝噬菌體庫。共進行兩輪淘選。 每輪淘選後，挑出約100株噬菌體克隆進行ELISA測定，以評估其結合c-Myc肽的能力。第一輪篩選的噬菌體ELISA檢測的平均OD值約為0.45，第2輪約為0.95 (圖4)，這表明通過兩輪淘選使c-Myc特異性的噬菌體得到富集。
[0076]2.5.第二次表達篩選
[0077]為了進一步篩選在大腸桿菌中具有高表達水平的Fab克隆，將第2輪淘選後獲得的噬菌體展示庫的Fab片段亞克隆到FASEBA載體中用於表達篩選(圖5A)。
[0078]用BSA包被微孔板，用於FASEBA篩選。然後將含Fab_BSA12融合蛋白的細胞培養物上清液加到對應孔中，室溫孵育I小時。洗滌微孔板後，加入抗His IgG/HRP室溫孵育以測定捕獲在微孔板上的Fab。經TMB顯色並終止後，測量0D450吸光值。
[0079]在所檢測的約1,000株克隆中，720株克隆顯示出比野生型Fab克隆(如圖8所示，橫線表示野生型表達水平)更高的表達水平。在這720株克隆中，選擇表達水平最高的 40株用於親和分級檢測。
[0080]2.6.親和力分級
[0081]將來自FASEBA篩選表達的可溶性Fab蛋白注入到用BSA預包被的CM5傳感器晶片表面，用於親和分級。由於BSA和BSA12之間的高親作用，與BSA12融合表達的F ab被捕獲在CM5晶片上。注入不同濃度的抗原，隨後記錄並分析Fab和抗原之間的作用圖譜(圖 5B)。通過檢測40株高表達量的Fab-BSA12克隆，發現其中大部分人源化的Fab比親本鼠源Fab展現出更高的親和力。具有最高親和力的10株Fab克隆其親和分級結果見圖5B。
[0082]為了精確測量這10株Fab克隆的親和力，將與其相連的BSA12蛋白標籤去除。在大腸桿菌中分別表達並純化這10株可溶性的Fab，接著用ELISA測定其與抗原的結合能力。在所檢測的10株Fab克隆中，5株克隆在相同蛋白濃度時顯示出比親本鼠源Fab更高的ELISA讀數(圖6A)。
[0083]2.7.動力學分析
[0084]通過SPR進一步表徵由ELISA確定的與抗原結合最強的10個Fab蛋白。分別將待檢測的Fab蛋白以80、40、20、10、5nM5種濃度溶解在IxHBS-EP中，隨後分別注入預固定抗原的晶片表面，監測解離相持續6分鐘，結果見圖6B。所檢測的所有Fab均顯示出良好的 1:1Langmuir擬合。人源化Fab和親本鼠源Fab的動力學數據見表2。計算的人源化變體的Kd比親本Fab低3-7倍。上述結果表明，人源化Fab變體比親本抗體具有更高的結合親和力。
[0085]2.8.人源化評估
[0086]為了評估人源化Fab的人源化程度，我們比較了人源化Fab胺基酸序列與人源種系序列(表3)。表3中的數據明確顯示，5株人源化Fab克隆均顯示出比親本鼠源抗體更高的與人類種系抗體序列同一性。Vh序列與其最接近的人種系序列的序列同一性增加 15.3^18.4%，而\序列與其最接近的人種系序列的序列同一性增加4.(T8.0%。[0087]近來,Abhinandan和Martint提出將Z記分作為評估抗體人源化的工具[1°]。Z記分被界定為評估一條序列具有人源譜序列程度的量度指標。Z記分為0代表該序列具有與人序列譜的平均相似性。正Z記分代表該序列顯示比人序列譜平均程度更高的人序列同源性，負Z記分代表該序列具有較不典型的人源特性。
[0088]親本鼠源Fab (WT)和人源化Fab的Z記分結果列於表4中。人源化Fab的Vh和 'Z記分低於親本鼠源抗體，這顯示增加了人源化Fab的人源化程度。值得注意的是，人源化Fab Vh的Z記分比VL的Z記分低。
[0089]我們進一步應用ELISA檢測試驗評估抗體的人源化。我們提出的假設是，如果一個抗體含有更多人源化胺基酸殘基，它就更容易被抗人抗體識別。在此假設基礎上，我們將純化的親本鼠源和人源化後的Fab蛋白分別包被在ELISA板上。然後通過兔抗人IgG/HRP 檢測直接包被在板上的Fab。ELISA讀數與工程抗體的人源化程度相關(圖7)。結果顯示在所檢測的克隆中，冊、118、11、附3和N14具有比親本鼠源Fab(WT)更高的OD值，這顯示這些Fab含有更多能被抗人抗體識別的人源化胺基酸。上述數據與在Z記分分析中獲得的結果一致。
[0090]3.結論和討論
[0091]抗體人源化是抗體藥物開發的核心技術。儘管幾十年前就產生了第一個人源化抗體，但抗體人源化仍面臨著諸多技術挑戰。
[0092]如前所述，目前主要有兩類人源化方法，即推理方法和實驗方法。推理方法通常包括設計人源化抗體變體以檢測結合或其它感興趣的性質。如果設計的變體被證明不適合， 則開始新一輪的設計流程和結合評估。設計流程中成功的關鍵因素是將特異性從給定的非人源抗體轉移到人源抗體過程中，待靶向的殘基間結構及物理化學相容性。另一種人源化方法為實驗方法，該方法的成功依賴於大抗體庫的產生。
[0093]為了克服在常規推理方法和實驗方法中經常出現的問題，本發明研發出新的策略以產生人源化抗體。命名為框架區組裝使抗體人源化的本發明方法，不需要抗體結構知識， 從而避免推理方法的不確定性。同時，本發明方法不需要大容量的抗體文庫。在實際工作中，框架區文庫多樣性僅含5，600株克隆，這很容易由單次轉化來覆蓋。因此，本方法比推理方法和實驗方法更簡單更有效。此外，在抗體人源化過程中，另一重要問題是完全或部分喪失親本抗體的親和力。在大多數情況下，抗體人源化改變了抗體的構象，因此導致人源化抗體的結構不穩定和表達水平低下。在本發明提呈的研究中，通過噬菌體展示、FASEBA系統和親和分級技術的聯合運用，從而篩選出具有比親本抗體更高抗原結合親和力和表達水平的人源化抗體。
`[0094]表達水平是評價人源化抗體的重要指標。抗體的高表達水平將大大降低抗體生產的下遊花費。FASEBA技術是我們開發用於篩選具有高效表達能力的人源化抗體克隆的關鍵技術。FASEBA載體具有兩個組分特色。一是BSA12單結構域抗體。BSA12能以極高的親和力與BSA結合。應用BSA12的這種特性將含BSA12的融合蛋白固定在包被BSA的檢測板上。FASEBA載體的另一特色組分是含有His檢測標籤。該標籤被來於評估捕獲在板上的與 BSA12融合表達的蛋白量。由於FASEBA淘篩是在微孔板上進行，這也使得表達水平的高通量篩選成為可能。
[0095]綜上所述，本文闡述的方法可作為其它抗體人源化的通用方法。
【權利要求】
1.一種生產人源化抗體或抗原結合片段的方法，包括:(1)獲得非人類生物針對某一抗原的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區序列，(2)將非人源抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列與人胚系抗體的胺基酸序列對比，(3)分別選擇與非人源抗體重鏈可變區和輕鏈可變區同源性最高的人胚系抗體胺基酸序列，(4)構建人胚系抗體重鏈可變區框架的文庫，包含編碼多個重鏈可變區的核酸序列，其中每個重鏈可變區包含框架1、框架2、框架3和框架4，所述的每一個核酸序列獨立地選自同源的人胚系抗體重鏈可變區的相應框架區和非人源抗體的互補決定區，(5)構建人胚系抗體輕鏈可變區框架的文庫，包含編碼多個輕鏈可變區的核酸序列，其中每個輕鏈可變區包含框架1、框架2、框架3和框架4，每一個核酸序列獨立地選自同源的人胚系抗體輕鏈可變區的相應框架區和非人源抗體的互補決定區，(6)將所述的人胚系抗體重鏈可變區框架文庫和輕鏈可變區框架文庫組裝為完整的框架組裝文庫，(7)表達所述的框架區組裝文庫，(8)從表達的框架組裝文庫中篩選能夠與所述的抗原結合的人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區，(9)製備包含人源化重鏈可變區和輕鏈可變區的人源化抗體或抗原結合片段。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的框架組裝文庫的表達和人源化重鏈可變區和人源化輕鏈可變區的篩選通過噬菌體展示技術進行。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於至少一個人源化的重鏈可變區和人源化的輕鏈可變區選自框架組裝文庫表達的蛋白。
4.根據權利要求3所述的方·法，其特徵在於至少一個人源化的重鏈可變區和人源化的輕鏈可變區在宿主細胞中表達水平>5mg/L。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於至少一個人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區通過表達、生物物理性質和親和力快速篩選系統進行篩選。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法製備的人源化抗體或抗原結合片段。
7.包含權利要求6所述的人源化抗體或抗原結合片段的組合物。
8.一種使用權利要求6所述的人源化抗體或抗原結合片段的方法，包括使所述人源化抗體或抗原結合片段與抗原接觸。
【文檔編號】C12N15/70GK103588876SQ201210292518
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月16日 優先權日:2012年8月16日
【發明者】張劍冰, 武術, 章方良 申請人:南京金斯瑞生物科技有限公司