製備重組人骨形態發生蛋白－7成熟肽二聚體的方法
2023-04-29 01:21:11 1
專利名稱：製備重組人骨形態發生蛋白－7成熟肽二聚體的方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物技術領域，具體說，涉及在原核細胞，尤其是在大腸桿菌中大量製備，並得到有高度生物學活性的重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體的方法背景技術骨科疾患是困擾人類的常見病，無論在平時的交通或工傷事故，還是在戰傷事件中都佔有很大比例。人類社會的老齡化，使得防治骨質疏鬆等因素造成的骨科疾病成為受到各方面嚴重關注的問題。而牙病更是貫穿人的一生的疾患，特別是經歷歲月的研磨，牙本質缺損帶來的苦痛，令人心悸。所以，在醫務工作者和製藥行業的迫切期待下，生物技術工作者已經在用新技術和新方法研製治療骨科與齒科疾病的藥物。
骨形態發生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是具有異位成骨作用的一種生長因子。自1965年美國的Urist發現BMP以來，迄今已經成功地克隆了19種左右的人BMP基因，為研製新的骨科治療藥物創造了條件。其中，BMP-7不僅有促使骨骼生長的作用，還有促進牙本質生長的功能。因此，它在骨科和牙科疾病的治療中有特殊的地位。
大量研究證明，在人細胞中BMP-7是以由431個胺基酸殘基組成的前肽原形式存在的。在其成熟過程中，這個前體分子被真核細胞的特殊裂解酶剪切為292個胺基酸殘基的前原區和139個胺基酸殘基的成熟肽片段。研究還發現，包括BMP-7在內的BMP蛋白必須形成同源或異源二聚體，並且只有它們的二聚體才有活性，單體是沒有生物學活性的。只有真核細胞才含有Furin酶，所以只有將全長的BMP-7基因轉染真核細胞，才能產生成熟的BMP-7蛋白質。迄今為止，用生物技術生產人BMP-7隻有在真核細胞系統中才獲得成功，使得製備這個產品的成本很高，產量也受到限制。如用原核生物系統製備出有生物活性的人BMP-7，就能大大地降低成本，簡便操作過程和提高產量，這是一個極其吸引人的研究課題。雖然早就有人，如我國著名的生物學家侯雲德先生等，首先在大腸桿菌中表達了人BMP-7的成熟肽，但是，所得到的是單體，而表現不出生物學活性。所以，只有用大腸桿菌產生出有生物活性的BMP-7成熟肽二聚體，才能實現大規模生產有治療作用的價廉的人BMP-7，滿足臨床治療的需要。
發明內容
本發明是要提供一種用大腸桿菌生產的有生物活性的重組人骨形態發生蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽二聚體的方法。
本發明提供的方法包括以下步驟1)編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質序列；2)構建含BMP-7基因的表達載體；3)將步驟2)中的表達載體轉入宿主細胞，形成能產生人BMP-7蛋白質的轉化細胞，並對其進行檢測；4)培養步驟3)中的轉化子細胞；5)用物理方法或化學試劑裂解細胞，抽提重組蛋白質，將單鏈BMP-7復性、分離、純化得到有生物活性的二聚體。
本發明編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列詳見SEQ ID NO.1，它具有SEQID NO.2蛋白質序列對於編碼rhBMP-7成熟肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在第一個胺基酸密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內切酶的識別位點，在最後一個胺基酸之後加上終止密碼子TAA和限制性內切酶的識別位點，將編碼rhBMP-7成熟肽的核苷酸序列中真核細胞喜好，而大腸桿菌完全不用或極少使用的密碼子改變為大腸桿菌喜好的密碼子，本發明中，加在合成基因首、末兩端的限制性內切酶識別位點可以是任意的II類限制性內切酶識別位點。
本發明中，可選用與BMP-7基因上加的識別位點具有相同的限制性內切酶識別位點的市售載體系統。
本發明中，術語「宿主細胞」為原核細胞，常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌，枯草桿菌等。
本發明中，用化學試劑裂解細胞的裂解液是5-7mol/L的鹽酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9。
本發明中將單鏈BMP-7復性所用的溶液為氧化還原劑——0.1-1mmol/L的氧化型穀胱甘肽/還原型穀胱甘肽；助溶劑——0.1-2mol/L的NaCl；金屬螯合劑——1-10mmol/L的EDTA和其他添加劑——0.5-5％左右的甘油，聚乙二醇等。
用本發明方法製備重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體，可大大降低成本，提高產量，操作簡便。
圖1為含有合成的人骨形態發生蛋白-7成熟肽基因的，IPTG誘導表達型載體(pET 11b-BMP-7)圖2為pET 11b-BMP-7的NdeI和BamHI兩個限制性內切酶酶切鑑定，圖中M為分子量標準，1-10為不同的樣品；A、B分別為500bp、250bp分子量大小，C為載體片段(5.7Kb)，D為插入的基因片段(423bp)圖3為重組人骨形態發生蛋白-7單體的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。圖中M為分子量標準(從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)，箭頭所指處為BMP-7單體。C為未經IPTG誘導的對照樣品，1-5為經IPTG誘導的樣品。
圖4為重組人骨形態發生蛋白-7二聚體的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。圖中5為分子量標準(從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)。1為純化後的BMP-7二聚體，2為BMP-7包涵體，3為誘導表達的BMP-7全菌蛋白，4為沒有插入目的基因的宿主菌蛋白，5為蛋白分子量標準，6為BMP-7復性蛋白，A為二體，B為單體。
圖5為在兩隻小鼠肌袋內植入重組人骨形態發生蛋白-7二聚體後形成的新骨。
具體實施例方式
以下具體實例僅用於說明本發明，而不用於限制本發明範圍。
本發明的製備重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，包括1)編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質序列；編碼rhBMP-7成熟肽核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在第一個密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內切酶的識別位點，在最後一個胺基酸密碼子之後加上終止密碼子TAA和限制性內切酶的識別位點；將編碼rhBMP-7成熟肽核苷酸序列中真核細胞喜好，而大腸桿菌完全不用或極少使用的密碼子改變為大腸桿菌喜好的密碼子，如脯氨酸的CCC；精氨酸的AGA，AGG和CGG；甘氨酸的GGA和GGG等加以改變，2)構建含BMP-7基因的表達載體；用表達載體pET-11b，將合成的BMP-7基因，(起始端含Nde I酶切位點，終止端含Bam HI酶切位點)，與pET-11b分別經Nde I和Bam HI雙酶切處理，酶切條件為37℃溫育3小時。然後將酶切產物用1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳20分鐘，電壓100伏。用Bio101凝膠回收DNA的試劑盒回收上述兩個DNA片段。其過程為用乾淨手術刀切下目的片段，分別放入兩個1.5毫升離心管中。加200～500微升Nal，置於溫水(45～55℃)中至膠完全融化。將玻璃珠(Glassmilk，為Bi0101純化試劑盒中的商品)渦旋1分鐘，各取7微升加入上述兩管，放置5分鐘，每1-2分鐘混勻一次。將兩管在13000g下離心5秒。去上清，再將沉澱物重懸浮於500微升New Wash液。而後又在13000g下離心5秒。再去上清。重複上述步驟二次(重複懸浮，離心三次)。最後一次小心吸淨上清。在空氣中乾燥5～10分鐘。將沉澱用17～50微升TE溶解，置於37℃水浴放置5分鐘。在13000g下離心2分鐘。小心吸出上清，分別移至兩個新的1.5ml離心管中。從上述兩管DNA中吸取適量加入一個1.5ml離心管中。其中包括DNA片段1～17微升，T4 DNA連接酶(MBI公司)1μl，10倍濃度DNA連接緩衝液2微升，加水至總體積為20微升。混勻後略加離心，於22℃進行為時1小時的連接反應。所構建的pET-11b-BMP-7見附圖1。
3)將步驟2)中的表達載體轉入宿主細胞，形成能產生人BMP-7蛋白質的轉化細胞，並對其進行檢測；此例，製備宿主細胞是指採用分子克隆技術，以常規的氯化鈣方法製備大腸桿菌BL21(DE3)的感受態細胞。取上述2)步驟所得的連接反應物10微升與感受態細胞100微升輕輕混勻，在冰上放置50分鐘，接著在42℃的水浴中放置90秒，再置冰浴1～2分鐘，然後加入0.8毫升的LB培養基，在37℃條件下溫浴60分鐘。隨後，將100微升被轉化的感受態細胞塗布到含有氨苄青黴素抗生素的LB平板上，將平板置於室溫下直至液體被吸收後，倒置平板，於37℃培養箱中培養10～30小時後，即可出現重組菌的菌落，完成質粒的轉化；從轉化的重組大腸桿菌的固體平板上挑取單菌落，接種於裝有3毫升LB(含氨苄青黴素)培養液的試管中，在37℃溫度下中速振蕩培養10-16小時，再對收穫的菌體採用常規的鹼裂解法抽提質粒DNA；此例抽提過程如下將培養物轉入1.5毫升離心管中，12000g離心30秒。棄上清，細菌沉澱略乾燥。將沉澱重懸浮於100微升冰預冷的Sol I中，渦旋使沉澱分散完全。加入200微升新配的Sol II，顛倒6-8次，離心管置於冰上。再加150微升冰預冷的SolIII，顛倒6-8次。12000g離心10分鐘，轉移上清至一新的1.5毫升離心管中。加400微升酚氯仿溶液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)，渦旋混勻，12000g離心5分鐘，轉移上清至一新的1.5毫升離心管中。加相當於上清2-2.5倍體積的無水乙醇，顛倒混勻。12000g離心10分鐘。棄上清，加1毫升70％乙醇，12000g離心2分鐘。小心去上清，空氣乾燥沉澱。用30微升含胰RNA酶(20微克/毫升)的TE重新溶解沉澱，經37℃消化半小時後儲於-20℃備用。溶液配方1.Sol I125ml 200mmol/L葡萄糖，12.5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容於500ml，高壓滅菌，終濃度50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)。
2.Sol II10mol/L NaOH 60μl，10％SDS 300μl，ddH2O 2640μl或10mol/L NaOH 20μl，10％SDS 100μl，ddH2O 880μl3.Sol III(3mol/L NaAc(pH4.8))無水NaAc 24.6g，用70ml ddH2O溶解，用約20ml冰乙酸調pH至4.8，定容至100ml。
4.TE5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容於500ml，高壓滅菌，終濃度10mM Tris·Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)。
將上述抽提的DNA用限制性內切酶酶切鑑定，酶切溫度為30～37℃，酶切時間為1～3小時。正確重組子中應當含有400～500bp(BMP-7)及5～6kb(載體DNA)的酶切片段。凡能切出上述大小酶切片段的克隆即為轉化了新的基因(rhBMP-7)的克隆，構建基因工程菌獲得成功。附圖2為其酶切鑑定圖，圖中M為分子量標準，1～10為不同的樣品；A、B分別為500bp、250bp分子量大小，C為載體片段(5.7Kb)，D為插入的基因片段(423bp)。
4)在適合表達人BMP-7蛋白成熟肽的條件下，培養步驟3)中的轉化子細胞；在含葡萄糖的LB(含氨苄青黴素)培養基中培養基因工程菌按1％的接種量將基因工程菌接入5～10毫升的LB(含氨苄青黴素)培養基中，以轉速100～200轉/分培養2～3小時。培養溫度是30～32℃。
再按1％的比例，將培養物接種到含有200～500毫升LB培養基的三角燒瓶中，以200～300轉/分轉速，在30～32℃下將基因工程菌培養至OD600＝1.2～1.4，培養時間為10～12小時。然後，接入大罐中的LB培養基中繼續培養。接種量為5∶1(培養液∶種子液)，pH7.0，培養溫度為30～32℃，攪拌速度100～600轉/分，培養4個小時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導3～4小時，然後在8000～10000轉/分離心收集菌體，聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定說明已經產生該蛋白質(見附圖3)，單鏈的BMP-7成熟肽佔菌體總蛋白含量的30％以上，單鏈的BMP-7成熟肽佔包含體總蛋白含量的85％以上。
5)用物理方法或化學試劑裂解細胞，抽提重組蛋白質，將單鏈BMP-7復性、分離、純化得到有生物活性的二聚體；把收集的冷凍溼菌體按1∶5的比例加入Tris-Cl(50mmol/L)-EDTA(1mmol/L)緩衝液中攪拌溶解，加入1∶100的100mmol/L的PMSF使得終濃度為1mmol/L。經超聲波破菌後離心收集沉澱，再用Triton X-100清洗一次，收集沉澱的包含體。然後用1mol/L的尿素再次清洗收集沉澱冷凍保存。其中Tris-EDTA緩衝液的pH為8.0。整個過程需要時間大約5～6小時，在4℃下進行，離心轉速12500轉/分。將所得到的包含體置於裂解液(5-7mol/L的鹽酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9)中，在室溫下放置20分鐘，以裂解包含體；然後，稀釋到BMP-7的濃度約為10-100微克/毫升後進行復性，使之形成二聚體。在稀釋液中加入0.1-1mmol/L的氧化型穀胱甘肽/還原型穀胱甘肽；0.1-2mmol/L的NaCl；1-10mmol/L的EDTA和0.5-5％的甘油等，然後，置於4-10℃(或在室溫)下過夜。隨時用非還原的SDS-PAGE檢測二聚體形成的情況。
在反應後通過透析除去溶劑再經層析柱純化即可得到純的本發明的產品重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體(見圖4)。
生物學實驗證明用本發明方法製得的重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體，具有促進骨修復的活性。在小鼠肌袋中植入含1毫克重組人BMP-7成熟肽二聚體的材料後，異位成骨量達到340-602毫克(見圖5)。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的說明。SEQ ID NO.1的信息長度423bp類型脫氧核糖核酸鏈型單鏈幾何結構線性分子類型cDNA來源人工合成特徵編碼人BMP-7成熟肽羧基端的139個胺基酸的序列SEQ ID NO.1(人BMP-7成熟肽的基因編碼序列)5』 ATG TCC ACT GGT AGC AAA CAG CGT TCT CAG AAC CGT TCCAAA ACG CCG AAA AAC CAG GAA GCC CTG CGT ATG GCT AAC GTTGCT GAA AAC AGC AGC AGC GAC CAG AAA CAG GCT TGC AAA AAACAC GAA CTG TAC GTT AGC TTC CGT GAC CTG GGT TGG CAG GACTGG ATC ATC GCT CCG GAA GGT TAC CAC GCT TAC TAC TGC GAAGGT GAA TGC GCT TTC CCG CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCT ACTAAC CAC GCT ATC GTT CAG ACT CTG GTT CAC TTC ATC AAC CCG GAAACT GTT CCG AAA CCG TGC TGC GCT CCG ACT CAG CTG AAC GCTATC TCC GTT CTG TAC TTC GAC GAC AGC TCC AAC GTT ATC CTG AAAAAA TAC AGA AAC ATG GTT GTT CGT GCT TGC GGT TGC CAC TAG 3』SEQ ID NO.2的信息長度139個胺基酸類型胺基酸幾何結構線性分子類型多肽特徵人BMP-7成熟肽羧基端的139個胺基酸殘基的序列SEQ ID NO.2(人BMP-7成熟肽的胺基酸殘基序列)MSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYHAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYEFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
權利要求
1.一種製備重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特徵是該方法包括以下步驟1)編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質序列；2)構建含BMP-7基因的表達載體；3)將步驟2)中的表達載體轉入宿主細胞，形成能產生人BMP-7蛋白質的轉化細胞，並對其進行檢測；4)培養步驟3)中的轉化子細胞；5)用物理方法或化學試劑裂解細胞，抽提重組蛋白質，將單鏈BMP-7復性、分離、純化得到有生物活性的二聚體。
2.按權利要求1所述的製備重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特徵是用化學試劑裂解細胞的裂解液是5-7mol/L的鹽酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9。
3.按權利要求1所述的製備重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特徵是將單鏈BMP-7復性所用的溶液為氧化還原劑——0.1-1mmol/L的氧化型穀胱甘肽/還原型穀胱甘肽；助溶劑——0.1-2mol/L的NaCl；金屬螯合劑——1-10mmol/L的EDTA和其他添加劑——0.5-5％左右的甘油，聚乙二醇等。
4.按權利要求1所述的製備重組人骨形態發生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特徵是所說的宿主細胞是大腸桿菌。
全文摘要
本發明提供的製備重組人骨形態發生蛋白－7成熟肽二聚體的方法包括以下步驟1)編碼rhBMP－7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質序列；2)構建含BMP－7基因的表達載體；3)將步驟2)中的表達載體轉入宿主細胞，形成能產生人BMP－7蛋白質的轉化細胞，並對其進行檢測；4)培養步驟3)中的轉化子細胞；5)用物理方法或化學試劑裂解細胞，抽提重組蛋白質，將單鏈BMP－7復性、分離、純化得到有生物活性的二聚體。用本發明方法製備重組人骨形態發生蛋白－7成熟肽二聚體，可大大降低成本，提高產量，操作簡便。
文檔編號C07K14/435GK1412200SQ01135658
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月12日 優先權日2001年10月12日
發明者徐放, 鄭仲承 申請人:杭州華東醫藥(集團)公司基因技術研究所