一種植物乳桿菌及其用於製備陰道抑菌藥物的應用的製作方法

2023-04-29 02:57:56

本發明涉及微生物
技術領域：
，進一步涉及陰道微生態環境的調節及細菌性陰道疾病的治療，具體涉及一種植物乳桿菌及其用於製備陰道抑菌藥物的應用。
背景技術：
：健康婦女陰道內存在多種微生物，它們與宿主、環境之間構成了相互制約、相互協調、動態平衡的陰道微生態系統。健康婦女的陰道菌群主要由乳桿菌構成，包括植物乳桿菌、詹氏乳桿菌、格氏乳桿菌、捲曲乳桿菌、陰道乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等。正常情況下乳桿菌對陰道可以起到保護作用，當陰道微生態的乳桿菌紊亂可以導致致病菌入侵而產生陰道炎。細菌性陰道病(bv)的發生是由於陰道菌群失調，寄主自身的乳桿菌減少而導致其他條件性病原微生物如加德納菌、各種厭氧菌、彎曲弧菌等的大量繁植，通常bv實際上是以加德納氏菌為主的一種混合感染。應用抗生素治療，可暫時緩解bv的症狀，但也使本已減少的乳桿菌進一步減少，加重陰道微生態失調，從而使bv反覆復發。如何控制復發、徹底根治細菌性陰道病是婦產科醫生亟需解決的棘手問題。研究表明：產h2o2和乳酸的乳桿菌是健康婦女陰道內的優勢菌，是保護女性陰道免受病原體感染的重要因素，另外乳桿菌代謝產生的酸和一些抗微生物因子也可有效地抑制其他細菌的生長繁植。健康婦女陰道內存在多種乳桿菌，具有個體差異性，且乳桿菌各株間抗致病菌能力差異明顯。選擇乳桿菌益生菌時，需要綜合考慮乳桿菌的種類，其產酸、產h2o2能力，及與陰道上皮細胞粘附的能力，其中乳桿菌能否在陰道成功定植，是乳桿菌持續作用的基礎，也是乳桿菌發揮療效的關鍵因素。植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，為乳桿菌屬，是人體正常菌群之一，廣泛分布於人體腸道中，在女性陰道中也有分布。對於常規菌株而言，在現有技術的認知範疇中其並不具有特異性的抑菌作用。目前市面已有製品「德氏乳桿菌」實際並非我國婦女陰道優勢菌群，定植能力較差，也不能維持穩定的活菌含量，不能滿足婦科臨床的需求。技術實現要素：本發明旨在提供一種特定的植物乳桿菌，以解決現有技術中常規植物乳桿菌不具有陰道致病菌抑制能力的技術問題。本發明要解決的另一技術問題是常規植物乳桿菌產過氧化氫生產能力較低。本發明要解決的再一技術問題是常規植物乳桿菌的乳酸產量較低。本發明要解決的又一技術問題是現有技術中常規植物乳桿菌在陰道中的定殖、存活效果不佳。本發明要解決的又一技術問題是現有技術中針對陰道致病菌的菌劑類抑菌藥物治療效果不佳。為實現以上技術目的，本發明採用以下技術方案：一種分離的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，本發明中將其編號為rd-0025(植物乳桿菌)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為cgmccno.14111。上述植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)rd-0025為中國健康育齡婦女陰道分泌物中篩選得來，已於2017年5月10日保藏於在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏登記號為cgmccno.14111，該菌株的分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。上述分離的植物乳桿菌rd-0025，採用16srdna進行測序，與genbank資料庫中植物乳桿菌鹼基序列最高同源性分值大於98％。在以上技術方案的基礎上，本發明進一步提供了上述植物乳桿菌用於製備陰道致病菌抑菌藥物的應用。作為優選，所述藥物是菌劑，該菌劑在陰道環境中定殖並存活於陰道上皮細胞上。作為優選，所述藥物是菌劑，該菌劑在陰道環境中代謝產h2o2。作為優選，所述致病菌是陰道加德納氏菌。作為優選，所述致病菌是阿託波菌。作為優選，所述致病菌是白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌或沙門氏菌。同時，本發明進一步提供了上述植物乳桿菌用於製備陰道疾病預防或治療藥物的應用。作為優選，所述陰道疾病是外陰陰道假絲酵母菌病、滴蟲性陰道炎、老年性陰道炎、非特異性陰道感染或混合性陰道感染。本發明首先分離得到了一株植物乳桿菌，研究其代謝性能發現，該菌株具備優良的乳酸生產能力和產過氧化氫能，對致病菌的抑菌能力很強，同時具有突出的陰道上皮細胞粘附能力。基於以上發現的新性質，本發明確定了利用其製備陰道抑菌藥物的新用途，實現了多種細菌性陰道疾病的治療。採用上述技術方案產生的有益效果在於：(1)本發明的植物乳桿菌rd-0025菌株可以長期保存，並抵抗細菌性陰道病和各種陰道感染，包括白色念珠菌性陰道炎，淋病，病毒性陰道炎，以及泌尿道感染等。(2)本發明的菌株直接採集於健康人體，具有活躍穩定的生物學特性，無需馴化和復壯工藝，可直接製劑使用。(3)本發明的菌株具有抑制陰道加德納氏菌等抑制致病菌的作用，與市售對照菌相比較、具有優勢的陰道上皮細胞黏附力，具有在靈長類動物陰道定植的優勢能力。附圖說明附圖1是本發明的植物乳桿菌rd-0025菌落形態的正面照片；附圖2是本發明的植物乳桿菌rd-0025的革蘭氏染色鏡檢照片；附圖3是本發明的植物乳桿菌rd-0025的16srdna基因pcr擴增產物的電泳圖；附圖4是本發明的植物乳桿菌rd-0025的乳酸檢測圖譜；附圖5是本發明的植物乳桿菌rd-0025過氧化氫顯色5min和10min圖片；附圖6是本發明的植物乳桿菌rd-0025對萬古黴素、慶大黴素和紅黴素的抗生素敏感性試驗菌落圖；附圖7是本發明的植物乳桿菌rd-0025(左)和德氏乳桿菌(右)對陰道加德納菌的抑菌效果照片；附圖8是本發明的植物乳桿菌rd-0025(左)和德氏乳桿菌(右)對大腸埃希菌的抑菌效果照片；附圖9是本發明的植物乳桿菌rd-0025(左)和德氏乳桿菌(右)對金色葡萄球菌的抑菌效果照片；附圖10是本發明的植物乳桿菌rd-0025定植食蟹猴陰道後食蟹猴陰道微生物區部分菌株16srdna片段pcr擴增產物的電泳圖。具體實施方式以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬於公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。以下實施例中所用到的細菌培養基成分及配製方法如下：1、肉湯固體培養基(mrs)配製：(1)將瓊脂粉配成溶液，1.5g/100ml去離子水；(2)加入mrs培養基17.91g/100ml瓊脂溶液，混勻；(3)放入滅菌鍋，1.0mpa蒸汽滅菌20分鐘；(4)待培養基溫度降至室溫後倒入培養皿，根據培養皿大小約10ml/個或20ml/個；(5)於超淨臺內操作。冷卻後成瓊脂狀，標記培養基名稱及配製日期，放於4℃冰箱待用。2、肉湯液體培養基(mrs)配製：(1)將mrs培養基加入去離子水，比例為17.9lg/100ml；(2)放入滅菌鍋，1.0mpa蒸汽滅菌20分鐘；(3)待滅菌鍋無壓力後取出，分裝至ep管中，每個1.0ml。標記培養基名稱及配製日期，放於4℃冰箱待用。3、過氧化氫(h2o2)鑑定培養基配製：(1)同肉湯固體培養基(mrs)配製步驟(1)至(4)；(2)待滅菌鍋無壓力後取出，稍冷卻，但仍為液體狀態時於超淨臺內加入tmb(終濃度0.25mg/m1)、hrp(終濃度0.01mg/m1)，混勻；(3)待培養基溫度降至約45℃後倒入培養皿，冷卻後成瓊脂狀，標記培養基名稱及配製日期，放於4℃冰箱待用。實施例1(植物乳桿菌rd-0025菌群的分離和接種、純化、增菌培養)1、植物乳桿菌rd-0025菌群的分離和接種：用兩個無菌棉拭子採集受試者陰道側壁上的分泌物，以不同濃度接種於裝有配製好的mrs培養基的培養皿，並標記信息，將培養皿置於厭氧罐中，並放入co2產氣袋，置於37℃孵育箱，孵育48h以上。2、植物乳桿菌菌株rd-0025的純化、增菌培養：按照菌落不同形態(表面、邊緣等)、大小分別計數，形態相同、大小一致的記為一種，接種環挑取單個菌落中少許細菌，按「斜線法」接種至mrs固體培養基以得到分離純化的單菌落；無菌牙籤挑取mrs固體培養基上的單菌落少許細菌，接種至mrs液體培養基，置於37℃孵育箱，厭氧培養24h-48h，篩選出新的菌株。實施例2(植物乳桿菌rd-0025菌株的鑑定及保藏)1、培養特性、染色鏡檢及形態學特徵：培養後得到的菌落如附圖1，菌落一般呈白色圓形，直徑約3mm，中間凸起，表面光滑，細密；取該菌純培養物塗片進行革蘭氏染色，結果如附圖2，呈現革蘭氏陽性，圓端直杆，單個、成對或短鏈狀分布，結果表明：所分離菌株初步判定為乳桿菌屬。2、16srdna基因序列鑑定：以細菌基因組dna提取試劑盒進行dna提取，並採用引物對27f(5』-agagtttgatcmtggctcag-3』)，1492r(5』-tacggytaccttgttacgactt-3』)，進行pcr擴增，取pcr產物進行凝膠電泳，確定16srdna基因片段，在約1500bp處得到單一清晰的pcr產物條帶，見附圖3中。將pcr產物進行純化及dna序列測定，採用sanger測序法，測序引物對為27f/1492r，測序儀器abi3730xl，測序結果與genbank資料庫比對，其與植物乳桿菌同源性相似度大於99％。最終鑑定的屬種為植物乳桿菌。其16srdna的可變區序列見序列表seqidno:1。3、生理生化特徵：通過七葉苷水解試驗、甲基紅試驗(mr試驗)、乙醯甲基甲醇試驗(vp試驗)、靛基質試驗、三糖鐵試驗、克氏雙糖鐵試驗、尿素酶試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、胺基酸脫羧酶試驗、明膠液化試驗、丙二酸鈉試驗、檸檬酸鹽實驗(枸櫞酸鹽實驗)、硝酸鹽還原試驗、石蕊牛奶試驗、細菌動力試驗測定菌株生理生化反應，所得結果如表1所示：表1植物乳酸桿菌rd0025的生理生化特性實驗結果生理生化項目結果七葉苷水解試驗+甲基紅試驗(mr試驗)+乙醯甲基甲醇試驗(vp試驗)-靛基質試驗-三糖鐵試驗-克氏雙糖鐵試驗-尿素酶試驗-苯丙氨酸脫氨酶試驗-胺基酸脫羧酶試驗-明膠液化試驗-丙二酸鈉試驗-檸檬酸鹽實驗(枸櫞酸鹽實驗)-硝酸鹽還原試驗-石蕊牛奶試驗-細菌動力試驗-+：表示陽性；-：表示陰性採用法國梅裡埃公司生產的api50chl乳桿菌鑑定系統對菌株進行生化鑑定，鑑定結果統計如表2所示表2植物乳酸桿菌rd0025api50ch試驗條反應結果+：表示陽性；-：表示陰性由此生化圖譜判定菌株生化特性符合植物乳桿菌的生化特性。3、菌株的保藏本發明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)rd-0025從中國健康育齡婦女陰道分泌物中篩選得來，已於2017年5月10日保藏於在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏登記號為cgmccno.14111，該菌株的分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。實施例3(植物乳桿菌rd-0025代謝產物測定)1.植物乳桿菌rd-0025代謝產物中乳酸含量測定：採用高效液相法(0.005m硫酸水溶液(0.28ml硫酸(98％)-1000ml水，ph約為2.1)對本菌株培養24-48h發酵液的乳酸進行檢測，結果標明乳酸(l/d乳酸總和)約為30mg/ml，遠高於德氏乳桿菌(市售)的乳酸含量(約15mg/ml)，本發明的乳酸檢測圖譜參見附圖42.植物乳桿菌rd-0025代謝產物中過氧化氫含量測定：按mcgroarty等的過氧化物酶法進行過氧化氫半定量測定，將已分離鑑定的植物乳桿菌rd-0025接種於h2o2鑑定mrs-tmb平板，37℃厭氧培養24h後，取出平板，在空氣中暴露菌體。產h2o2乳桿菌菌落將變為藍色，而不產h2o2菌落不變色，根據變色時間對產生的h2o2進行半定量，結果見圖5，圖中5min時菌落已有明顯藍色顯現，10min時大量藍色明顯出現，顯然本菌很容易產生過氧化氫，產過氧化氫能力很強，以上結果說明本植物乳桿菌rd-0025能顯著產生乳酸和過氧化氫，有助於維持陰道微生態平衡。實施例4(抗生素敏感試驗)按照2015年版藥典第三部微生態活菌製品總論中抗生素敏感性試驗的要求，採用瓊脂擴散紙片法測定菌株對抗生素的敏感性，考察0代(c0)和傳代30(c30)代的植物乳桿菌rd-0025對各抗生素的敏感性，根據抑菌圈的大小判斷菌株對抗生素敏感性級別，測定結果如表3所示：表3植物乳酸桿菌rd0025的抗生素敏感試驗結果抑菌圈小於10mm判定為輕度敏感，在10-20mm為中度敏感，大於20mm為敏感。實驗數據表明本菌對紅黴素、氟羅沙星輕度敏感，對美羅培南和慶大黴素中度敏感，對氨苄西林、苯唑西林、青黴素g、卡那黴素、四環素、克林黴素、紅黴素、哌拉西林、頭孢曲松、氟羅沙星、萬古黴素、阿莫西林/克拉維酸、阿奇黴素、阿莫西林、桿菌肽敏感。其中對萬古黴素、慶大黴素和紅黴素的抗生素敏感圖見附圖6.實施例5(毒性試驗)5隻spf級昆明種小鼠，每隻小鼠陰道注入0.5ml植物乳桿菌rd-0025懸浮菌液(大於1×109cfu/只鼠)。按2015版中國藥典要求，每天測量每隻小鼠體重，並觀察、記錄每隻小鼠注射前後的行為和生理等變化。結果顯示7天內所有動物體重均有增加，未見明顯中毒症狀，活動行為無異常，無動物死亡，認為該菌株屬於無毒類菌株。實施例6(植物乳桿菌rd-0025傳代穩定性測試)本實施例從生長特性、形態學、生化特點、代謝物成分、抗生素敏感特性、遺傳特性以及毒性測試等方面對本植物乳桿菌菌株rd-0025進行了傳代30代(c30)的穩定性考察。1、植物乳桿菌rd-0025分離純化、菌落形態觀察、染色鏡檢及生化特性檢測方法同實施例1和實施例2的第一部分。結果表明：經過傳代，菌落形態見為白色圓形菌落，大小約3mm，中間凸起，表面光滑，未發生顯著變化，傳代穩定；革蘭氏染色呈現為革蘭氏陽性桿菌，染色鏡檢照片與0代沒有變化。2、遺傳特性分析：方法同實施例2的第二部分。分別對植物乳桿菌rd-0025的第0代(c0)、第30代(c30)菌株進行16srdna片段pcr擴增，將pcr擴增產物電泳分析，目的條帶清晰且單一，大小約為1500bp，擴增正確，c0、c30兩次pcr擴增結果一致，將測得序列使用ncbi中的blast工具與genbank資料庫中的已知序列進行比對分析，為植物乳桿菌，同源性相似度100％。3、代謝產物測定：方法同實施例3，乳酸測定含量約30mg/ml，過氧化氫實驗顯示各代菌落均在5min時均已出現藍色，10min時大量藍色明顯出現，證明菌株代謝產生過氧化氫能力和產乳酸能力穩定。4、抗生素敏感試驗：方法同實施例4，採用採用瓊脂擴散紙片法測定菌株對抗生素的敏感性，根據藥敏試驗紙片法的抑菌範圍解釋標準判定本植物乳桿菌株對紅黴素、氟羅沙星輕度敏感，對美羅培南和慶大黴素中度敏感，對氨苄西林、苯唑西林、青黴素g、卡那黴素、四環素、克林黴素、紅黴素、哌拉西林、頭孢曲松、氟羅沙星、萬古黴素、阿莫西林/克拉維酸、阿奇黴素、阿莫西林、桿菌肽敏感。5、毒性試驗：方法同實施例5，用小鼠陰道注入傳代30代(c30)的植物乳桿菌rd-0025菌液進行了毒性測試，其中測試的濃度＞109cfu/只鼠。結果為：全部受試小鼠7天內均未見中毒症狀，體重均有增加，無動物死亡。根據上述結果，按《新藥藥理、毒理研究技術要求補充說明》，該菌株屬於無毒類菌株。綜合，本實施例將植物乳桿菌rd-0025用mrs培養基培養多次傳代，從形態學、生化學、代謝物特點及遺傳特性、藥敏特性、毒性試驗等方面探討了傳代繁植對植物乳桿菌的影響。結果表明：用mrs培養傳代在30代以內其形態學、生化學、遺傳特性、代謝物及藥敏特性與最初分離菌株一致。實施例7(植物乳桿菌rd-0025菌株藥效學實驗)一、植物乳桿菌rd-0025菌株體外抑菌實驗(1)植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌體外抑制陰道加德納菌的實驗：按照3％接種濃度製備植物乳桿菌rd-0025的mrs瓊脂菌餅，於37℃下厭氧培養24h，同法製備市售德氏乳桿菌菌餅；取陰道加德納菌100μl，接種於10mlbhi固體培養基中，放入植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌菌餅，37℃厭氧培養48h；乳桿菌周圍會出現明顯抑菌圈。結果見圖7，其中左圖為植物乳桿菌rd-0025抑菌圈效果，遊標卡尺測量抑菌圈直徑為32.3mm，右圖為德氏乳桿菌抑菌圈效果，抑菌直徑為21.5mm，結論為植物乳桿菌rd-0025對陰道加德納菌的抑菌效果強於德氏乳桿菌。(2)植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌體外抑制金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌和沙門氏菌的實驗：按照3％接種濃度製備植物乳桿菌rd-0025的mrs瓊脂菌餅，於37℃下厭氧培養24h，同法製備市售德氏乳桿菌菌餅；將金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌和沙門氏菌接種在胰酪大豆腖液體(tsb)瓊脂培養基，放入植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌菌餅。於33℃培養18-24h，觀察抑菌圈，遊標卡尺測量rd-0025抑菌圈直徑約為22mm，右圖為德氏乳桿菌抑菌圈效果，抑菌直徑為12mm，結論為植物乳桿菌rd-0025對金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌和沙門氏菌的抑菌效果強於德氏乳桿菌，代表性圖見附圖8-9二、細胞黏附力實驗：根據黏附在陰道上皮細胞單細胞層上的乳桿菌個數，確定不同乳桿菌的黏附性能。方法如下：取人類陰道上皮細胞vk2/e6e7和人類子宮頸癌上皮細胞hela，將細胞以50萬每孔的密度接種於一個12孔板中，待48小時後vk2/e6e7形成單細胞層；每孔以不同數量的cfu分別加入市售乳桿菌(德氏乳桿菌)和植物乳桿菌rd-0025，粘附4小時，粘附過程中在搖床上面輕輕振蕩，各組分別設有兩個平行實驗；當粘附結束後，用1ml0.05％tritonx-100裂解細胞，製成懸浮菌液，稀釋，分別取100ul菌液均勻地接種於mrs瓊脂培養基平板上；厭氧培養48小時後，統計每個平板的克隆數。結果顯示：植物乳桿菌rd-0025的4h黏附率分別為35.2％和45.3％，市售同類德氏乳桿菌菌株4h黏附率分別為23.6％和20.7％，植物乳桿菌rd-0025的黏附力高於市售同類乳桿菌德氏乳桿菌菌株。三、家兔陰道定植實驗1、實驗方法選擇10隻健康動物按體重進行分層隨機分組，分成2組，陽性對照組動物5隻，實驗組5隻：定植用植物乳桿菌rd-0025製備：稱取植物乳桿菌rd-0025的冷凍乾燥菌粉，使定植量為106。對照組使用上市品(德氏乳桿菌膠囊)，無菌操作條件下，各加入mrs液體培養基0.5ml，混合均勻，用陰道給藥器全部吸取後陰道植入。定植造模及取樣：在可觀察到正常月經周期的猴子月經後，連續7天植入造模菌。每周對動物的陰道進行一次觀察，檢查陰道分泌物的顏色，性狀及分泌量及測定陰道分泌物ph，取2隻無菌棉籤取樣，其中一隻棉籤用於陰道分泌物清潔度鏡檢，另一支棉籤用於菌群分析。陰道菌的分離和純化培養：將採集的陰道分泌物，在2mld-hanks緩衝液中振蕩，以磷酸鹽緩衝液做梯度稀釋，分別塗布於mrs瓊脂板上並且在37℃，厭氧條件下培養24～48h。記錄單菌落形態等信息，重新劃線mrs瓊脂板以得到純化的菌落並進行生化和分子鑑定。分子生物學方法鑑定(16srdna基因序列分析)：對所分離純化出的菌株進行16srdna的序列擴增、測序及分析，將鑑定為16srdna片段的pcr擴增產物使用切膠回收法對目的片段純化後進行測序。將測得的16srdna基因序列使用ncbi中的blast工具與genbank資料庫中的已知序列進行比對分析，同源性為99％，鑑定為同一物種。2、實驗結果及分析陰道黏膜及分泌物一般觀察：植入後每周觀察一次，結果發現所有試驗動物陰道黏膜分泌物未發現明顯異常。陰道分泌物ph值測定：在植物乳桿菌rd-0025植入後，大部分實驗組動物陰道分泌物ph值明顯低於上市品對照組，且相對於植入前明顯下降，ph值測定結果如表4所示。表4植物乳酸桿菌rd0025對實驗動物陰道分泌物ph影響試驗結果陰道分泌物清潔度：植入前後相比，對照組陰道雜菌數量明顯增加，清潔度降低；而實驗組在植物乳桿菌rd-0025植入後，陰道分泌物清潔度明顯優於對照組，可見到數量不等的革蘭氏陽性陰道桿菌，清潔度明顯高於對照組。陰道分泌物清潔度判定結果如表5所示。表5植物乳酸桿菌rd0025對實驗動物陰道分泌物清潔度影響試驗結果ⅰ～ⅲ為清潔程度，ⅲ表示潔淨度最低。將實驗組分泌物進行擴增分離純化，經過陰道菌群分析，從實驗組全部3隻動物陰道分泌物中均發現供試植物乳桿菌rd-0025，分離出的供試植物乳桿菌rd-0025的信息如圖10所示。從圖中可看出，受試動物陰道分泌物中均發現供試植物乳桿菌rd-0025，因此可以看出植物乳桿菌rd-0025可以有效定植於中華食蟹猴陰道內。實施例8(植物乳桿菌rd-0025凍幹保存及凍乾粉穩定性)為了檢測植物乳桿菌rd-0025在發酵和凍幹情況下的存活率，將植物乳桿菌rd-0025在ph6.5的改良mrs培養基中生長，使用100升規模的發酵罐發酵。在平臺期早期收集菌體，其活菌數達到約3×109cfu/ml。通過離心分離收集菌體，用磷酸緩衝液洗滌後，與凍幹保護劑(包括脫脂奶粉和蔗糖等)混合。然後，將混合物置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。樣品在-40℃下冷凍約2小時，然後在-20℃下真空乾燥20-30小時，再在30℃乾燥3-5小時。乾粉用鋁箔袋分裝，並存儲在4℃和室溫(25℃)。在第0、1、3、6、9、12月通過平板計數測定活菌數。初始的植物乳桿菌rd-0025每克乾粉含有高達500億活菌(5×1010cfu/g)，在4℃下具有最佳的儲存穩定性。4℃下儲存6個月後，保留初始活菌數的80％，見表6。表6植物乳酸桿菌rd0025凍乾粉菌劑穩定性試驗結果以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明。凡在本發明的申請範圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。sequencelisting廣東強基藥業有限公司；廣東龍創基藥業有限公司；趙湘江一種植物乳桿菌及其用於製備陰道抑菌藥物的應用111471dna人工序列1aatctctggtccacttaggcggctggttctaaaaggttac40cccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacg80ggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggca120tgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtagg160cgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaag200agattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtacca240tccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcat280gatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcac320cggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaact360gataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaaca400tctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgta440tccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgc480atagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttc520gaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgt560caattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccag600gcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcgg640aaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatgga680ctaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcg720agcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgcc760actggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctaca800catggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttccca840gtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcac880atcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaa920taaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggc960tgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaaatacc1000gtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttcttt1040aacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcac1080gcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagat1120tccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctc1160agtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgt1200atcattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctaa1240tacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatc1280tttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggta1320ttagcatctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggca1360ggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactcaa1400atgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttc1440gttcgactgcatgtatagcacgccgcacctc1471當前第1頁12