超氧物歧化酶衍生物及其生產方法和在醫學上的應用的製作方法

2023-05-25 05:23:11 1

專利名稱：超氧物歧化酶衍生物及其生產方法和在醫學上的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及超氧物歧化酶衍生物及其生產方法和該衍生物在醫學上的應用以及含有該衍生物的口服複方組合物。
眾所周知超氧物歧化酶(為簡明起見下文用「SOD」表示)普遍存在於動物、植物和微生物的生物組織中，它是一種酶，能分解對活機體有害的過氧化物。最近，有人嘗試應用分離出來的SOD作為抗炎劑(FARUMASHIA，17，411，1981;CurrentTherapeuticResearch，16，706，1974)。
人們也知道當靜脈注射SOD時，其血漿半壽期只有4-6分鐘，所注射的SOD迅速排洩。為延長SOD血漿半壽期，試圖用Ficoll，聚乙二醇，大鼠白蛋白或菊粉〔JapanesePublishedUnexaminedPatentapplication(KokaiTokkyoKoho)NO.32826/83〕修飾SOD。
據報導，經Ficoll或聚乙二醇修飾的SOD的活性比未經修飾的SOD大幅度降低，而大鼠白蛋白修飾的SOD是抗原性的。同時也發現菊粉修飾的SOD酶催活性次於SOD。
本發明目的是提供一種新穎的超氧物歧化酶衍生物，這種衍生物與SOD相比，血漿半壽期延長，而又保持SOD原有的酶催活性。
本發明另一目的是提供一種新穎的超氧物歧化酶衍生物，它有抗炎等藥理作用，而且用藥安全。
本發明又一目的是提供上述超氧物歧化酶衍生物的生產方法。
本發明再一目的是將上述超氧物歧化酶衍生物提供醫學上應用，例如用作抗炎藥物。
本發明還有一個目的是提供適宜於口服給藥的上述超氧物歧化酶衍生物的複方組合物。
從以下詳細敘述中，這些目的和其他目的以及本發明所具優點對於本領域技術人員來說將變得更明顯。
本發明提供一種具通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物或其藥物學上可接受的鹽。其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團)的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團
其中R1、R2、R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團的其中一個除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那裡的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物基團平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數，相應於上述一價基團的數目，這些基團各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個氫原子。
本發明進一步提供生產上述超氧物歧化酶衍生物或其藥物學上可接受的鹽的方法，包括超氧物歧化酶和共聚物進行反應，其組成單元是(a)具有如下通式的基團
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，(b)選自以下類別如下通式的基團
其中R1和R2分別如上所規定;
如下通式的基團
其中R3和R4分別如上所規定;以及如下通式的基團
在pH7～11的鹼性水溶液存在下，該共聚物具有平均分子量500～200，000(為簡明起見，下文用「共聚物」)。
本發明另一方面提供了含上述SOD衍生物或其鹽作為活性成份的藥物複方組合物，例如抗炎劑;以及治療炎症和其他疾病的方法，也包括所給予的上述SOD衍生物及其鹽的有效量。
再一方面，本發明提供含上述SOD衍生物或其鹽類的口服藥物複方組合物，以及中級/高級脂肪酸甘油酯，及其含上述SOD衍生物或其鹽的口服藥物複方組合物;還有中級/高級脂肪酸甘油酯以及兩親試劑和/或低級鏈烷醇。


圖1顯示SOD衍生物及SOD對流感病毒感染小鼠的效應。
圖2為SOD衍生物(用合成例1製備)的紫外吸收光譜。
圖3為SOD衍生物(用合成例2製備)的紅外吸收光譜。
圖4(ⅰ)為光密度譜，用原料SOD(合成例2中所用)的聚丙烯醯胺凝膠電泳測定。
圖4(ⅱ)為光密度譜，用SOD衍生物(從合成例2製備)的聚丙烯醯胺凝膠電泳測定。
(a)SOD衍生物的生產方法。
(a-1)SOD和共聚物的反應。
SOD和共聚物的反應通常是將SOD溶於一些鹽的水溶液中進行，例如碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉、磷酸鈉等，再將共聚物加到生成的溶液中去，可以粉料形式加入或將其溶於有機溶劑(如二甲亞碸)後加入。在反應進行時有必要使溶液維持pH7-11。若pH值小於7，共聚物的溶解度減小，從而幹擾反應進程。若pH值大於11，則SOD被鈍化，以致得不到有效的SOD衍生物。反應溫度最好在3～50℃，在4-40℃範圍內更好。然而，反應時間得取決於反應溫度以及共聚物加料的方法，通常在10分鐘至3小時範圍內。共聚物的投料大約按0.5-30摩爾對1摩爾SOD的比率。通過改變這一比率，連接到SOD結構上的共聚物分子數目能被調節。
反應生成的混合物中不僅含SOD衍生物，而且含有未反應的SOD和共聚物等。因此，得將反應混合物過濾，使濾液經過凝膠過濾。所得含有SOD衍生物的濾液，如有必要，使之進行疏水層析並超濾。所得濃縮液經冷凍乾燥，得SOD衍生物的固態產物。
作為上述反應的結果，SOD的氨基與共聚物的馬來酐部分結合，產生SOD衍生物。例如人型SOD每個分子含22(人紅細胞SOD或產自酵母經基因工程設計的人型SOD)-24個(產自大腸桿菌經基因工程設計的人型SOD)氨基。在上述反應中，SOD的其中某一個氨基和共聚物的其中一個馬來酐部分反應，最終產生每個SOD分子含1-22或24個共聚物分子的SOD衍生物。原料共聚物通常含馬來酐環(見後面所述)。當這些馬來酐環中其中一個與SOD的氨基結合後，其餘馬來酐環明顯地不和其他氨基反應，但傾向與水反應，產生具通式
的馬來酸衍生基團。有可能一個分子的共聚物與為數眾多的SOD分子反應，生成副產品的化合物，其中共聚物分子中的多數馬來酐環與各個SOD分子中的氨基相結合，但在本發明實踐中，使用包含少部分副產物的SOD衍生物並不使人感到討厭。然而，考慮到如下事實，即藥物產品的任何活性成分希望它是具有單一的化學結構，最好用合適的方法，如凝膠過濾，將含副產物多的SOD衍生物進行純化，以便除去副產物。進一步應搞清楚，通過上述反應得到的SOD衍生物確實是含有不同數目共聚物分子的不同化合物的混合物，就是對各個SOD衍生物來說，與SOD結合的共聚物分子數目不是均勻的。所以，在上述代表SOD衍生物的通式中，n意味著與一個分子SOD結合的共聚物分子的平均數目。然而，當需要獲得與之結合的共聚物分子數目是均勻的SOD衍生物時，按上述方法製得的SOD衍生物可使之進一步作合適的分級純化處理，例如凝膠過濾，從而得到所需的SOD衍生物。
(a-2)原料SOD用作原料的SOD可用常規方法從動物(人、牛)植物和微生物的活組織中提取出來，或者通過基因工程製得。如今，SOD的化學結構已被非常充分地闡明(配位金屬，分子量，胺基酸排列順序等)。因此，SOD已被分為三大主要類型，鐵配位SOD，錳配位SOD和銅鋅配位SOD，取決於它們所存在的生物組織，SOD的分子量範圍為30，000-80，000。SOD的胺基酸順序也或多或少隨其所存在的生物組織不同而變化，有關這一課題的詳細報導可以從下列文獻中獲得YoshihikoOyanagiSuperoxideandMedicine，74-90(KyoritsuShuppan，May25，1981);JournalofBiologicalChemistry，246，2875-2880(1971);and250，6107-6112(1975);ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，70，3725-3729(1973);ArchivesofBiochemistryandBiophysics，179，243-256(1977)等等。原料SOD最好是人型銅鋅配位SOD。牛型和馬型銅鋅配位SOD也適宜於本發明目的。這種類型SOD的分子量大約33，000，在其分子中含20、22或24個氨基。例如，人型SOD可以通過將人血作加熱處理，離子交換及連續性凝膠過濾或基因工程方法分離出來。
(a-3)原料共聚物共聚物作為另一種原料，能通過使二乙烯基醚-馬來酐共聚物部分水解(馬來酐環水解度30～90%)，或者使該共聚物進行部分酯化即半酯化(馬來酐環半酯化度30～90%)而獲得。作為酯的實例，可提到的有甲酯、乙酯、丙酯、正-丁酯、正-戊酯、異-戊酯、正-己酯、正-庚酯、正-辛酯、甲氧基乙酯、乙氧基乙酯、丙氧基乙酯、2-丁氧基乙酯、1，3-二甲氧基-2-丙酯、2，3-二甲氧基-1-丙酯、1，3-二乙氧基-2-丙酯、2-乙氧基-3-甲氧基-1-丙酯、1，3-二丙氧基-2-丙酯、1，3-二丁氧基-2-丙酯、苄酯等等。
正如上述，原料共聚物的平均分子量為500～200，000。鑑於最終SOD衍生物進入生物體內有影響部位的轉運動力學，共聚物的重均分子量最好不超過10，000。共聚物的分子量分布並無特別限制。因此，共聚物(其重均分子量與數均分子量之比大約為2或更高些)可通過二乙烯基醚和馬來酐的自由基共聚，再直接使其部分水解或部分酯解，而無需作之前或之後的分級，以使分子量分布的範圍變窄，這樣的共聚物可成功地用作原料。
(b)SOD衍生物的藥物學上可接受的鹽，及其鹽的製備方法。
作為上述藥物學上可接受的SOD衍生物鹽的實例，可提到的有SOD衍生物的鹼金屬鹽，如鈉、鉀等;鹼土金屬鹽，如鎂、鈣、鋇等;銨鹽及有機叔胺的鹽，如吡啶、三乙胺、三正丁胺等。
藥物學上可接受的SOD衍生物鹽能從SOD衍生物容易地製得，並且能按所需鹼的種類，通過常規的成鹽反應製備。
(c)口服複方組合物中級/高級脂肪酸甘油酯可用於製備口服複方組合物，按本發明應用具有6～20個碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的單、二和三甘油酯。這些脂肪酸甘油酯的代表性例子包括辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、亞油酸、亞麻酸或其類似酸的單、二和三甘油酯。這些脂肪酸甘油酯能單獨使用或混合使用。
脂肪酸甘油酯可以是天然存在的化合物，或是合成或半合成化合物。通常應用天然植物油較為方便。在本發明實踐中應用植物油具有優點，尤其包括橄欖油(油酸70-80%，亞油酸4-12%，十六烷酸7-15%)，玉米油(亞油酸40～60%，十六烷酸25～45%)，芝麻油(油酸35～46%，亞油酸35～48%)，山茶油，花生油(十二烷酸45～52%，癸酸4～12%，辛酸6～10%)和棕櫚油。商業級產品本身就能應用。因此，作為商品可買到的中級脂肪酸三甘油酯的例子，可提到的有Panasate 875，810和800(日本油脂有限公司;辛酸含量10～100%)，ODD (Nissin Seiyu K.K.;辛酸含量67%)等。作為商品的中級脂肪酸單甘油酯的實例，可提到的有Homoteks PT(Kao公司;癸酸含量60%)。作為中級脂肪酸單和二甘油酯混合物的實例，可提到的有Witafrol (Dinamit Novel公司)。至於高級脂肪酸三甘油酯，能用像橄欖油那樣的食用商品油(Wako純化學工業有限公司)以及亞油酸(日本油脂有限公司)。
上面敘述過的兩親試劑是具有親水性和親油性的無毒試劑。這種兩親試劑的典型例子包括天然的兩性表面活性劑，脂肪酸聚甘油酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(吐溫(Tween)系列)，脫水山梨糖醇脂肪酸酯(山梨糖醇酯類(Span)系列)以及聚乙二醇。優選的兩親表面活性劑是大豆磷脂，蛋黃卵磷酯及其有關物質，例如磷脂醯膽鹼，蛋黃卵磷酯，大豆磷脂，磷脂醯乙醇胺等商品，可從日本油脂有限公司購得。聚甘油脂肪酸酯可以是Unigli (日本油脂有限公司)。作為聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的實例，可提到的有吐溫20(Wako純化學工業有限公司)。山梨糖醇脂肪酸酯可以是Span 20(Wako純化學工業有限公司)，而聚乙二醇可以是PEG 6000。除上述而外，陰離子表面活性劑，如月桂基硫酸鈉以及陽離子表面活性劑，如氯化苄烷銨，氯化苄乙氧銨，Eison (美國納爾遜研究開發(NelsonResearchanolDevelopmentCo.)公司)等也可供應用。
上述鏈烷醇可以是乙醇，丙醇，異丙醇，丁醇或其類似物。
按照本發明生產複方組合物的方法，將SOD衍生物或其藥物學上可接受的鹽(在下文內一併歸入SOD衍生物)的水溶液調節到合適的pH值，製成冷凍乾燥物，均勻地分散到上述脂肪酸甘油酯中，後者含或不含上述兩親試劑和/或低級鏈烷醇;或者採用下法，將SOD衍生物的碳酸銨水溶液和上述兩親試劑的水溶液和/或低級鏈烷醇的混合物，進行真空冷凍乾燥，然後將冷凍乾燥物均勻地分散到中級/高級脂肪酸甘油酯中。
上述脂肪酸甘油酯的比例大約為每mgSOD衍生物0.1-100ml，最好約為0.5-5ml(在同一基礎上)。添加上述兩親試劑和/或低級鏈烷醇是隨意的，但這些試劑有助於提高與油的可溼性以及增加分散度或溶解度。以便得到一個穩定的，具有額外效果的複方組合物，在口服之後能提高機體對藥物的吸收。添加上述兩親試劑恰當的量，隨其品種不同而變化。在通常情況下，相對於1mgSOD衍生物，取0.01-0.1ml液態兩親試劑或0.05-5mg固態兩親試劑為宜。上述低級鏈烷醇的添加量約為1-15%(重量百分數)，以複方組合物的總重量為基礎。添加這種低級鏈烷醇導致改善溶液的均勻性。
按本發明的複方組合物是一種物理和化學穩定的澄清液。因此，將此複方組合物在室溫下以5000rpm的速度離心15分鐘，或者在37℃下放置一個月，無沉澱出現。而且，在4℃或室溫下於暗處貯存，至少在3個月內，不出現肉眼可見的變化。此外，即使將複方組合物置於4℃至室溫下，以24小時為間隔，作10個循環的溫度變化實驗之後，其效價仍維持不變。
(d)SOD衍生物的藥理學簡介按本發明的SOD衍生物表現出的特色為與SOD相比，顯著地延長血漿半壽期，仍保留SOD的酶催活性，實質上原封不動，並且毒性低。所以，本發明的SOD衍生物具有抗炎劑和缺血疾病的治療劑的價值。
以下動物試驗具體說明了本發明的SOD衍生物及其複方組合物的效果。
(Ⅰ)抗炎症和抗病毒試驗(1)對流感病毒感染小鼠肺實變(炎症性硬化)的效果方法ddY小鼠，年齡5-6周，體重約22g。使小鼠吸入100倍LD50劑量的流感病毒〔A2/Kumamoto(H2N2)〕氣溶膠感染，然後按預定劑量口服被測藥劑，每天一次，連續6天(從感染那天起)，所用小鼠分為30組。感染後3、4和5天間小鼠連續死亡，肺實變評分通過Horsfall方法(Journal of Experimental Medicine 95，135-145，1952)。
結果如表1所示，表內實變評分的方法如下。將生理鹽水直接注射入小鼠心臟內，徹底洗滌肺，然後進行觀察，用下列評分等級評價損傷程度。
(2)對病毒感染小鼠的效果方法ddY小鼠，年齡5-6周，體重約22g，使小鼠吸入2倍LD50劑量的流感病毒〔A2/Kumamoto(H2N2)〕氣溶膠感染。然後將合成實例1的SOD衍生物(2000單位/mg)或牛紅細胞SOD(2000單位/mg)在感染後第5天靜脈注射給藥，劑量為200單位/每一隻鼠，每天1次，連續4天。
圖1顯示存活百分數對感染後的天數作圖，在SOD衍生物組存活百分數為95%，在SOD組及對照組(感染後未經治療的小鼠)為0%。進一步試驗時，在上述同一方式下，給SOD劑量為2000單位/每一隻鼠，僅僅觀察到輕微的效應。
從結果看來很明顯，SOD衍生物對流感病毒感染的小鼠有卓越的效果。
(3)對燒傷部分白蛋白漏出的效果方法將伊文思藍溶於生理鹽水，終濃度為0.2%(重量百分數)，取出0.18ml(10mg/kg)該溶液，經靜脈注射給予ddY小鼠(年齡8-10周，體重約30g)。小鼠分為10組。給上述溶液以後，用在70℃水浴上預熱過的鐵釘頭端(直徑12mm)緊壓小鼠腹部，造成燒傷，立即口服被測藥劑。服藥後2小時殺死小鼠，切割燒傷部位的皮膚，在60℃甲醯胺中浸泡48小時，經提取的伊文思藍濃液，在波長620nm下測定吸光度。從數據估算出伊文思藍-白蛋白絡合物的濃度，計算被測藥劑對燒傷部位白蛋白漏出的抑制百分數。
實驗結果見表2所示
表2
＊水溶液＊＊油狀複方組合物重複上述實驗，只是在給藥以後6小時殺死小鼠。在上述同一方式下，測定伊文思藍-白蛋白絡合物濃度。在ODO 組內，燒傷部位白蛋白漏出的抑制百分數為0%;SOD衍生物(由合成實例1)組為50%;SOD複方組合物(由配方實例6)組為56.5%。
用按合成實例2所得SOD衍生物作實驗，得到同樣結果。
從上述結果看來很明顯，SOD衍生物和本發明的複方組合物與對照組相比，抑制燒傷部位白蛋白漏出是有效的。
(Ⅱ)口服SOD衍生物複方組合物之後血液轉運實驗血藥(SOD衍生物)濃度通過放射性測試來測定，實驗方法步驟和結果如下(1)14C甘氨酸標記SOD衍生物的製備將17.7mgSOD衍生物(按合成實例1)溶於1.5ml蒸餾水，接著加入18.2mg水溶性碳化二亞胺。5分鐘後加入0.13mg(0.5ml水溶液)14C甘氨酸(New England Nuclear，U.S.A.產品;113.0mci/mmol)。用1M碳酸氫鈉水溶液調節混合物的pH值至大約為6。在暗處室溫下，緩慢攪拌1小時，促使反應進行。然後加入1.0ml 1M醋酸鹽緩衝液(pH 6.0)，以便終止反應。反應混合物用Sephaex C25柱(2.3×10cm;Pharmacia F.C.)脫鹽，並進行冷凍乾燥，得15.5mg14C甘氨酸標記SOD衍生物，比放射性10.7μci/mg。該產品基本上是均勻的，每個SOD衍生物分子主要含一個甘氨酸單位。該產物是穩定的化合物，其中的甘氨酸通過醯胺鍵已被結合到SOD衍生物的羧基上。
(2)動物口服實驗應用14C甘氨酸標記SOD衍生物，按照下文所描述的配方實例2的方法製備複方組合物，並應用胃管給予雄性ddY小鼠(年齡8周)口服0.2ml(4.26μci)複方組合物。依次在服藥後3，7和24小時殺死小鼠，測定血漿及主要器官中放射性水平。放射性以每1.0g組織含dpm單位表示。實驗結果如表3所示。
表3口服後不同時間過程中組織內14C甘氨酸標記SOD組織衍生物的濃度3小時後7小時後24小時後血漿930479129908肝320485022490027腎120542846562873脾59121039222644肌肉2490345212200
表3內數據顯示含SOD衍生物(從合成實例1製得)的複方組合物有效地轉運到血和不同器官和組織中去。含有得自合成實例2的SOD衍生物相似複方組合物，也可得到同一結果。
因此，當將本發明的SOD衍生物配入本發明的複方組合物中並口服時，產生特別顯著的抗炎效果。
為使上述複方組合物供人臨床應用，可將該複方組合物進一步加工成為合適的劑型供病人服用，例如軟膠囊劑，膠囊劑，片劑，顆粒劑，液劑和栓劑等。
這些製劑的服用劑量通常為0.1-100mg(按SOD衍生物計)，每天1-5次，每天或隔天服用。劑量可按病人的狀況和其他因素加以調節。
(e)實例以下合成實例和配方實例是本發明進一步具體說明。然而不言而喻，本發明決非限於這些特殊的實例。
合成實例1將95mg牛紅細胞SOD(Sigma)在4℃攪拌下，加入10ml 0.1M碳酸氫鈉水溶液中(pH8.0)。向此溶液中逐漸加入17mg固態粉末狀的二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產物(水解度大約等於50%;二乙烯基醚對馬來酐的摩爾比率＝1∶2，Mw＝5600，分子量分布Mw/Mn＝1.5，Mw＝重均分子量，Mn＝數均分子量)。反應進行約1.0小時。將反應混合物倒入Sephadex
G50柱子(4.2×80cm;Pharmacia F.C.)，進行凝膠過濾，用蒸餾水進行洗脫，洗脫液用測定吸光度方法(波長280和220nm)加以監視，將含有未反應的二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產物的級分棄去，剩下級分進行冷凍乾燥，生成色粉末狀SOD衍生物。
所得SOD衍生物的紫外吸收光譜，在磷酸鹽緩衝液中測定，於濃度為1mg/ml，pH7.4時進行。該產物紫外吸收光譜如圖2所示。
上面所用的牛紅細胞SOD的每個分子含有20個氨基基團。為確證這些氨基已經和二乙烯基醚-馬來酐共聚物的部分水解產物進行反應，可應用三硝基苯磺酸鈉(TNBS)測定殘留氨基。在上述反應條件下，發現大約有22%(摩爾)的牛紅細胞SOD的氨基已經起反應，使平均有4-5個二乙烯基-馬來酐共聚物的部分水解產物結合到每一個SOD分子上。
當應用焦棓酚自動氧化法(見EuropeanJournalofBiochemistry47，469-474，1974敘述)測定SOD衍生物酶催活性時，發現SOD衍生物保留了原SOD的45%酶催活性。
合成實例2(a)部分半酯化二乙烯基醚-馬來酐共聚物的合成在體積約為100ml的安瓿(用作封管)內配以磁性攪拌，加進2.0g二乙烯基醚-馬來酐共聚物(二乙烯基醚對馬來酐的摩爾比＝1∶2，Mw＝5600，分子量分布Mw/Mn＝1.5)，0.88g正丁醇，40mg無水醋酸鋰和60ml四氫呋喃，然後封住。將此安瓿內容物在55℃加熱攪拌20小時。取反應混合物等分試樣一份，通過氣相層析(以乙基溶纖劑作為內標)估計反應混合物中未作用的正丁醇。根據所加正丁醇的反應比率，計算出共聚物的馬來酐環轉變到正丁基半酯的轉化率為43.3%(摩爾)。反應混合物在減壓下濃縮，將濃縮液滴加到500ml正己烷中，達到重沉澱目的。生成的沉澱經回收濾集後在室溫乾燥過夜，得1.13g所需的正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物。
(b)通過正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物與SOD反應，合成SOD衍生物將200μl人紅細胞SOD水溶液(62.8mg/ml)和170mg碳酸氫鈉溶於1.8ml等滲磷酸鹽緩衝液(pH7.04)。在室溫攪拌下，向此溶液逐漸加入64mg正丁基半酯化的二乙烯基醚-馬來酐共聚物〔製法見上述(a)〕，使反應再進行2小時，然後在4℃放置過夜。過濾反應混合物，將濾液置於Sephadex
G75(Pharmacia F.C.)柱上作凝膠過濾，用10mM碳酸氫銨水溶液作為洗脫液。將含SOD衍生物的級分進行冷凍乾燥，得8.52mg白色粉末狀SOD衍生物。圖3顯示該產物的紅外吸收光譜(KBr片)。圖4(ⅰ)顯示原料SOD的光密度譜，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(慣常的PAGE方法)測定。圖4(ⅱ)顯示SOD衍生物的光密度譜，圖內a代表SOD，b代表SOD衍生物。
用於以下配方實例的SOD衍生物，按合成實例1製得。按照本發明，類似的複方組合物也可以通過其他SOD衍生物製得。
配方方法1將從合成實例1製得的SOD衍生物，在冰冷下溶於蒸餾水(10mg/ml)。通過滴加0.5M醋酸調節溶液的pH值到大約3.0，然後進行冷凍乾燥。將一種中級/高級脂肪酸甘油酯(增補一種兩親試劑和/或低級鏈烷醇)加到經冰凍乾燥的SOD衍生物粉末中。振搖此混合物，直到獲得宏觀的均勻分散體。應用TOMYUR-150P集成電路塊型超聲波發生器(TomySeiki)作振動處理。這一處理的持續時間不超過30秒鐘。
配方方法2將預定量的兩親試劑加到一定量的蒸餾水中，加進所要求的低級鏈烷醇之後，進行超聲處理，以製成一個溶液。然後，將SOD衍生物粉末(合成實例1)於0.02%碳酸銨水溶液中的溶液(4mg/ml，在冰冷下製備)，以等體積加到上述溶液中去，將此混合液進行冷凍乾燥。然後向生成的冷凍乾燥粉末中，加進中級/高級脂肪酸甘油酯，接著加進所要求的低級鏈烷醇。混合物在冰水浴中作超聲處理30秒鐘。
表4給出用上述方法步驟製得本發明的複方組合物。
權利要求
1.具有通式[SOD][Z]n的超氧物歧化酶衍生物及其藥物學上可接受的鹽，其中[SOD]代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(即在氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團)的超氧物歧化酶；[Z]代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子；上述共聚物的組成單元還包括衍生自上述通式的基團，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那裡的羰基碳原子的鍵連接[SOD])，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000；n代表1-22或24的整數，相應於上述一價基團的數目，這些一價基團各衍生自氨基，即在上述[SOR]中的氨基上除去一個氫原子。
2.權利要求1所述的超氧物歧化酶或其藥物學上可接受的鹽，其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子。
3.一種生產通式為〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物的方法，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團)的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，單價共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團的其中一個除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那裡的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數，相應於上述一價基團的數目，這些一價基團各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個氫原子;此方法包括將超氧物歧化酶與共聚物反應，共聚物組成單元是(a)具有如下通式的基團
其中R1，R2，R3和R4如上所規定，以及(b)選自以下一類的基團如下通式的基團
其中R1和R2分別如上所規定;如下通式的基團
其中R3和R4分別如上所規定;如下通式的基團
在pH7-11的鹼性水溶液的存在下，該共聚物具有平均分子量500-200，000。
4.按照權利要求3生產超氧物歧化酶衍生物或其藥物學上可接受的鹽的方法，其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子。
5.含有通式為〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物或其藥物學上可接受的鹽作為活性成分及藥物學上可接受的載體的抗炎複方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(即從氨基上除去一個氫原子代所剩的一價基團)的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子;上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那裡的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數，相應於上述一價基團的數目，這些基團各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕中的氨基上除去一個氫原子。
6.含有通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物和/或其在藥物學上可接受的鹽以及中級/高級脂肪酸甘油酯的口服藥物複方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生物自氨基的基團(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團)的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團;
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以及R3或R4中各有一個代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那裡的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數，相應於上述一價基團的數目，這些基團各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕的氫基中除去一個氫原子。
7.含有通式〔SOD〕〔Z〕n的超氧物歧化酶衍生物和/或其藥物學上可接受的鹽，以及中級/高級脂肪酸甘油酯，還有兩親試劑和/或低級鏈烷醇的口服藥物複方組合物，其中〔SOD〕代表帶有1-22或24個各自衍生自氨基的基團(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團)的超氧物歧化酶;〔Z〕代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團
其中R1，R2，R3和R4各代表氫原子或由具有1-8個碳原子的鏈烷醇除去羥基衍生的殘基，含有1-4個碳原子的烷基部分的乙二醇單烷基醚，或者含有1-4個碳原子的烷基部分的丙三醇二烷基醚，條件是R1或R2中以R3或R4中各有一個代表氫原子，上述共聚物組成單元還包括衍生自上述通式的基團，即通過從COOR1，COOR2，COOR3及COOR4基團的其中一個，除去OR1，OR2，OR3或OR4衍生的殘基(那裡的羰基碳原子的鍵連接〔SOD〕)，上述單價共聚物平均分子量為500-200，000;n代表1-22或24的整數，相應於上述一價基團的數目，這些基團各衍生自氨基，即在上述〔SOD〕的氨基中除去一個氫原子。
全文摘要
本發明提供一種具通式[SOD][Z]n的超氧物歧化酶衍生物及其藥物學上可接受的鹽。其中[SOD]代表帶有1—22或24個各自衍生自氨基的基團(即從氨基上除去一個氫原子所剩的一價基團)的超氧物歧化酶；[Z]代表單價共聚物基團，其組成單元是有如下通式的基團
文檔編號C12N9/02GK1030426SQ8810316
公開日1989年1月18日 申請日期1988年5月28日 優先權日1987年5月28日
發明者前田浩, 鈴木富士夫, 小田達也 申請人:前田浩, 可樂麗股份有限公司