河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5e7及其輕、重鏈可變區基因與應用的製作方法
2023-05-16 01:35:11 1
河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5e7及其輕、重鏈可變區基因與應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及河豚毒素中和性單抗5E7雜交瘤細胞及輕鏈和重鏈可變區基因和由所述基因編碼的多肽和蛋白質，以及所述基因、多肽和蛋白質在疫苗研製、及製備用於診斷和治療河豚毒素或免疫毒素中毒藥物中的應用。本發明人用一套設計的引物從河豚毒素中和性單抗5E7雜交瘤細胞克隆了抗體輕、重鏈可變區基因。所得可變區基因可編碼正確的小鼠抗體可變區。基於上述已克隆到的河豚毒素中和單抗可變區基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基於上述基因所編碼的多肽或蛋白質，可以交聯多種生物活性分子，製備疫苗及用於河豚毒素檢測、河豚毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物。
【專利說明】河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5E7及其輕、重鏈可變區基因與應用
[0001]應用【技術領域】
[0002]本發明涉及一株河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞(命名為5E7)的製備，具體涉及河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞株的構建和單抗編碼基因的釣取，還涉及其應用。
【背景技術】
[0003]河豚毒素(Tetoodo toxin, TTX)是ー種重要的海洋生物毒素，廣泛存在於海洋生物和陸棲等眾多生物中，並可通過食物鏈富集等途徑汙染其它水產品。TTX中毒屢有發生，死亡率達40%以上。作為ー種潛在的軍用毒劑，TTX已被列入國際生物安全公約清単。目前針對TTX中毒，國內外還沒有適用於人體的專用特效藥，因此迫切需要建立和發展具有自主智慧財產權的以抗體為基礎的檢測和防護用品。
【發明內容】
[0004]本發明的主要內容有以下4個。
[0005]1.抗河豚毒素單抗雜交瘤細胞株的構建
[0006]1.1免疫抗原的製備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 15mg溶於pH5.0的檸檬酸緩衝液中，將此溶液緩慢滴加到15mg KLH/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調pH值到7.0，冰浴下加入1%戊二醛3ml，室溫反應1.5小時，用0.01M PBS 4°C進行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白 ，檢測蛋白定量，既得TTX-KLH複合物即免疫原，分裝10支，Img/支，-20°C以下保存。
[0007]1.2檢測用抗原的製備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) IOmg溶於pH5.0的檸檬酸緩衝液中，將此溶液緩慢滴加到IOmg BSA/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調pH值到7.0，冰浴下加入1%戊二醛3ml，室溫反應1.5小時，用0.01M PBS 4°C進行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白，既得TTX-BSA複合物即免疫原，分裝20支，0.4mg/支，-20°C以下保存。
[0008]1.3抗TTX單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建、篩選和鑑定:選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠6隻，分別用12.g TTX-KLH對小鼠腹股溝皮下多點注射免疫，每三周免疫一次，共免疫4次，常規方法融合。用TTX-BSA間接ELISA篩選，陽性細胞反覆亞克隆直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100%陽性。於Balb/c小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水，ProteinA SepharoseCL4B 親和柱純化，SDS-PAG、間接 ELISA 鑑定。
[0009]2.抗TTX單抗的中和活性測定:選用4-6周齡的昆明小鼠100隻，雌雄各半，將TTX用雙蒸水溶解，原液濃度為lmg/mL，用常規實驗方法檢測TTX的LD50。先將lmg/mL的單抗(對照組用蒸餾水)注入小鼠腹腔，然後注入1.62 u g/ml TTX溶液，動態觀察並記錄小鼠的生存狀態2周。
[0010]3.雜交瘤細胞5E7輕、重鏈基因的釣取:取對數生長期的中和性單抗5E7細胞，用TRIzol提取RNA (圖1)，經RT-PCR，用兩對特異性引物PHsl, PHs2 ;PLsl、PLs2釣取抗體的輕重鏈基因(圖2)。常規法連接入PGEM Teasy載體，轉化感受態細菌JM109，於固體LB平板37°C孵箱12~18小時後挑取單個菌落，提取質粒PCR鑑定後進行DNA測序分析。
[0011]4.單抗5E7輕、重鏈可變區基因序列和胺基酸序列的確定:用www.expasy.0rg在線軟體將核苷酸序列翻譯為其編碼的胺基酸序列。根據Kabat資料庫確定輕鏈可變區序列中的互補決定區⑶R1XDR2和⑶R3。重鏈可變區序列中的互補決定區⑶R1XDR2和⑶R3。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1.兩株TTX單抗的檢測結果 [0013]圖2.TTX單抗雜交瘤細胞染色體核型分析結果
[0014]圖3.TTX中和性單抗5E7雜交瘤細胞RNA提取結果
[0015]圖4.TTX中和性單抗5E7雜交瘤細胞輕重鏈基因的PCR結果I為輕鏈基因；2為DL2000 ；3為重鏈基因，基因大小大約為660bp。
[0016]【具體實施方式】通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進ー步說明，並不意味著限定本發明的範圍。
[0017]實施例ー抗TTX單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建
[0018]1.免疫抗原的製備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 15mg溶於pH5.0的檸檬酸緩衝液中，將此溶液緩慢滴加到15mg KLH/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調pH值到7.0，冰浴下加入I %戊二醛3ml，室溫反應1.5小時，用0.01M PBS 4°C進行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白，檢測蛋白定量，既得TTX-KLH複合物即免疫原，分裝10支，Img/支，-20°C以下保存。
[0019]2.檢測用抗原的製備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) IOmg溶於pH5.0的檸檬酸緩衝液中，將此溶液緩慢滴加到IOmg BSA/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調pH值到7.0，冰浴下加入1%戊二醛3ml，室溫反應1.5小時，用0.01M PBS 4°C進行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白，既得TTX-BSA複合物即免疫原，分裝20支，0.4mg/支，-20°C以下保存。
[0020]3.Balb/c小鼠免疫選用4_6周齡的雌性Balb/c小鼠6隻，分別用12.5 y gTTX-KLH對小鼠腹股溝皮下多點注射免疫，第一針加福氏完全佐劑(Sigma)，第2針加福氏不完全佐劑(Sigma)，每三周免疫一次，共免疫4次，第4次免疫後尾靜脈採血，間接ELISA檢測抗體產生情況，融合前3天，以12.5 Ug TTX-KLH腹腔加強免疫一次，第3天融合。
[0021]4.細胞融合將免疫的小鼠摘眼球後脫頸處死，無菌摘取小鼠脾細胞，按常規方法進行細胞融合。具體方法:①將免疫的小鼠摘眼球放血後脫頸處死，75%酒精浸泡3min，無菌取出脾臟，用200目鋼網研磨單個細胞懸液，無血清RPMI 1640 (Gibco)洗兩次並記數！②收集對數生長期的SP2/0細胞(ATCC引進，本實驗室保存)，用無血清RPMI 1640洗兩次並記數；③按SP2/0細胞:脾細胞=I: 5的比例混合兩種細胞，用RPMI 1640洗I次，棄盡上清，輕輕將細胞打散；@在Imin時間裡緩慢加入Iml 50% PEG (MW 1500)溶液，置37°C水浴Imin ;?在 lmin、2min、2min、5min 時間內加無血清 RPMI16401ml、5ml、10ml、IOml ;? 800r/min離心7min，棄上清，儘可能輕輕將細胞懸起；@加含20% FCS的HAT (Sigma)-RPMI 1640培養液，調整細胞濃度為2X 106/ml，混勻後，滴加在鋪有滋養細胞(I X IO4細胞/孔)96孔培養板(Gibco)中，IOOiU/孔，37°C 5% CO2孵箱中培養。[0022]5.間接ELISA篩選抗河豚毒素單抗雜交瘤細胞純化後TTX單抗用TTX-BSA以40 u g/ml包被酶標板，於4°C過夜並封閉。依次加入待測細胞培養上清液(37°C lh，PBST洗板 4 次)，及 I: 500 稀釋的 50 u L HRP-GAM(37°C 45min，PBST 洗板 4 次)。以 TMB (Sigma)底物顯色後，於450nm波長測定A值(圖1)。
[0023]6.雜交瘤細胞克隆化間接ELISA法篩選為陽性的細胞克隆再反覆亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100%陽性。雜交瘤細胞的克隆化用有限稀釋法:(I)在克隆化的當天或前I天製備滋養細胞:脫頸處理昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮膚，無菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5mL 1640培養液注入小鼠腹腔，反覆衝洗後吸出腹腔洗液，用20%胎牛血清(北京元亨聖馬生物技術研究所)1640培養液稀釋後滴入96孔板，每孔約0.lml。
(2)取少許待作克隆化的雜交瘤細胞移至另ー無菌試管中，並準確計數。(3)有限稀釋法進行亞克隆。(4)將培養板置於5% C02，37°C孵箱中培養，5天左右在顯微鏡下可觀察到細胞克隆。適時換液，檢測，取陽性單克隆細胞株進行擴大培養，及時凍存細胞株。
[0024]7.雜交瘤細胞的染色體核型分析在對數生長期的雜交瘤細胞中加入秋水仙素，終濃度為0.02 u g/mL,在孵箱中繼續培養4小時後收集細胞，經低滲裂解(加入預溫至37°C的0.075MKCL 8mL,輕輕打勻，37 °C 30-40分鐘)、預固定(甲醇:冰醋酸=3: I新鮮配製，輕輕打勻，離心棄上清)和3次固定(第1次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫30分鐘，離心棄上清；第2次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清；第3次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清)處理後用少量固定液製備細胞懸液，滴於冰水浸泡的玻片上，文火烘乾後10% Giemsa染色15-20分鐘，水洗鏡檢(圖
2.)。
[0025]8.雜交瘤細胞免疫球蛋白亞型的確定用羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細胞濃縮後的培養上清作雙相瓊脂擴散實驗，證明5E7雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0026]通過本部分工作，篩選到河豚毒素單抗5E7。雜交瘤細胞5E7染色體平均數目為106條，所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0027]實施例二抗TTX中和性單抗雜交瘤細胞株的篩選和鑑定
[0028]1.TTX對小鼠半數致死劑量LD50的確定選用4_6周齡的昆明小鼠100隻，雌雄各半，將TTX用雙蒸水溶解，原液濃度為lmg/mL，用雙蒸水稀釋為g/ml。將2 y g/ml濃度的TTX 0.5ml分別注入10隻昆明小鼠腹腔後，小鼠於30分鐘內全部死亡；分別用g/ml,1.8 u g/ml,1.6 u g/ml,1.4 u g/ml,1.48 y g/ml、0 y g/ml 濃度的 TTX測得 TTX 的 LD50 為1.62 u g/ml,即 40.5 u g/kg。
[0029]2.抗TTX單抗的中和活性測定將lmg/mL的TTX單抗(對照組用蒸餾水)0.5ml與1.62 u g/ml TTX 0.5ml混合後注入小鼠腹腔，隨時觀察實驗和對照組(各10隻)小鼠的狀況，24小時後通過不斷追加2 u g/ml TTX,每次0.2ml/只，每30分鐘觀察一次，直至對照組小鼠全部死亡，存活小鼠正常飼養，每天觀察一次，記錄生長情況，觀察2周。測得當對照組小鼠全部死亡時，即2LD50時，TTX單抗對實驗小鼠的保護率為50%。
[0030]3.動物體內誘生單克隆抗體製備河豚毒素單抗5E7接種雜交瘤細胞前10天，先給Balb/c小鼠(さ，8~12周)腹腔注射0.5ml液體石臘油。收集對數生長期的雜交瘤細胞，1500r/min離心7min，棄上清，生理鹽水洗2次，最後將細胞濃度調整為4X 107ml，每隻小鼠腹腔注射0.5ml。7~10天後，可見小鼠腹部明顯膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮膚，抽取腹水。將抽取的腹水3000r/min離心lOmin，收集上清，加等量甘油，_20°C凍存備用。
[0031]通過本部分工作，獲得了命名為5E7的河豚毒素中和性單抗交瘤細胞，測得河豚毒素中和性單抗5E7對小鼠的LD50為40.5 ii g/kg。河豚毒素中和性單抗在小鼠注射2倍致死計量的河豚毒素後對一半數量小鼠具有保護作用。
[0032]實施例三河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5E7輕、重鏈基因的釣取
[0033]1.取對數生長期的中和性單抗5E7細胞5X IO6-1O7個，離心去除上清，將細胞均勻彈起。加入lml TRIzol (Invitrogen)反覆吹打使細胞充分裂解,振蕩5分鐘後,加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，2-8°C 12000r/min，離心15分鐘，取上清於另一新管中，加500 ill異丙醇混勻後室溫放置10分鐘，2-8 0C 12000r/min離心10分鐘。75%こ醇洗滌沉澱，乾燥後，用20 ill無RNA酶的去離子水溶解沉澱(圖3)。
[0034]2.取含 I U g 總 RNA 的溶液，依次加入 AMV 5X 緩衝液 4u I, Oligo (dT) (500ng/U 1)0.5u 1,2.5mmol/L dNTP2 u 1，Rnasin (50U/u 1)0.5 u I，去離子水補至 20 u 1、反轉錄酶2-5U，42°C延伸I小時。95°C變性5分鐘，置冰浴中，產物為cDNA第一鏈。用2對特異性引物PHsl、PHal和PLs 1、PLal，在20iU PCR反應體系中，分別加入反轉錄產物2 yl，Taq酶IOXbuffer 2111，上下遊引物各1111，2.5臟01/1 dNTP I yl，加Taq酶1-2U，去離子水補至20iil。95°C變性2分鐘，循環參數為:94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，共30個循環，72°C後 延伸10分鐘(圖4)。
[0035]3.用分離出欲回收的DNA片段，在長波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55°C水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒(OMEGA生物科技公司)回收DNA片段並將純化的DNA片段在水溶液裡，將回收的PCR產物在T4DNA連接酶緩衝液中按2:1的比例(摩爾比)和載體PGEM Teasy (Promega公司)混合後，加入0.5U的T4DNA連接酶(New England Biolabs)於16°C連接過夜，連接反應的總體積為10 u L0
[0036]4.取連接液10 U 1，加入200 U I感受態細菌JM109中並輕柔混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴熱休克90秒，迅速轉入冰浴2分鐘，加800 u I LB培養基，轉入37°C恆溫搖床，以150轉/分鐘的速度搖動45分鐘，4000r/min離心I分鐘，棄去800 U I上清，取沉澱塗布於含Amp (終濃度為100 u g/ml)的固體LB平板，將平板倒置於37°C孵箱12~18小吋。
[0037]5.在上述平板中挑取單個克隆，接種於含氨卞青黴素(IOOii g/mL)的LB培養基中。37°C恆溫搖床170rpm,震蕩培養過夜。取3mL菌液加入1.5mL Eppendorf管中，1000Orpm離心lmin，棄上清。將沉澱菌體重懸於IOOii L溶液I中，加新鮮配製的溶液II 200 u L,輕緩地上下顛倒數次，至液體變清澈為止。隨後，再加入150 u L溶液III，輕柔地上下顛倒數次使液體混勻，此時出現大量白色絮狀沉澱。4°C，12000rpm離心5min，取上清加至另ーEppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酹,劇烈震蕩後，12000rpm離心5min,將上層水相移至一新管中。再加入500 ii L氯仿，重新抽提一次。其後，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無水こ醇混勻，於-20°C放置3h。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，用70%こ醇洗沉澱2次，室溫乾燥20min，以40 y L無菌雙蒸水溶解，進行DNA測序分析。
[0038]6.使用的引物序列如下:
[0039]PHsl:5，-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAGG-3，22[0040]PHs2:5，-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTGG-3，22
[0041]PLsl:5，-CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA-3，32
[0042]PLal:5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA-3，34
[0043]通過本部分工作，構建了河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5E7輕、重鏈基因的載體，經測序分析、序列比對為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)。
[0044]實施例四河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5E7輕、重鏈可變區基因序列和胺基酸序列的確定用WWW, expasy.0rR在線軟體將編碼河豚毒素中和性單抗雜交瘤細胞5E7輕、重鏈可變區核苷酸序列翻譯為其編碼的胺基酸序列(SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)。根據Kabat資料庫確定輕鏈可變區序列中的互補決定區CDRl (SEQ ID N0.5)、CDR2 (SEQ IDN0.6)和CDR3 (SEQ ID N0.7)。重鏈可變區序列中的互補決定區CDRl (SEQ ID N0.8)、CDR2(SEQID N0.9)和 CDR3(SEQ ID N0.10)。
[0045]參考文獻:
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【權利要求】
1.一種雜交瘤細胞，特徵在於染色體平均數目為106條，分泌的免疫球蛋白亞類為IgGl0分泌的免疫球蛋白可特異性結合河豚毒素，並部分中和河豚毒素的體內毒性作用。
2.ー種蛋白質分子，特徵在於具有如序列表中SEQ ID N0.3/或SEQ ID N0.4所示的序列。
3.一種重組蛋白質分子或肽，其特徵在於具有如序列表中SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQID N0.7/或 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10 所示的 CDR1、CER2、CDR3 序列。
4.如權利要求2所述的蛋白質編碼基因，特徵在於具有如序列表中SEQID N0.1或SEQID N0.2所示的核甘酸序列。
5.權利要求所述的細胞、蛋白質分子或肽，在製備河豚毒素檢測、疫苗研製、河豚毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物`中的應用。
【文檔編號】C12N15/13GK103589687SQ201210509474
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年12月3日 優先權日:2012年12月3日
【發明者】郭建巍, 秦力維 申請人:中國人民解放軍海軍總醫院