一種鑑別牛羊肉真假的lamp檢測方法
2023-05-06 19:35:06 1
專利名稱：一種鑑別牛羊肉真假的lamp檢測方法
技術領域：
本發明涉及涉及利用LAMP技術鑑別牛羊肉的真假，屬於分子遺傳學領域。
背景技術：
目前，國內牛肉價格的飛速上漲和短缺導致國外的牛肉大量通過走私等途徑進入中國，同時，國內也出現了很多不和諧的現象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加劑使豬肉變牛肉的事件，此後，在全國多個省市均發現了類似的產品。一時間，人們對牛肉等食品安全的關注成為了全社會的焦點。其實，牛肉市場面臨的豬肉變牛肉事件僅是冰山的一角。在社會上還大量存在著用雞肉、鴨肉等低價肉甚至是一些病死肉加工冒充牛肉的現象。面對目前牛羊肉市場存在的亂象，人們只能從色澤、氣味、彈性等多個方面進行初步鑑別，但大多數消費者都不可能掌握這種專業知識，很難對生牛肉進行鑑別，對加工後的牛肉則更是難以鑑別。目前社會上缺乏牛羊肉的準確鑑別技術。通過現代化的DNA鑑定技術，可以進行鑑別。早在2008年新華每日電訊就報導過杭州一個市民買10元牛肉花2800 元進行DNA鑑定的事件，2010年中新網報導了寧波一個消費者花1800元通過DNA親子鑑定技術鑑別牛肉真假的事件，表明這種方法雖然能夠鑑別，但所需時間長，費用高。因此，迫切需要建立一種簡單、廉價的牛羊肉鑑別方法，以維護牛羊肉市場的安全，保護廣大消費者的身體健康。線粒體基因組具有種內高度保守的特性，在肉製品和飼料的鑑別中越來越被受到重視。近年來，基於線粒體基因的鑑定方法不斷出現，包括PCR-RFLP、多重PCR、螢光定量 PCR等，這些方法都需要涉及到PCR、螢光定量PCR等昂貴儀器。
發明內容
本發明的目的是針對國內外已有方法在檢測技術上存在的缺點，在檢測技術上加以改進。環介導等溫擴增技術(LAMP)是由日本學者Notomi T等(2000)設計創立的，這種新型核酸擴增技術具有靈敏度高、反應迅速，特異性強等優點。本發明利用LAMP技術和動物線粒體DNA相結合對牛羊肉進行鑑定，整個反應可在恆溫狀態下在Ih之內就可完成，而且可以通過肉眼觀察到反應結果。本發明的技術方案是一種鑑別牛羊肉真假的LAMP檢測方法，(I)從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列，並進行軟體比對分析，確定序列的準確性；(2)根據步驟⑴的序列設計多組引物，每組引物包括一對外引物F3/ B3和一對內引物FIP/BIP，引物設計通過登陸Eiken Chemical公司的在線軟體 PrimerExplore (http://www. primerexplorer. jp/e/)進行；利用 LAMP 實時池度儀對設計引物進行特異性篩選，確定高度特異性的引物；(3)配置23 μ L LAMP反應液，構建成檢測體系；所述23 μ L LAMP反應液含有 12. 5μ L 2X 等溫反應緩衝液、I μ L 5μΜ Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3,2μ L20yMPrimer FIP、2yL 20 μ M Primer BIPU μ L Bst DNA 聚合酶、3· 5 μ L 水；其中2X 等溫反應緩衝液含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl (pH8. 8)、20mM的氯化鉀、16mM 的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜鹼、2. 8mM dNTP。(4)按常規方法提取基因組DNA，取I μ L提取的基因組DNA和I μ L的螢光檢測試劑(Fluorescent Detection Reagent, FDR)加入 LAMP 反應液中，使終反應體積為 25 μ L, IOOOOrpm瞬時離心30秒混勻反應液；(5)置60 V恆溫水浴中進行LAMP擴增；(6)根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成綠色，說明待測樣品存在牛羊肉；若為桔黃色，則待測樣品不存在牛羊肉。本發明的優點是提供了一種利用LAMP技術，準確、廉價鑑別牛羊肉真假的標準方法。本方法具有眾多優點，一是模板和引物製備簡單，容易操作；二是具有高度的特異性，準確性高達100%;三是具有高度的靈敏度，比普通PCR更為靈敏，僅需極少量的樣品即可(小於I克)；四是結果判定方便，通過肉眼觀察即可。但本方法暫時無法區分牛肉和羊肉。本發明可用於任何具備相應儀器設備的部門進行牛羊肉的真假鑑別，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
圖I為5組LAMP引物進行特異性篩選圖。圖I中引物自左向右順序依次為陽性對照、陰性對照、引物I、引物2、引物3、引物4、引物5。圖2為各種畜禽DNA進行LAMP檢測試驗圖。圖2中自左向右DNA順序為陽性對照，陰性對照，豬肉、牛肉、鴨肉、羊肉、兔肉；結果顯示第1、4、6管為綠色，其餘的枯黃色。圖3為PCR檢測方法靈敏度示意圖，其中自左向右依次為以10-1、10-2.........
10-7稀釋度的Positive Control DNA(PC DNA)為模板的樣品和標準品的PCR檢測圖。
具體實施例方式實施例II、儀器設備LAMP實時濁度儀LA-320C、普通水浴鍋。2、所用試劑除由生產廠家直接提供的以外，其它均為分析純，水為超純水。3、具體操作步驟(I)從GenBank中檢索獲得牛452bp 12s RNA序列，並進行軟體比對分析，確定序列的準確性。12S rRNA 序列如下GACCCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTTAGCCCTAAACACAG ATAATTACATAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACTAGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTA TATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATAT ACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTG TAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATTATGAAACCAA TAACCAAAGGAGGATTTAGCAGTAAACTAAGAATAGAGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGC CCGTCACCCTCCTCAAATA(SEQ NO. 5)(2)根據上述序列利用PrimerExplore軟體設計5組引物,進行特異性篩選。引物I:
F3 CCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGB3 GCTTCATGGCCTAATTCAACFIP GAATGTAGCCCATTTCTTCCCATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGBIP TCTACACCAAGAGAATCAAGCACGGCACTCTATTCTTAGTTTACTGC引物2:F3 GCTTAAAACTCAAAGGACTTGGB3 AGCCCATTTCTTCCCATTFIP GCAAGAATTGGTGAGGTTTATCGGTATATCCTTCTAGAGGAGCCTBIP CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT引物3:F3 AACAGCTTAAAACTCAAAGGAB3 AGCCCATTTCTTCCCATTFIP TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTTBIP CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT引物4:F3 GCTTAGCCCTAAACACAGATB3 AGGGTTTGCTGAAGATGG FIP TAAAGCACCGCCAAGTCCTTTACATAAACAAAATTATTCGCCAGBIP TATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCGGTATATAGACTGTATTAGCAAGAA引物5:F3 CCCAAACTGGGATTAGATACCB3 CTGTATTAGCAAGAATTGGTGAFIP TGCTAGTAGTACTCTGGCGAATAATACTATGCTTAGCCCTAAACACBIP ACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGGGTTTATCGGGGTTTATCGA(3)篩選LAMP弓丨物配置反應液LAMP反應液構成為每23 μ L的LAMP反應液中含有12. 5 μ L 2 X等溫反應緩衝液、I. OuL 5 μ M Primer F3> I μ L 5 μ M Primer Β3>2 μ L 20 μ M Primer FIP>2 μ L20 μ M Primer BIPUuL Bst DNA聚合酶、3. 5 μ L水。其中2 X等溫反應緩衝液由日本榮研化學株式會社提供，含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8. 8)、20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM 硫酸銨、20% 的 Tween20、l. 6M 甜菜鹼、2. 8mM dNTP。對⑵中所述的5對引物按照上面所述的體積加入LAMP反應液中，同時加入I μ L 螢光檢測試劑和I μ L牛的基因組DNA，使得終反應體積為25 μ L，樣品放置在LAMP濁度儀中進行引物特異性的篩選。對濁度儀進行一系列的參數設定之後，儀器每6秒檢測一次濁度，然後根據濁度來對引物進行篩選(如圖I所示)。其中引物3反應時間最短(大概在 40min左右)，其次是引物4 (大概在43min左右)和引物I (46min左右)，引物2和引物5 在60min內未出(即顯陰性)。因此，確定引物3為最優引物。(4)標本的採集嚴格無菌採集各種畜禽DNA的新鮮肌肉組織，採用酚仿提取法提取組織樣的基因組DNA。(5)取I μ L提取的基因組DNA和I μ L的螢光檢測試劑(優選為Loopamp螢光檢測試劑)加入篩選得到的LAMP反應液中，使終反應體積為25 μ L，IOOOOrpm瞬時離心30秒混勻反應液；同時設陰性、陽性對照。(6)置60°C恆溫水浴中培養45分鐘進行LAMP擴增；(7)根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成綠色，說明待測樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測樣品不存在牛羊肉。(8)靈敏度和特異性檢驗採用豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、兔肉來檢測特異性，結果顯示，LAMP檢測體系的特異性測試良好(如圖2所示)。以ΙΟ'ΚΓ2.........1(Γ7 稀釋度的 Positive Control DNA (PC DNA)為模板分別進
行LAMP和PCR比較兩種檢測方法的靈敏度，結果顯示，LAMP法的擴增靈敏度比普通PCR法要高。普通PCR可以檢測到7個稀釋梯度中的第三個梯度(如圖3所示)，而LAMP法可以檢測到第四個梯度。實施例2從山東省內屠宰廠生產線採集鮮牛肉樣品45個，鮮羊肉樣品32個，鮮雞肉樣品70 個，鮮鴨肉樣品50個，鮮兔肉樣品30個，應用實施例I的方法進行檢測。檢測結果如下表I山東省內屠宰廠生產線牛羊肉檢測結果
權利要求
1.一種鑑別牛羊肉真假的LAMP檢測方法，其特徵是，(1)從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列，並進行軟體比對分析，確定序列的準確性；(2)根據步驟(I)的序列設計多組引物，每組引物包括一對外引物F3/B3和一對內引物 FIP/BIP ;並利用LAMP實時濁度儀對設計引物進行特異性篩選，確定高度特異性的引物；(3)配置23μ L LAMP反應液，構建成檢測體系；所述23 μ L LAMP反應液含有12. 5 μ L 2Χ 等溫反應緩衝液、I μ L 5μΜ Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3,2μ L20yM Primer FIP、2yL 20 μ M Primer BIPUuL Bst DNA聚合酶、3· 5 μ L水；其中2Χ等溫反應緩衝液含有40mM的pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20% 的 Tween20、l. 6M 甜菜鹼、2. 8mM dNTP ；(4)按常規方法提取基因組DNA，取Iμ L提取的基因組DNA和I μ L的螢光檢測試劑加入LAMP反應液中，使終反應體積為25 μ L，IOOOOrpm瞬時離心30秒混勻反應液；(5)置60°C恆溫水浴中進行LAMP擴增；(6)根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成綠色，說明待測樣品存在牛羊肉； 若為桔黃色，則待測樣品不存在牛羊肉。
2.如權利要求I所述的一種鑑別牛羊肉真假的LAMP檢測方法，其特徵是，引物設計通過登陸Eiken Chemical公司的在線軟體PrimerExplore進行。
全文摘要
本發明公開了一種鑑別牛羊肉真假的LAMP檢測方法，屬於分子遺傳學領域。它從GenBank中檢索獲得牛種屬特異性的保守序列設計引物，並利用LAMP實時濁度儀對設計引物進行特異性篩選；然後配置LAMP反應液，構建成檢測體系；再取1μL提取的基因組DNA和1μL的螢光檢測試劑加入LAMP反應液中進行LAMP擴增；根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成綠色，說明待測樣品存在牛羊肉。該方法可方便、準確的檢測出被檢肉產品是否存在牛羊肉。本方法的模板、引物製備簡單，特異性和敏感度高，檢測結果可通過肉眼直接觀測，可滿足具備相應設備的各檢測部門進行檢測的需要，應用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK102586436SQ20121003951
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者萬發春, 劉曉牧, 劉桂芬, 宋恩亮, 成海建, 譚秀文 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所