一種IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法

2023-05-01 15:43:41

專利名稱：一種IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種腎小球硬化模型的建立方法，具體地，涉及一種IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法。
背景技術：
IgA腎病是以腎小球繫膜區IgA沉積為特徵的腎小球腎炎，有學者將其歸為系統性疾病的範疇，但大多數學者將IgA腎病分為原發和繼發，常見的繼發性IgA腎病為紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎和B肝/肝硬化相關性腎炎。IgA腎病是世界範圍內最常見的原發性腎小球疾病，即使是IgA腎病發病率比較低的美國，20 -39歲的成人中，IgA腎病仍佔原發性腎小球病的第一位。由於IgA腎病具有多樣的臨床表現、複雜的病理改變和不同的預後， 越來越多的學者認為IgA腎病不是單一的疾病，而是一個症候群。過去認為IgA腎病是一種預後良好的疾病，現在認為IgA腎病是一種進展性疾病， 只有5 %-30%的IgA腎病患者尿檢異常能完全緩解，大多數患者呈慢性進行性發展。從首發症狀起，每10年約有20 %的患者發展到終末期腎病。關於IgA腎病進展的危險因素，學術界意見比較一致的是腎小球硬化、腎間質纖維化、高血壓、大量蛋白尿和腎功能損害。由於腎小球硬化和腎間質纖維化是不可逆的損害，因此是預後不良的強力危險因素。對IgA腎病的確切發病機理目前尚未清楚，因此，針對本病的發生缺乏特異性的治療。由於腎纖維化是本病進展至終末期腎臟病的中間環節，因此如何阻斷或延緩腎纖維化的發生及發展是目前學術界關注的熱點。應用比較生物學的方法，建立適當的動物模型， 不僅能促進藥物作用機制的研究和臨床藥物開發，而且為研究IgA腎病的病因、發病機制和病理生理改變提供重要線索。目前，有關IgA腎病動物模型根據建立方法不同可基本分為誘發性，繼發性，複合性，自發性和基因工程性等五類
1.誘發性IgA腎病動物模型。本類型模型出現最早，並且被廣大腎臟病研究人員廣泛採用，根據其誘導方法又可初步分為以下幾類免疫複合物誘導、微生物及其成分誘導、異種蛋白誘導。國外較為經典的模型是利用差速離心法提取副流感嗜血桿菌外膜蛋白抗原，經口服免疫或腹腔注射以誘發小鼠IgA腎病。病理檢查發現口服抗原40周、腹腔注射30周均可有腎小球內IgA沉積，實驗動物同時出現蛋白尿，IgA沉積與繫膜增生程度相關。國內較為經典的模型是劉志紅製作的金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)誘發的 IgA腎病模型和韓慶烽製作的大腸桿菌誘發的IgA腎病模型，他們分別從腸道感染等角度對IgA腎病的發病機理作出探討。韓慶烽等實驗表明，BALB/c小鼠經腹腔注射大腸桿菌全細胞或細胞壁成分後可以出現腎小球繫膜區IgA為主的免疫沉積及電子緻密物的沉積，即出現IgA腎病的病理學改變，但實驗中未出現繫膜區C3的沉積，同時實驗小鼠也未出現蛋白尿或血尿。異種蛋白誘導，一般使大(小)鼠口服牛血清白蛋白(BSA)，常與其他方法聯合應用，例如BSA加尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素(SEB)複合感染法、BSA合併行肝左葉部分切除， 其基本原理可能為SEB靜脈注射後通過損傷腸壁毛細血管內皮使腸黏膜的通透性增加，或人為破壞部分肝臟清除IgA能力，以增強食物抗原BSA刺激機體IgA分泌量增加，清除量減少，最終增強IgA在腎臟的沉積。2.繼發性IgA腎病動物模型。繼發病變型主要指某些全身性疾病發展時可導致腎內IgA免疫複合物沉積，出現 IgA腎病的臨床表現。此類模型多採用肝臟切除或誘導動物肝硬化的方法使肝臟IgA清除減少，另外狼瘡性腎炎、過敏性紫癜腎炎也可見到繼發性繫膜區IgA沉積，但由於繼發性腎臟改變常受原發病的影響，限制了其實際應用。3.複合性IgA腎病動物模型。本類模型系綜合採用不同種類誘導方法製作，例如劉志紅等製作的繼發於肝硬變的IgA腎病混合模型，分別腹腔注射10%四氯化碳，尾靜脈注射SEB，結果發現出現腎臟IgA 沉積，並且出現較重蛋白尿。4.自發性IgA腎病動物模型。人類IgA腎病具有一定的家族遺傳傾向，其發病可能與血管緊張素轉換酶等多種基因多態性有關。與之類似，自發病變型IgA腎病動物模型中某些純系動物具有IgA腎病易感性，有學者將HIGA小鼠施行部分腎切除，結果這些小鼠出現進行性腎小球硬化，局部 TGF-β升高，該模型被認為可用於研究進行性硬化性IgAN。5.基因工程IgA腎病動物模型。利用轉基因、基因敲除、基因替換等手段，使用某種或某些遺傳性狀通過基因工程技術而被人為改造過的動物製作IgA腎病動物模型是近年來這一領域的新興前沿。較有代表性的有子宮蛋白缺陷模型、Fl-bcl-2轉基因小鼠模型、FcaRI (⑶89)轉基因小鼠模型等， 他們分別證實了 IgA腎病發病的某方面因素，並在一定程度上發生了 IgA腎病特徵的病理改變。由於實驗動物與人類的差異性，且對於IgA腎病的病因至今尚無確切解答，因此目前存在的多種IgA腎病實驗動物模型很難完全令人滿意。例如，繼發性和混合性模型攙雜了較多其他因素，不能很好的模擬IgA腎病原發過程；基因工程性模型和自發性模型價格過於昂貴价格，國內難以推廣等等。目前，只有SEB (或以SEB為主)誘導的模型接近人類 IgA腎病發病過程，反映其部分病理改變特點，但是該模型的不足之處在於腎小球纖維化形成的時間較長。進一步探索、尋找一種近似人類IgA腎病發病規律並且腎纖維化出現時間早的動物模型無疑是IgA腎病研究過程當中一個迫切需要解決的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於IgAN腎小球硬化模型的建立方法，將採用微生物和複合蛋白共同進行誘導的複合感染法和通過部分腎切除建立自發性腎小球硬化動物模型的方法相聯合，並對該造模方法進行檢驗。為了達到上述目的，本發明提供了一種IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，該方法包含以下步驟步驟1，選取SD (Sprague Dawley)雄性大鼠飼養1周後，隔日給予牛血清蛋白(BSA)酸化水溶液灌胃，第2-4周每周從大鼠陰莖靜脈注射金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)溶液以及從腹腔注射完全弗氏佐劑(一種免疫佐劑，成分為石臘油+羊毛脂+ 卡介苗)；步驟2，將步驟1所得的大鼠在第5周和第6周分兩次進行手術腎切除，兩次手術共切除腎臟的5/6。上述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步驟1所述的牛血清蛋白酸化水溶液的濃度為40mg/ml，隔日給藥一次，給藥周期為第1_15周，即在第1_15周給藥。上述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步驟1所述的金黃色葡萄球菌B型腸毒素溶液濃度為0. 08mg/ml，每周給藥一次，給藥周期為第2_4周，即在第2_4周給藥。上述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步驟1所述的完全弗氏佐劑劑量為0. 2ml/只.qw，給藥周期為第2_4周，即在第2_4周、每周給藥一次、每隻給藥0. 2ml (qw 每周一次，每次時間固定)。上述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步驟2所述的兩次手術腎切除，第一次手術切除左腎的2/3，一周後行第二次手術，切除右腎。上述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，所述的建立方法還包含對IgAN腎小球硬化大鼠模型建立的檢驗方法，包含進行大鼠血清尿素氮(BUN)、血肌酐 (Scr)、血清胱抑素C (血清CysC)、尿沉渣紅細胞測定(尿沉渣RBC測定)、M小時尿蛋白定量(24hUP)、尿胱抑素C (尿CysC)的動態變化數據的測定，以上數據均增加，即出現血尿、 蛋白尿現象，則說明所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型已建立。其中，血清尿素氮、血肌酐通過全自動生化分析儀測定，血清胱抑素C通過ELISA法測定，尿沉渣紅細胞測定通過尿沉渣儀，24小時尿蛋白定量通過考馬斯亮藍法測定，尿胱抑素C通過ELISA法測定。本發明具有以下優點
通過本發明所採用方法建立的IgAN腎小球硬化模型，其腎小球IgA沉積的強度及硬化發生的時間早於目前國內外常用的複合感染的方法。由於縮短了模型製作時間、強化了纖維化的發生、發展，故該模型能夠更好地服務於IgA腎病醫學科研工作，縮短實驗周期，並在此基礎上探討相關藥物延緩或逆轉IgAN腎小球硬化發生發展，推遲其進入終末期腎臟病的時間，進而減少透析所帶來的巨額醫療開支。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施方式
作進一步地說明。實施例一
1.複合感染。將SD雄性大鼠適應性飼養1周後，開始隔日給予40mg/ml BSA酸化水溶液灌胃， 第2-4周每周從大鼠陰莖靜脈注射SEB 0. 08mg/ml. qw和從腹腔注射完全弗氏佐劑0. 2ml/ 只· QWo2. 5/6 腎切除。第五周進行左腎2/3切除，麻醉後取俯臥位固定於手術臺上，在背部手術區常規消毒，鋪巾，取背左側直切口切開皮膚，分開腰大肌，進入腹膜後，找到腎臟，並用止血鉗分離腎周圍脂肪囊和腎蒂，逐層切開皮下組織和包膜，特別小心的分離開腎上腺，避免損傷， 充分暴露左側腎臟，暴露腎蒂，用纖維止血鉗夾住腎蒂，用眼科手術剪分別剪除左腎上下個1/3左右皮質，用吸收性明膠海綿壓迫止血，開止血鉗，觀察有無出血，復位殘腎，腹腔注入青黴素預防感染，關閉腹腔，縫合肌肉和皮膚，術後常規給予青黴素肌肉注射3d，餵水並觀察。一周後，即第6周行第二次手術，將右腎切除。同樣充分暴露右側腎臟後，用止血鉗在腎門下夾閉腎蒂，摘除腎臟，然後清理腹腔，提取未剪除的腎蒂結紮線頭，並將結紮的腎蒂放入腹腔。確定無出血後剪短結紮線頭，腹腔注入青黴素，關腹，縫合。術後常規給予青黴素肌肉注射。兩次手術共切除5/6的腎臟，手術全過程均有一人執刀完成。實施例二
1. IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立。將SD雄性大鼠96隻適應性飼養1周後，根據體重按隨機數字表分為4組，即假手術組(A組)、5/6腎切除組(B組)、複合感染組(C組)、複合感染聯合5/6腎切除組(D組) 各組M只。(1) . A組假手術組，灌胃和靜脈注射時給予等量的生理鹽水，進行假手術，即大鼠腹腔注射麻醉藥後，游離雙側腎臟、剝離腎周脂肪後，將腎臟復位，其餘操作與實施例一中5/6腎切除方法相同。(2). B組5/6腎切除組，灌胃和靜脈注射時均給予等量的生理鹽水，5/6腎切除操作過程與實施例一中相同。(3). C組複合感染組，對該組動物進行複合感染，具體操作與實施例一中複合感染部分相同。(4). D組複合感染聯合5/6腎切除，具體操作與實施例一相同。2. IgAN腎小球硬化大鼠模型的檢驗。(1).觀察第0、4、8、12周大鼠血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)和血清胱抑素C (血清CysC)的動態變化情況。血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)，採用全自動生化分析儀(HITACHI 7600-010) 進行檢測，日本HITACHI公司生產。血清胱抑素C (血清CysC)的檢測方法為ELISA法。所得結果如下所示。表1 不同時間點血清BUN的結果(Z 士S)。
權利要求
1.一種IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其特徵在於，該方法包含以下步驟 步驟1，選取大鼠飼養1周後，隔日給予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周從大鼠陰莖靜脈注射金黃色葡萄球菌B型腸毒素溶液以及從腹腔注射完全弗氏佐劑；步驟2，將步驟1所得的大鼠在第5周和第6周分兩次進行手術腎切除，兩次手術共切除腎臟的5/6。
2.如權利要求1所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其特徵在於，步驟1所述的牛血清蛋白酸化水溶液的濃度為40mg/ml，隔日給藥一次，給藥周期為第1_15周。
3.如權利要求1或2所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其特徵在於，步驟 1所述的金黃色葡萄球菌B型腸毒素溶液濃度為0. 08mg/ml，每周給藥一次，給藥周期為第 2-4 周。
4.如權利要求3所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其特徵在於，步驟1所述的完全弗氏佐劑劑量為0. 2ml/只.qw，即每周給藥一次、每隻大鼠給藥0. ^il,給藥周期為第2-4周。
5.如權利要求1所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其特徵在於，步驟2所述的兩次手術腎切除，第一次手術切除左腎的2/3，一周後行第二次手術，切除右腎。
6.如權利要求1所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，其特徵在於，所述的建立方法還包含對IgAN腎小球硬化大鼠模型建立的檢驗方法，包含進行大鼠血清尿素氮、血肌酐、血清胱抑素C、尿沉渣紅細胞測定、M小時尿蛋白定量以及尿胱抑素C的動態變化數據的測定，以上數據均增加，說明所述的IgAN腎小球硬化大鼠模型已建立。
全文摘要
本發明公開了一種IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，該建立方法包含步驟1，選取大鼠飼養1周後，隔日給予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周從大鼠陰莖靜脈注射金黃色葡萄球菌B型腸毒素溶液以及從腹腔注射完全弗氏佐劑；步驟2，將步驟1所得的大鼠在第5周和第6周分兩次進行手術腎切除，兩次手術共切除腎臟的5/6。本發明提供的IgAN腎小球硬化大鼠模型的建立方法，縮短了IgAN腎小球硬化大鼠模型的製作時間、並強化了腎組織纖維化的發生、發展，故該模型能夠更好地服務於IgA腎病醫學科研工作。
文檔編號A61K39/39GK102499179SQ20121000257
公開日2012年6月20日 申請日期2012年1月6日 優先權日2011年11月24日
發明者付文成, 劉育軍, 吳芳, 姚衛國, 彭文, 朱冰冰, 李琦, 殷佩浩, 王雲滿, 王浩, 程蔚蔚, 金周慧 申請人:上海市普陀區中心醫院