花鱸胚胎幹細胞及培養方法
2023-05-01 23:29:16
專利名稱：花鱸胚胎幹細胞及培養方法
技術領域：
本發明屬於細胞生物技術中的細胞培養技術，是在體外人工培養條件下，以花鱸囊胚期細胞為材料獲得具有發育多能性和無限增殖能力的細胞--胚胎幹細胞的一種技術方法。
背景技術：
魚類胚胎幹細胞是從魚類早期囊胚中分離培養出的具有發育全能性的未分化細胞系。本發明做出之前，國際上對魚類胚胎幹細胞培養的研究主要集中在小型模式魚類斑馬魚和青鱂上1992年美國的Collodi等嘗試培養斑馬魚胚胎幹細胞，但未獲成功；1995年美國的Sun等借鑑小鼠胚胎幹細胞的培養方法獲得了斑馬魚胚胎幹細胞系，培養方法如下以斑馬魚的成纖維細胞系(ZEF)作為滋養層細胞，將斑馬魚囊胚期細胞與其共培養，培養基為LDF基礎培養基，添加0.18mg/ml碳酸氫鈉、15mmol/lHepes(pH7.4)、400μg/ml青黴素、400μg/ml鏈黴素、50μg/ml氨苄青黴素、10μg牛胰島素、0.4％鱒魚血清和5％小牛血清等物質，所培養的細胞具有鼠類胚胎幹細胞的形態，並且具有高的鹼性磷酸酶活性。1994年日本的Wakamatsu等採用滋養層細胞培養系統建立了青鱂胚胎幹細胞系，該細胞系在形態、鹼性磷酸酶活性及分化能力等具有胚胎幹細胞的特徵。德國Hong和Schartl(1996)以DMEM培養基為基礎培養基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.4)、50μg/ml青黴素、50μg/ml鏈黴素、50μg/ml氨苄青黴素、2mmol/l穀氨酸、15％胎牛血清和1％魚血清等物質培養青鱂囊胚細胞，獲得了穩定傳代的青鱂胚胎幹細胞系，細胞具有哺乳動物胚胎幹細胞的許多特徵。而有關花鱸胚胎幹細胞系的建立國內外均未見報導。
發明內容
本發明的目的是建立花鱸胚胎幹細胞及培養方法，使細胞保持良好的生長狀態及其典型的胚胎幹細胞特徵，為開展魚類基因打靶和基因功能研究提供細胞基礎，為海水魚類基因工程育種提供技術手段。
本發明是按如下技術內容實現的花鱸胚胎幹細胞其特徵為細胞小且呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15-25um，具有大的細胞核和較少的細胞質，細胞增殖速度快，在24℃下，細胞倍增時間為20小時左右；在人工誘導條件下，可以分化成神經細胞、肌肉細胞和神經膠質細胞等不同細胞類型。
花鱸胚胎幹細胞的培養方法本發明是按以下操作程序完成的花鱸胚胎囊胚期細胞的收集；胚胎幹細胞的培養和傳代，包括對囊胚期細胞進行原代培養和早期傳代培養、溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響、穩定胚胎幹細胞的培養。對培養的花鱸胚胎幹細胞進行特徵鑑定，包括形態學鑑定、鹼性磷酸酶檢測、倍性檢測，細胞發育多能性的鑑定。
花鱸胚胎囊胚期細胞的收集採集花鱸胚胎，鏡檢合格後在常溫下培養至中囊胚期時使用，此時囊胚期細胞數目為1000個左右。將花鱸囊胚分組，每組為50-70個胚胎，從中分離出囊胚期細胞，用於原代培養。
胚胎幹細胞的培養和傳代對囊胚期細胞進行原代培養和早期傳代培養將收集的囊胚期細胞接種到24孔細胞培養板中單層培養，加入完全培養基1.0ml，24℃培養。待培養2-3天後，更換培養基，細胞長滿培養孔，按1∶2的比例進行細胞傳代，每2-3天更換1次培養基，1周傳代2-3次。完全培養基配方為DMEM培養基為基礎培養基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.5)，100U/ml青黴素，100U/ml鏈黴素，2mmol/l穀氨酸、1mmol/l丙酮酸鈉，1mmol/l非必需胺基酸，5ng/ml重組人白血病抑制因子，15％胎牛血清和1％花鱸魚血清，0.1％胚胎抽提物，8nM的亞硒酸鈉，5ng/ml的成纖維生長因子，27.5μM巰基乙醇。
溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響研究發現，LJESl在4-32℃下都能存活，適宜生長溫度為20-28℃；在4℃下，細胞可存活40天，再轉到24℃下依然生長良好，能正常傳代；在32℃下，LJES1細胞可以生長、增殖，但生長速度開始下降，細胞最適宜溫度為24-28℃，28℃細胞生長速度達到最大。適宜LJES1生長的最適pH值為7.2-7.4。
穩定胚胎幹細胞的培養形成穩定的胚胎幹細胞系後，細胞保持較快的生長速度，基本上不再自發分化，得到第13、35和60代胚胎幹細胞倍增時間分別為19.76、20.67和21.31小時，在60小時細胞增殖速率達到最大。
花鱸胚胎幹細胞特徵鑑定形態學鑑定在100×和400×的相差顯微鏡下觀察細胞的外形和細胞大小，顯微照相記錄細胞形態，比較本細胞與典型的胚胎幹細胞的異同，其細胞具有典型的胚胎幹細胞特徵多邊形或多角形，具有大的細胞核，一個或兩個核仁，細胞的直徑約為15-25um。
鹼性磷酸酶檢測細胞經1％多聚甲醛固定，BCIP/NBT作為反應底物，在黑暗環境下對細胞進行染色，囊胚中期細胞為對照，相差顯微鏡觀察結果為其細胞被染色顯現紫紅色。
倍性檢測對胚胎幹細胞進行常規的染色體製備，顯微鏡下觀察染色體形態，統計二倍體細胞的比率，即染色體數目為48條的細胞所佔比率為60％以上。
細胞發育多能性的鑑定通過花鱸胚胎幹細胞的分化能力驗證。體外誘導分化主要是在培養基中添加視黃酸(RA)，可以形成多種不同類型的細胞如神經樣細胞、肌肉樣細胞、纖維樣細胞和擬胚體等；體內誘導分化主要是通過細胞移植構建嵌合體進行多能性的鑑定。
本發明與已有技術對比，具有以下特點目前除本發明外，國內外尚無花鱸胚胎幹細胞培養的報導，國際上成功的胚胎幹細胞培養也主要局限在小型模式魚青鱂和斑馬魚上。本發明首次建立了花鱸胚胎幹細胞系及其培養方法。建立的花鱸胚胎幹細胞培養方法適用於大型的、經濟價值較高的海水魚類，本發明拓寬了魚類胚胎幹細胞培養的研究範疇，突破了以往魚類胚胎幹細胞培養僅具有理論意義的局限，為進一步將魚類胚胎幹細胞應用於生產實踐提供了技術手段。
本發明所採用的是無滋養層細胞培養方法。與斑馬魚胚胎幹細胞和小鼠胚胎幹細胞培養常用的滋養層培養法相比，本方法無需培養用於控制胚胎幹細胞分化的滋養層成纖維細胞，而是在培養基中添加LIF因子來控制細胞分化，為保證細胞能有效貼壁，則採用0.1％明膠處理培養板的方法；因此，本發明具有操作簡單、培養方便的優點。另外，本方法可保證細胞處於快速、穩定的生長狀態。
具體實施例方式下面通過實施例詳細敘述本發明的內容花鱸胚胎幹細胞培養採用較為簡單的無滋養層培養法，更為重要的是，花鱸是我國重要的海水養殖品種，經濟價值較高。花鱸胚胎幹細胞不僅可以作為海水魚類模式細胞，為開展基因打靶研究奠定細胞學基礎，並且在魚類功能基因研究、定點突變的轉基因研究等方面也有重要作用。建立簡便、有效的花鱸胚胎幹細胞培養方法在開展海水魚類基因工程育種研究和實際生產應用方面意義重大。
花鱸胚胎幹細胞是從花鱸囊胚期胚胎中分離出的、具有發育全能性的細胞，其特徵是細胞小、呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15-25um，具有大的細胞核和較少的細胞質，具有高的鹼性磷酸酶活性、細胞增殖速度快，在24℃下，細胞倍增時間為20小時左右；在人工誘導條件下，可以分化成不同細胞類型，通過細胞移植，可以在受體囊胚內分化發育形成不同的組織和器官，從而形成嵌合體。
花鱸胚胎幹細胞的培養方法本發明是按以下操作程序完成的花鱸胚胎囊胚期細胞的收集；胚胎幹細胞的原代培養和傳代培養，包括對囊胚期細胞進行原代培養和早期傳代培養；溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響；穩定胚胎幹細胞的培養；對培養的花鱸胚胎幹細胞特徵進行鑑定，包括形態學鑑定、鹼性磷酸酶檢測、倍性檢測，細胞發育多能性的鑑定。
囊胚期細胞的收集採集花鱸胚胎，顯微鏡下挑選胚胎發育正常的浮性卵，在常溫下培養至中囊胚期(約1000個細胞的胚胎)備用，每組胚胎數量為50-70枚，在1×PBS溶液中反覆浸洗，然後轉移到70％酒精中對胚胎進行快速消毒，並用滅菌的1×PBS(pH為7.4)溶液衝洗3次。在顯微鏡下用鑷子剝除卵膜，分離出胚胎細胞，用槍頭反覆輕輕吹打形成單個細胞，吸出溶液以800轉/分鐘離心5分鐘，去上清，加入培養基形成細胞懸液，同樣轉速離心，重複此步驟3次，徹底去除卵黃和油球，加入完全培養基重懸細胞，輕輕吹打形成細胞懸液待用。
胚胎幹細胞的原代培養和傳代培養對囊胚期細胞進行原代培養和早期傳代培養將囊胚期細胞懸液接種到24孔細胞培養板的1孔中，加入1ml完全培養基在細胞培養箱中進行原代培養，培養溫度為24℃。完全培養基配方為DMEM培養基為基礎培養基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.5)，100U/ml青黴素，100U/ml鏈黴素，2mmol/l穀氨酸、1mmol/l丙酮酸鈉，1mmol/l非必需胺基酸，5ng/ml重組人白血病限制因子，15％胎牛血清和1％花鱸血清，0.1％花鱸胚胎抽提物，8nM的亞硒酸鈉，5ng/ml的成纖維生長因子，27.5μM巰基乙醇。鏡檢觀察細胞長滿培養孔的95％時，按1∶2的比例進行細胞傳代，每2-3天更換1次培養基，1周傳代2-3次。獲得的8個囊胚細胞原代培養物，在傳代過程中，有6個出現分化，逐漸死亡，2個囊胚細胞原代培養物形成細胞系，保持較穩定的生長狀況，細胞呈現胚胎幹細胞形態細胞為圓形或多邊形，核大，細胞質稀薄，細胞大小為15-25μm。待細胞經過150天的培養傳代到40代時，即形成穩定的胚胎幹細胞系。
溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響研究發現，LJES1在4-32℃下都能存活，適宜生長溫度為20-28℃；在4℃下，細胞可存活40天，再轉到24℃下依然生長良好，能正常傳代；在32℃下，LJES1細胞可以生長、增殖，但生長速度開始下降，細胞最適宜溫度為24-28℃，28℃細胞生長速度達到最大(如表1所示)。適宜LJES1生長的最適pH值為7.2-7.4。
表1不同溫度對LJES1細胞生長的影響
穩定胚胎幹細胞的培養形成穩定的幹細胞系後，細胞保持較快的生長速度，基本上不再自發分化，得到第13、35和60代胚胎幹細胞倍增時間分別為19.76、20.67和21.31小時，在60小時細胞增殖速率達到最大。
胚胎幹細胞特徵鑑定主要是形態學鑑定、鹼性磷酸酶檢測、倍性檢測以及細胞發育多能性的鑑定。
形態學鑑定在100×或400×的相差顯微鏡下可觀察到花鱸胚胎幹細胞具有典型的幹細胞特徵，一般為多邊形或多角形，具有大的細胞核，一個或兩個核仁，細胞的直徑約為15-25um，在含有LIF抑制分化因子的條件培養基中成單層生長。花鱸胚胎幹細胞(LJES1)生長迅速，在極低密度下(103cells/ml)接種於培養瓶中，10-15天即可由一個細胞形成單克隆集落。
鹼性磷酸酶檢測花鱸胚胎幹細胞用1×PBS洗滌後，以1％的多聚甲醛固定10分鐘，再用1×PBS洗滌2次，以BCIP/NBT為底物在黑暗環境染色15-20分鐘。囊胚中期細胞為對照，花鱸胚胎幹細胞與囊胚中期細胞一樣，顯現強烈的紫紅色，為鹼性磷酸酶陽性。
倍性檢測花鱸胚胎幹細胞生長至對數期，在培養基中添加秋水仙素使終濃度為10μg/ml，4小時後收穫細胞，75mmol/L KCl溶液低滲處理30分鐘，3∶1甲醇、冰醋酸固定細胞3次，每次15分鐘，冷滴片，空氣乾燥，5％Giemsa染色20分鐘。顯微鏡下觀察染色體形態，計數染色體數目，做出核型。花鱸胚胎幹細胞的染色體數目48條佔60％以上，核型公式為2n＝48t，與花鱸體細胞染色體相同。
細胞發育多能性的檢測包括胚胎幹細胞的體外分化能力、花鱸胚胎幹細胞可形成擬胚體並發生分化、花鱸胚胎幹細胞的體內分化能力。
胚胎幹細胞的體外分化能力胚胎幹細胞在誘導劑視黃酸的作用下，可以在體外誘導分化為多種類型的細胞，如神經細胞、神經膠質細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等。細胞的誘導過程是胚胎幹細胞在完全培養基中培養2-3天，細胞經胰酶消化後，以高和低兩種細胞密度分別接種到12孔培養板，以含有不同濃度RA(0.1uM、0.2uM、0.5uM、luM)的ES細胞培養液(撤除了LIF因子)培養LJES1單層細胞，誘導3-4周，在誘導期間，為保持細胞處於合適的密度大小，要適時傳代。結果如表2和表3所示表2高密度下誘導分化結果
表3低密度下誘導分化結果
花鱸胚胎幹細胞可形成擬胚體並發生分化花鱸胚胎幹細胞經胰酶消化後，製成約20×104cells/ml密度的單細胞懸液，再將其接種於9cm培養皿上蓋的內表面上，接種培養基為誘導分化培養基1(在基礎培養基DMEM的基礎上添加5％的小牛血清和50mM 2-巰基乙醇)，製成許多懸浮細胞小滴。置培養箱中培養4-10天後，ES細胞形成擬胚體，可以看見一部分擬胚體中出現黑色素細胞。將擬胚體移至誘導分化培養基2(在基礎培養基DMEM的基礎上添加5％的小牛血清FBS、50mM2-巰基乙醇和0.5uM的視黃酸)中繼續培養，在顯微鏡下觀察其分化情況，結果為LJES1細胞在誘導分化培養基1中懸滴培養3天後，形成擬胚體結構，擬胚體不斷的向外生長，變大，大部分的擬胚體都出現典型的黑色素細胞。隨後，將擬胚體轉移到誘導分化培養基2中培養6-8小時後，擬胚體貼壁，並開始分化為樹狀肌肉細胞，最外層是成纖維細胞，有些擬胚體內部還能看到分化為幾個胚層的現象；在完全培養基(撤除LI F因子，添加RA)中，擬胚體分化為神經細胞，可以看見神經細胞向外輻射的細長的軸絲。
花鱸胚胎幹細胞的體內分化能力體內分化能力是證明胚胎幹細胞發育全能性的重要證據。採用脂質體介導法將pCMVEGFP質粒轉染花鱸胚胎幹細胞，使其表達綠色螢光蛋白並作為細胞供體。方法如下花鱸胚胎幹細胞用完全培養基以20×104/ml細胞接種到12孔細胞培養板中，使細胞長滿培養孔的60％-80％，24℃過夜培養。培養12-16小時後，進行脂質體轉染。將DNA和脂質體genejuice分別溶於不含血清和抗體的DMEM中，然後進行混合，形成DNA-脂質體混合物，將其逐滴加到培養基表面並均勻的分布在培養基中，6-8h後，添加1ml培養基繼續培養24-72小時後，在激發波長為488nm的螢光顯微鏡下觀察螢光的表達，表達效率為10％-20％。以此細胞作為供體，採用顯微注射方法進行細胞移植製備花鱸嵌合體胚胎。注射時，將發育至囊胚中期的花鱸胚胎小心吸入到特製的瓊脂凹槽內，使其在凹槽內呈單排直線排列，加入少量滅菌海水浸沒胚胎。用撥卵針小心將胚胎的動物極轉至上方，將注射針注射入囊胚內，每個囊胚注入20～50個供體細胞。將注射後發育形成的嵌合體於18℃無菌海水中培養，胚胎孵化後用新鮮過濾海水培養；注射後的胚胎和孵化出的魚苗進行螢光顯微觀察。在細胞移植24h後可觀察到綠色螢光蛋白在受體胚胎中的表達，共有7.7％的胚胎發育形成了表達綠色螢光蛋白的嵌合體，嵌合部位發生在胚胎的三個胚層內，有的分布在眼、聽囊等部位，有的在胚體中部，有的在卵黃囊，充分證明了花鱸胚胎幹細胞的體內分化能力和發育全能性。
因此，形態學和倍性檢測、生理生化檢測、細胞體外分化檢測及細胞移植實驗充分證明本發明建立的花鱸胚胎幹細胞系具有典型的胚胎幹細胞特徵。
權利要求
1.一種花鱸胚胎幹細胞，其特徵在於它的胚胎幹細胞小且呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15-25um，具有大的細胞核和較少的細胞質，具有高的鹼性磷酸酶活性，細胞增殖速度快，在24℃下，細胞倍增時間為20小時左右；在人工誘導條件下，可以分化成神經細胞、肌肉細胞和神經膠質細胞等不同類型細胞.
2.一種花鱸胚胎幹細胞培養方法，其特徵在於它的操作程序是花鱸胚胎囊胚期細胞的收集；胚胎幹細胞的培養和傳代包括對囊胚期細胞進行原代培養和早期傳代培養、溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響、穩定胚胎幹細胞的培養；對培養的花鱸胚胎幹細胞進行特徵鑑定包括形態學鑑定、鹼性磷酸酶檢測、倍性檢測、細胞發育多能性的鑑定，花鱸胚胎囊胚期細胞的收集採集花鱸胚胎，鏡檢合格後在常溫下培養至囊胚中期時使用，每個胚胎含有大約1000個細胞，胚胎幹細胞的培養和傳代對囊胚期細胞進行原代培養和早期傳代培養將收集的囊胚期細胞接種到24孔細胞培養板中單層培養，加入完全培養基1.0ml，24℃培養，待培養2-3天後，更換培養基，細胞長滿培養孔，按1∶2的比例進行細胞傳代，每2-3天更換1次培養基，1周傳代2-3次。完全培養基的配方為DMEM培養基為基本培養基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/lHepes(pH7.5)、100U/ml青黴素、100U/ml鏈黴素、2mmol/l穀氨酸、1mmol/l丙酮酸鈉、1mmol/l非必需胺基酸、5ng/ml重組人白血病抑制因子、15％胎牛血清、1％花鱸魚血清、0.1％胚胎抽提物、8nM的亞硒酸鈉、5ng/ml的成纖維生長因子、27.5μM巰基乙醇，溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響研究發現，LJES1在4-32℃下都能存活；在4℃下，細胞可存活40天，再轉到24℃下依然生長良好，能正常傳代；在32℃下，LJES1細胞可以生長、增殖，但生長速度開始下降，細胞最適宜溫度為24-28℃，28℃細胞生長速度達到最大。適宜LJES1生長的最適pH值為7.2-7.4，穩定胚胎幹細胞的培養形成穩定的胚胎幹細胞系後，細胞保持較快的生長速度，基本上不再自發分化，得到第13、35和60代胚胎幹細胞倍增時間分別為19.76、20.67和21.31小時，在60小時細胞增殖速率達到最大，胚胎幹細胞特徵鑑定形態學鑑定在100×和400×的相差顯微鏡下觀察細胞的外形和細胞大小，比較本細胞與典型的胚胎幹細胞的異同，其細胞具有典型的胚胎幹細胞特徵多邊形或多角形，具有大的細胞核，一個或兩個核仁，細胞直徑約為15-25um，鹼性磷酸酶檢測細胞經1％多聚甲醛固定，BCIP/NBT作為反應底物，在黑暗環境下對細胞進行染色，囊胚中期細胞為對照，相差顯微鏡觀察，花鱸胚胎幹細胞與囊胚中期細胞一樣，被染色顯現強烈的紫紅色，為鹼性磷酸酶陽性，倍性檢測對胚胎幹細胞進行常規的染色體製備，顯微鏡下觀察染色體形態，統計二倍體細胞的比率，即染色體數目為48條的細胞所佔比率為60％以上，細胞發育多能性的鑑定通過花鱸胚胎幹細胞的體外分化能力驗證。體外誘導分化主要是在培養基中添加視黃酸(RA)及控制培養條件，可以誘導細胞分化成多種不同類型的細胞，如神經樣細胞、肌肉樣細胞、纖維樣細胞及擬胚體等；體內誘導分化主要是通過細胞移植構建嵌合體進行多能性鑑定。
全文摘要
一種花鱸胚胎幹細胞及培養方法，它的細胞小且呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15－25um，具有大的細胞核和較少的細胞質，細胞增殖速度快，具有發育多能性和分化潛力；其操作程序是花鱸囊胚期細胞收集；胚胎幹細胞的原代和傳代培養、溫度對花鱸胚胎幹細胞生長的影響、穩定期胚胎幹細胞培養；花鱸胚胎幹細胞特徵鑑定，包括形態學、鹼性磷酸酶、倍性，發育多能性的鑑定和檢測。胚胎幹細胞採用完全培養基培養，每周傳代2－3次。細胞採用無滋養層技術，於0.1％明膠處理的培養板上單層培養，培養溫度為24℃。以此方法培養的花鱸胚胎幹細胞具有典型的胚胎幹細胞特徵。本發明技術操作簡單，細胞增殖快速，可用於其他魚類胚胎幹細胞培養。
文檔編號C12Q1/02GK1737130SQ20051004403
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者陳松林, 沙珍霞, 葉寒青 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所