用於藉助膜過濾進行液體的微生物研究的陪替氏培養皿和方法與流程
2023-05-24 03:39:01
細菌、黴菌和酵母可能不利地損害液體，例如飲料、水或化妝品的品質和可貯藏性。這種類型的微生物可在加工過程中存在於原材料中、空氣中或表面上。因此通常在生產過程中就嘗試，一方面防止汙染，另一方面通過在關鍵點的定期取樣和測試發現可能的汙染物。系統地進行的取樣和分析程序能使製造商在源頭處發現和清除汙染物以免其發展成更大的問題。為了待過濾的液體的微生物分析，通常使用過濾器，使待研究的液體流經該過濾器。在過濾後，取出該過濾器並放入例如瓊脂皿中，該過濾器在其上在培養箱中在升高的溫度下儲存幾天。可能從液體中過濾出的微生物通過瓊脂獲得刺激生長的營養素，以使該微生物能夠繁殖並可測定或計數。這種已知方法的主要難點是通常極其敏感的過濾器的操作。它們通常用鑷子夾住並放置在陪替氏培養皿的培養基上。過濾器和陪替氏培養皿的培養基在該操作過程中絕不能受到破壞或變形。恰好是對必須並行研究大量樣品的實驗室而言，另一問題是各個陪替氏培養皿的空間要求。通常使用直徑明顯大於要研究的過濾器的陪替氏培養皿。這是必須的，因為否則無法將過濾器放置在位置遠低於皿邊緣的培養基上。例如，直徑60毫米或更大的陪替氏培養皿用於直徑47毫米的過濾器。大的陪替氏培養皿的使用意味著陪替氏培養皿和位於其中的培養基的更大材料消耗，以及特別是在該皿的培養過程中在研究實驗室中的更大空間要求。本發明的目的因此是在將過濾器放置在陪替氏培養皿上的過程中簡化過濾器的操作並且還提供儘可能節省空間的皿。已經發現，數十年來已為人所知並使用許多、有時複雜的裝置進行的該方法可以通過使用幾乎完全裝滿培養基或優選一直裝到邊緣的陪替氏培養皿而明顯簡化。由此可以將過濾器放置並定位在培養基上而不受陪替氏培養皿邊緣的阻礙。操作更快速，並且對過濾器或培養基的破壞更少。此外，可由此節省空間和培養基，因為可以將陪替氏培養皿的直徑減小到幾乎該過濾器的直徑。本發明因此涉及陪替氏培養皿，其包括皿和蓋，該皿裝載培養基至少到該皿的邊緣下方1毫米，但最多到該皿的邊緣，該蓋封閉該皿。在一個優選實施方案中，所述皿完全裝滿培養基，即直到邊緣。在另一優選實施方案中，所述培養基是瓊脂培養基。在另一實施方案中，所述皿和蓋是圓形的。在一個優選實施方案中，所述蓋的內徑至少略大於所述皿的外徑，以使所述蓋可倒置在所述皿上以封閉該皿。在另一優選實施方案中，所述蓋底部不置於所述皿的邊緣上。為此，引起所述蓋底部不直接置於所述皿的邊緣上的一個或多個裝置優選位於所述皿的壁上或所述蓋上。在一個實施方案中，通過將至少3個突起（所述蓋置於其上）施加到所述皿的邊緣上，防止所述蓋底部置於該皿的邊緣上。在另一實施方案中，在所述皿的壁上（在內側或優選在外側）安裝例如隆起（Wulst）形式或密封裝置形式的支架，所述蓋的邊緣置於其上。本發明還涉及檢測液體或氣體中的微生物的方法，其特徵在於下列方法步驟a)通過過濾器過濾所述液體或氣體b)將所述過濾器施加到本發明的陪替氏培養皿的培養基上c)用蓋密封所述陪替氏培養皿d)培養來自步驟c)的陪替氏培養皿e)評估微生物生長。在一個優選實施方案中，過濾液體。在一個優選實施方案中，過濾器和陪替氏培養皿是圓形的。在一個優選實施方案中，所述陪替氏培養皿的內徑比所述過濾器的直徑大2至10毫米。所述過濾器優選具有0.2至0.45微米的排阻限。所述過濾器優選主要由乙酸纖維素和/或硝酸纖維素構成。本發明還涉及本發明的陪替氏培養皿用於檢測過濾器上的微生物的用途。為此，將所述過濾器置於所述陪替氏培養皿的培養基上，培養並隨後評估微生物。圖1顯示本發明的陪替氏培養皿的皿的兩個可能的實施方案。在各種情況下都沒有顯示蓋。根據本發明，陪替氏培養皿是用於容納營養培養基的容器，其中營養培養基被理解為例如營養溶液或固體培養基（Nährboden），其特別用於培養微生物、細胞培養物、細菌等。該容器包括皿和密封該皿的蓋。在此應該指出，蓋可以圍繞皿或嵌入皿中。因此，該皿和蓋通常被理解為互相接合以形成或多或少封閉的空間的部件。為簡單起見，下面稱為皿和蓋。該皿和蓋各自包括優選為圓形面形式的底部（皿底部和蓋底部）和從底部突出的優選為圓環形的壁（皿壁和蓋壁）。在此，壁的上緣被稱作邊緣。壁之一，優選蓋壁的內徑至少略大於另一個壁，優選皿壁的外徑，以使得可以將一個壁倒置於另一個上（或反之亦然）以封閉該皿。陪替氏培養皿因此通常是具有優選搭接的蓋的平坦、圓形、通常透明的玻璃皿或塑料皿。這樣的皿通常用於生物學或化學。它們用於培養微生物（也稱作微生物），並且用於存放細胞培養物。關於通用的容器，可以僅舉例參考DE4406725A1，從中獲知在陪替氏培養皿意義上的容器。蓋用於密封容器。通常將蓋倒置於皿或皿壁上。培養基在本發明的意義上是固體的營養培養基或固體培養基，在其上非特異性的各種微生物或特異性的某些微生物可生長。培養基的基本組成通常由主要組分水、可用於各自的微生物的能源，例如有機化合物以及該微生物需要的營養素（有機或無機碳源、氮源、硫源和磷酸鹽源和其它必需營養素）構成。用於異養生物的營養培養基中的營養素通常是碳水化合物（「糖」）、蛋白水解物（腖）和任選的脂肪酸。此外，無機鹽為微生物提供生存必需的離子，例如銨、鉀、鈉、磷酸根、硫酸根和痕量元素。此外，還可含有：-染料或其前體（顯微術染料、顯色底物）-膠凝劑（固化劑），如瓊脂或明膠，-抑制劑（例如抗生素）和用於防止不希望的微生物生長的選擇性試劑（例如用於酵母/黴菌固體培養基的氯黴素）-用於指示變化，例如pH值變化以及用於指示某些代謝產物或代謝活動的指示劑-用於穩定pH值的緩衝物質-生長因子，如激素、維生素等。根據本發明優選的是基於瓊脂的培養基，即包含瓊脂的培養基。用於檢測微生物的培養基是本領域技術人員已知的。合適的培養基的實例可見於例如MicrobiologyManual2000,MerckKGaA,德國。下表示例性提及一些培養基和要用它們檢測的微生物。培養基微生物m-Green酵母和黴菌mTGE全部(總計數)溴棕三甲銨-萘啶酮酸綠膿桿菌SlanetzBartley腸球菌Chromocult®大腸菌大腸桿菌/大腸菌LactoseTTC大腸桿菌/大腸菌m-Endo大腸菌mFC大腸菌TSC產氣莢膜梭菌（Clostridiaperfringens）mCP產氣莢膜梭菌BCYE軍團菌屬GVPC軍團菌屬BAT脂環酸芽孢桿菌過濾器在本發明的意義上是適用於收集微生物，如黴菌、酵母或細菌的所有過濾器。這些可以是紙過濾器或例如由塑料製成的膜過濾器。例如，由PVDF製成的過濾器是合適的。特別優選的是基於纖維素混合酯的過濾器。這些是包含至少乙酸纖維素和/或硝酸纖維素的過濾器。過濾器的孔逕取決於要分離的微生物的尺寸。典型排阻尺寸是0.2至0.45微米。這意味著該過濾器具有0.2至0.45微米的孔徑。通常使用具有30至80毫米，優選40至50毫米的直徑的過濾器。適合用於本發明的方法的示例性過濾器是來自MerckMillipore,德國的EZ-PAK®膜。這是具有0.45微米孔徑的基於纖維素酯的膜過濾器。已經發現，裝載培養基至少到皿的邊緣下方1毫米，但最多到皿的邊緣的本發明陪替氏培養皿顯著簡化過濾器的分析。一方面，在該皿的培養基上放置敏感的過濾器明顯更容易。另一方面，該皿的直徑可以與過濾器的直徑匹配。恰好在必須並行研究大量樣品的實驗室中，各個陪替氏培養皿的空間要求應該儘可能小。本發明現在提供相對於過濾器的直徑而言使用更小陪替氏培養皿的可能性，因為將過濾器放置在裝載到邊緣的陪替氏培養皿上明顯比將過濾器往下放置在皿的深處更簡單。該皿通常裝載培養基至少到皿的邊緣下方1毫米，但最多到皿的邊緣。該皿優選裝載培養基剛好到邊緣，即完全裝滿。培養基裝載的高度由陪替氏培養皿的壁高得出。壁高在此是指陪替氏培養皿內側的壁高。這與皿的外側壁高相差陪替氏培養皿的底厚度。陪替氏培養皿的內側壁高應該為至少3毫米，以形成至少3毫米的培養基高度。培養基的高度優選為3至7毫米。因此對陪替氏培養皿得出3至8毫米的優選壁高。通過陪替氏培養皿的壁高的選擇，能夠影響培養基的消耗。該培養基優選是瓊脂培養基。在一個優選實施方案中，該皿和蓋是圓形的並且蓋的內徑至少略大於皿的外徑，以使蓋可倒置在皿上以封閉該皿。為了實現通常需要的供氧培養並且為了防止過濾器和蓋之間的接觸，優選提供皿和蓋以使蓋底部不直接置於皿的邊緣上。這可以以各種方式實現。例如，該皿的邊緣可具有至少3個突起，蓋置於它們上。蓋因此以穩定方式擱置，但由於這些突起，與皿的實際邊緣具有間距。這種類型的一個實施方案圖示在圖1A中。該圖顯示圓皿，在其邊緣上部有四個突起。為了更好地理解，四個突起之一在該圖中用數字「1」標示。如果現在將蓋置於這一皿上，這些突起產生蓋底部和皿邊緣之間的間距。在另一實施方案中，皿壁可具有使蓋邊緣置於其上的裝置，如內側或外側的隆起或一個或多個支架。如果蓋壁的高度現在該隆起或支架上方高於皿壁的高度，蓋底部就不置於皿的邊緣上。在一個實施方案中，該隆起設計成外側的圓形凹槽，蓋嵌入其中。這種類型的一個實施方案圖示在圖1B中。該圖顯示穿過由壁(2)和底部(3)構成的皿的橫截面。環形圍繞整個壁的隆起(4)位於壁(2)的外側。蓋能夠嵌入由此形成的凹處或凹槽(5)中。如果現在選擇相應高的蓋壁，蓋底部就不置於皿的邊緣上。在另一實施方案中，外側支架不僅實現蓋底部和皿邊緣之間的間距，還另外引起蓋的鎖定。為此，可以將該支架設計成例如向外突起的定位橫檔（Rastnase）、法蘭、螺紋狀部分、不同嵌接件的組合等。這種類型的可密封陪替氏培養皿是例如WO2008/141597中已知的。本發明還涉及檢測液體或氣體中的微生物的方法，其特徵在於下列方法步驟a)通過過濾器過濾所述液體或氣體b)將所述過濾器施加到本發明的陪替氏培養皿的培養基上c)用蓋密封所述陪替氏培養皿d)培養來自步驟c)的密封陪替氏培養皿e)評估微生物生長。通過過濾和隨後在陪替氏培養皿中培養過濾器研究液體或氣體樣品的一般方法是本領域技術人員已知的。液體在此特別是水、飲料、液體食品或液體化妝製品。最常研究的氣體是空氣，例如在藥品或飲料和/或食品生產中。該方法通常如下進行。1.過濾器和陪替氏培養皿的提供根據本發明，提供裝載培養基至少到邊緣下方1毫米，最多到邊緣的陪替氏培養皿。在一個優選實施方案中，過濾器和陪替氏培養皿是圓形的。在一個優選實施方案中，陪替氏培養皿內部的直徑比過濾器的直徑大2至10毫米，優選1至8毫米。由此可以使用具有儘可能小直徑的陪替氏培養皿。對於具有47毫米直徑的過濾器，例如具有55毫米直徑的陪替氏培養皿因此是合適的。上文已經公開了陪替氏培養皿和過濾器的其它必需和優選的性質。2.將過濾器引入漏鬥或用於過濾液體或氣體的另一裝置中。這種類型的裝置是本領域技術人員已知的。用於過濾液體的裝置的實例可見於WO2008113443和其中引用的文獻。通常，使50至500毫升，優選100至250毫升液體經過過濾器。此時，微生物保持附著在過濾器上。3.從過濾裝置中移除過濾器任選地，可以在從過濾裝置中取出前衝洗該過濾器，以排除在隨後檢測微生物的過程中原始液體的可能的幹擾影響。4.將過濾器引入陪替氏培養皿中通常使用無菌鑷子將該過濾器放置在敞開的陪替氏培養皿的培養基上。然後用蓋密封該皿。5.培養密封的陪替氏培養皿為此，通常將陪替氏培養皿放置在培養器中。對於不同的微生物類型，培養時間和培養溫度不同。培養時間通常為12至48小時。溫度通常為大約36℃。對於在顯色大腸菌瓊脂上的大腸桿菌/大腸菌，培養時間為例如在大約36℃下優選18至24小時。本領域技術人員能夠將溫度和培養時間與各種待檢測的微生物匹配。6.評估微生物生長在完成培養後，可以從培養器中移除該板並評估。這可以目視或使用合適的儀器進行。評估方法是本領域技術人員已知的。可以通過對形成的微生物集落計數和/或通過評估其它特徵進行微生物生長的評估。通常進行在瓊脂上形成的集落的計數。如果在瓊脂上發現例如20個集落，推測已從樣品中濾出20個微生物。根據所用的樣品體積，可以由此計算每單位體積的微生物數。其它特徵的評估包括檢測變色，其例如歸因於pH值變化或顯色底物的代謝。但是，其它特徵的評估也可能意味著分離一種或多種微生物並藉助其它試驗，例如PCR或抗體基試驗對其鑑別。本發明因此提供藉助過濾測定液體或氣體中的微生物的顯著改進。通過簡單增加陪替氏培養皿中的培養基裝載高度就顯著地簡化操作。此外，可以降低相對於過濾器而言陪替氏培養皿的尺寸。上文連同附圖解釋的實施例僅用於所要求保護的教導的舉例說明，而非將其限制於這些實施例。即使沒有進一步詳述，也推測本領域技術人員能夠在最廣泛的範圍內利用上述說明。上下文中引用的所有申請、專利和出版物，特別是2014年8月14日提交的相應申請EP14002840.8的整個公開內容，經此引用併入本申請。當前第1頁1 2 3