用於巨噬細胞相關疾病靶向給藥的藥物載體及其製備方法
2023-05-23 09:43:16
專利名稱：用於巨噬細胞相關疾病靶向給藥的藥物載體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及重組輪狀病毒Vp6基因的表達及體外組裝，尤其涉及利用該組裝產 物用於淋巴細胞相關疾病的靶向供藥(靶向治療性供藥、靶向造影和巨噬細胞標記等)。
背景技術：
病毒樣顆粒(virus like particles, VLP)是一類無複製能力、由病毒蛋白自組裝成 的沒有基因組的蛋白質。在一定的條件下，蛋白亞基可在體外環境中自組裝成籠型結構 或其它形狀的病毒樣納米顆粒；它們有規則的結構形態，在納米範圍內不同的病毒具有 不同的尺寸(20nm-200nm);結構有序，單分散性好；許多病毒的三維結構已經在原子水 平被解析；能大量的生產，得到克級甚至是公斤級的病毒粒子；有很大的表面積，內表 面、外表面及亞基與亞基分界面，都可以用化學修飾的方法對這些位點進行修飾，特異 地連接上其它物質，應用於醫學或材料科學；重複有序的表面結構修飾上識別配體後， 能在總體上協同增強與細胞受體的親和力；通過基因重組的方法，可以按照人們的意圖 改造外表面或內部結構，使其具有靶向性或能包裹特定的藥物，這樣可避免藥物聚集和 被體內環境降解、增加藥物生物相容性、減少藥物毒性、增加體內停留時間。所以較之 於合成的納米粒子，在載體應用方面具有許多優點。輪狀病毒(rotavirus RV)是一類消化道感染病毒，主要感染小腸上皮戎毛膜細 胞，然後感染遊動的淋巴細胞，並由淋巴細胞經過淋巴循環而把病毒帶到身體各個部 位。RV主要的結構蛋白Vp6在天然狀態下以三聚體形式存在，其晶體結構已被解析。 在PH4的環境中，真核表達的Vp6可以自組裝成70nm左右的病毒樣顆粒。但是，真核 表達的蛋白量較少，表達成本較高，大大限制其在商業中的利用。 巨噬細胞活化綜合症是由T細胞和巨噬細胞的過度活化及增殖引起的，以發 熱，肝脾、淋巴結腫大，全血細胞減少，輕至重度肝功能損害，神經系統受累等為特徵 的症候群，又被認為是繼發性或反應性噬血細胞性淋巴組織細胞增多(hemophagocytic lymohohistiocymsis， HLH)。 MAS是慢性風溼類疾病，尤其是全身性幼年型特發性關節 炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis, SOJIA)患者中的嚴重的、潛在危及生命的並 發症。 在腫瘤細胞的誘導下，起源於骨髓的白細胞可分化形成具有獨特表型的巨噬 細胞，這些巨噬細胞可促進腫瘤細胞的增殖、抑制T細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)的抗腫瘤活性、支持腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及新生血管形成。這些細胞 被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)。 在某些情況下，TAM可 構成實體瘤細胞群體的50% 80%，這種TAM的廣泛浸潤與乳腺癌、宮頸癌及膀胱癌的 不良預後相關。 對於MAS和TAM，目前尚無特異的靶向藥物，迫切需要一種安全有效的靶向載 體進行巨噬細胞的特異性治療。
發明內容
鑑於上述現有技術的不足和實際藥物研製應用中的迫切需求，本發明的目的在 於提供一種用於巨噬細胞相關疾病靶向供藥的藥物載體及其製法，利用輪狀病毒外殼蛋 白體外自組裝和巨噬細胞特異性靶向的特性，經化學修飾，可把治療性藥物或示蹤性藥 物定向到巨噬細胞。
本發明的第一個目的，其實現的技術方案是 用於巨噬細胞相關疾病靶向供藥的藥物載體，其特徵在於該藥物載體為對巨 噬細胞有特異識別能力的輪狀病毒外殼蛋白Vp6經原核表達、自組裝而成的病毒樣顆 粒。 進一步地，前述用於巨噬細胞相關疾病靶向供藥的藥物載體，其中該病毒樣顆 粒為中空結構，且其內表面或外表面化學修飾有藥物分子，所述藥物分子包括治療性藥 物或示蹤性藥物或兩者混合。
本發明的第二個目的，該藥物載體製法的技術方案是 用於巨噬細胞相關疾病靶向供藥的藥物載體的製備方法，其特徵在於首先提 取A組輪狀病毒的結構蛋白Vp6基因；然後將這些結構蛋白Vp6基因克隆到原核表達載 體；再在大腸桿菌BL21中進行表達；最後把表達的蛋白與藥物進行交聯、組裝成病毒 樣顆粒。 進一步地，前述用於巨噬細胞相關疾病靶向供藥的藥物載體的製備方法，其中 該結構蛋白Vp6的來源包括猴的輪狀病毒Vp6基因、豬的輪狀病毒Vp6基因和人的輪狀 病毒Vp6基因，在實際生產應用中，可以選用這些Vp6基因的其中的一種，也可以選用 多種混合使用。 更進一步地，前述用於巨噬細胞相關疾病靶向供藥的藥物載體的製備方法，其 中該病毒樣顆粒與治療性藥物或示蹤性藥物的組裝為體外組裝。 本發明的有益效果體現在利用病毒樣顆粒對巨噬細胞的特異性識別能力，把 藥物輸送到巨噬細胞中實現靶向供藥和緩釋的功能，能有效降低藥物的用量和毒性，避 免體內環境對藥物的降解，提高治療效果；同時，利用原核表達的方法及輪狀病毒蛋白 Vp6體外組裝的特性，能夠實現大批量生產，並降低製造成本。
圖1是輪狀病毒Vp6蛋白純化和表達的示意圖； 圖2是輪狀病毒Vp6蛋白復性的示意圖； 圖3a是輪狀病毒Vp6標記阿黴素後的照片示意圖； 圖3b是對標記後的輪狀病毒Vp6通過考馬斯亮藍染色的照片示意圖； 圖4是對標記後的輪狀病毒Vp6採用表面增強拉曼光譜檢測示意圖； 圖5a是本發明病毒樣顆粒的電鏡照片示意圖； 圖5b是本發明病毒樣顆粒的原子力顯微鏡照片示意圖； 圖6A是本發明病毒樣顆粒與巨噬細胞孵育後的螢光顯微鏡示意圖； 圖6B是圖6A的陰性對照示意圖； 圖7A是本發明病毒樣顆粒與A549細胞孵育後的螢光顯微鏡示意 圖7B是圖7A的陰性對照示意圖。
具體實施例方式
本發明所用的Vp6基因均為A組輪狀病毒，分別是來源於猴的輪狀病毒Vp6基 因；人的Vp6基因和豬的Vp6基因。這些基因及編碼的蛋白分別見序列1、 2、 3，各是 由1356個核苷酸組成，編碼397個胺基酸，開放閱讀框為24-1217位核苷酸。把這些基 因克隆到原核表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，得到分子量在45KD左右的 蛋白質，再把表達的蛋白與藥物進行交聯，進行體外組裝，得到巨噬細胞的靶向藥物載 體。 本發明用於巨噬細胞相關疾病靶向給藥的藥物載體的詳細製法為
—、質粒的構建 培養的病毒經由RT-PCR，獲得Vp6的編碼基因。操作是
在正向引物(Ps: 5' ATCATATGGATGTT TTGTATTCA-3')禾P3'端反向引物 (PAs: 5' -ATCCGCGGAGCTCCACCGCGGTGGC-3')中分別引入限制性核苷酸內切酶 位點Ndel和Sacl(下劃線)。VP6編碼基因擴增反應體系為100微升，其中模板DNA(攜 帶RV VP6基因的質粒pTB-VP6)1微升；10XPCR緩衝液10微升；dNTPs(25mmol/L)2.5 微升；引物Ps(20pmo1/微升)和Pas(20pmo1/微升)各2微升；Taq酶(3U/微升)1.5微升， 滅菌超純水81微升。PCR反應條件為94。C預變性3分鐘；94。C變性30秒，56。C退火 30秒，72t:延伸反應40秒，共30個循環；最後72t:延伸IO分鐘。VP6基因的PCR產 物經純化後，用Nde I/Sac I雙酶切，製備插入基因片段。表達質粒pET同樣經Nde I/Sac I雙酶切，製備載體基因片段。插入基因片段和載體基因片段經T4DNA連接酶連接後， 轉化DH5a感受態細胞。經酶切鑑定，篩選陽性菌落，製備攜帶VP6編碼基因的重組表 達質粒pET-VP6，並對重組表達質粒進行核苷酸序列測定。
二、蛋白的表達 經核苷酸序列測定證明準確無誤後，將該重組質粒pET-VP6轉化BL21(DE3)感 受態細胞，轉化細胞塗於含Amp+LB培養基平皿中，37t:過夜培養。挑選陽性菌落接種 於含3ml(含氨苄青黴素)LB培養液試管中培養6h後，取50微升培養液，轉於250ml LB 培養液中(含氨苄青黴素200微克/毫升)，於37t:(12 16小時)培養表達。4,000rpm/ min離心收集菌體，加超聲裂解緩衝液(200mmol/LNaCl， 50mmoL/L Tris， 5%甘油，5% Triton X-IOO， 2mmol/LEDTA， lmmol/L DTr)懸浮，於冰水浴中超聲破碎菌體。裂解液 經12,000rpm/min， 4°C， 30min離心，棄上清，沉澱(主要是包涵體蛋白)用8mol/L尿素 溶解後，分裝保存於-20%冰箱。
三、重組表達VP6的SDS PAGE檢測 取樣品20微升，加5微升5倍樣品變性緩衝液，10(TC煮沸5分鐘，進行 SDSPAGE凝膠電泳(5X濃縮膠，12%分離膠)，電壓60V。當溴酚藍跑至凝膠底部時， 停止電泳。凝膠用考馬斯亮藍R250染色，脫色液[10% (V/V)醋酸，5X(V/V)乙醇]脫色。 四、VP6蛋白的純化與復性 VP6蛋白的純化溶解在8moL/L尿素中的包涵體蛋白經SDS-PAGE凝膠(5X
5的濃縮膠，10%的分離膠)分離，用150mmol/L KC1顯色，切膠收集VP6所在位置的膠 條，膠條中的VP6蛋白經15X的SDS-PAGE凝膠柱回收至溶液中，在收集的含VP6蛋 白的溶液中加入20mmol/L的KCI除去SDS，用12%的PAGE檢測純化效果。VP6純化 蛋白的復性實驗將經純化的VP6蛋白溶液稀釋(蛋白濃度40.5mg/ml)，並向其中加入 尿素至濃度為8mol/L，同時加入含100mmol/LTris-Cl(pH8.5)， 10mmol/L GSH， lmmol/L GSSG， 2mmol/LEDTA， 50mmol/LDTT，在室溫放置2 3h。將上述蛋白液裝入透析袋 內，並置透析袋於裝有復性液的燒杯中，4t:磁力攪拌透析。各復性液除尿素濃度分別為 6、 4、 2、 lmol/L不同外，其餘各組成成分相同(100mmol/L NaCl、 50mmoL/L Tris-HCl、 lmmol/LGSSG、 lmmol/LGSH。 pH8.5)，每次透析8h，然後用10mmol/LPBS(含lmmo1/ L GSSG， lmmol/L GSH)pH7.4透析8h，之後更換大體積10mmol/L PBS(pH7.4)透析12h。 復性結束後將透析袋放入蔗糖中濃縮，濃縮後的樣品離心去除沉澱，復性蛋白用非變性 及非還原凝膠電泳檢測。 表達和純化的蛋白如圖l所示，從左往右的方向，第一泳道為蛋白分子量標 準(KD)，從上到下分別是97.4、 66.2、 43、 31、 20.1;第二和第四泳道都為在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達的Vp6，可見在43KD附件出現表達的條帶。第三泳道為純化的蛋白； 第五泳道為未加表達質粒的大腸桿菌的對照。 復性的蛋白如圖2所示，左邊的為純化的蛋白，右邊的復性的蛋白，蛋白在復
性後遷移率降低。五、Western blot檢測 蛋白經SDS-PAGE電泳分離後，電轉移至(轉移條件為恆流160mA， 1.5h)硝 酸纖維膜上；硝酸纖維膜在4。C封閉液[5% (w/V)脫脂奶粉/TBST(20mmol/L Tris-HCl， 150mmol/LNaCl， 0.05% Tween-20)]中封閉過夜；經與一抗豚鼠抗SA11抗血清(1 : 200 稀釋)和二抗(山羊抗豚鼠IgG)l : 1,000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗豚鼠IgG反 應；最後用底物DAB(二氨基聯苯胺四羥基鹽酸)顯色。 六、阿黴素通過EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽反應交聯 到蛋白Vp6上 復性後的Vp6按摩爾比為Vp6 : NHS(碳二亞胺)EDC :阿黴素=
l:5:2: i的比例，4。c反應48小時，反應後的樣品裝入透析膜(截留分子量
8000-14000)中進行透析，透析液為pH7.4的磷酸鹽緩衝液，4。C透析48小時，其間每隔
12小時換液一次。 1)、阿黴素標記的檢測 如圖3a和圖3b所示，用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳和表面拉曼增強光譜對標記的 蛋白進行檢測。圖3a所示的Vp6標記上阿黴素後，由於阿黴素本身帶有紅色，電泳後可 見Vp6的紅色條帶(圖3左)，圖3b所示的為同一塊膠經考馬斯亮藍染色後，可見標記了 阿黴素的Vp6電泳比Vp6本身的蛋白電泳速度要稍慢，因為交聯後蛋白分子量變大，且 所帶負電荷減少。 本申請發明人還利用表面增強拉曼光譜對標記後的Vp6進行了檢測。由於Vp6 本身沒有拉曼信號，而阿黴素在經納米銀顆粒(20-100納米)增強後有比較強的拉曼信 號。如圖4所示，峰的歸屬為383 : S (C = 0) ; 453 : S (C = 0) ; 1230 : S (0-H);1266 : S (0-H) ; 1330 : ring stretch ; 1401 : ring stretch。
2)、阿黴素標記後蛋白的組裝 透析後的帶有阿黴素分子的Vp6蛋白在PBS磷酸鹽緩衝液(pH3-PH7)中進行組 裝4t:-3(TC， 2-20小時，組裝完後在水中充分透析。
3)、組裝後的表徵 如圖5a和圖5b所示，分別用電鏡和原子力顯微鏡對組裝的病毒樣顆粒進行形貌 表徵，觀察到30-80納米的病毒樣顆粒。 上述方法所製備的藥物載體，通過免疫螢光實驗檢測Vp6-Dox病毒樣顆粒在巨 噬細胞RAW和肺上皮細胞A549中的分布。
第一步、細胞的培養和預處理 Raw和A549在六孔板中生長成接近單層時，用PBS洗細胞3次，每次每孔2毫 升，用維持液(不加小牛血清的1640培養基)洗一次，每孔加入2毫升維持液，然後加入 IOO微升的Vp6-Dox病毒樣顆粒，孵育3小時後，用25t:的PBS洗細胞，每次每孔2毫 升。 第二步、細胞的固定和復水 預處理好後的細胞在-201:預冷的無水甲醇中固定20分鐘，依次在PBS配製的 70%， 30%， 10%預冷的乙醇中各復水10分鐘，PBS洗三次，每次每孔2毫升。
第三步、細胞膜的透化處理 復水後的細胞用PBS配製的0.2%的Triton X-100進行透化處理，25。C處理5分 鍾，用PBS洗三次，每次每孔2毫升。
第四步、免疫螢光檢測 透化處理的細胞每孔加1 : 100(PBS稀釋) 一抗(Vp6抗豚鼠血清，自製)200微 升，37t:孵育30分鐘，PBS-T(加0.2X的Tween-20)洗5次，每次每孔2毫升，25。C搖床 3分鐘，然後每孔加l : 400(PBS稀釋)的二抗(FITC標記的山羊抗豚鼠IgG， Santa Cruz Biotechnology)200微升，37。C避光孵育30分鐘，PBS-T(加0.2%的Tween-20)洗5次，每
次每孔2毫升，25t:搖床3分鐘，螢光顯微鏡下觀察。見圖6和7。
觀察的結果 圖6A: Vp6-Dox病毒樣顆粒和巨噬細胞孵育後，經一抗和FITC標記的二抗處
理，螢光顯微鏡下在細胞質中可見強烈的綠色螢光。圖6B為陰性對照，沒加Vp6-Dox
病毒樣顆粒的巨噬細胞，經和A—樣的處理後，螢光顯微鏡下沒見到螢光。 圖7A : Vp6-Dox病毒樣顆粒和A549細胞孵育後，經一坑和FITC標記的二抗處
理，螢光顯微鏡下在細胞中沒有螢光。圖7B為對照，沒加Vp6-Dox病毒樣顆粒的A549
細胞，經和A—樣的處理後，螢光顯微鏡下沒見到螢光。
結論 以上檢測及觀察結果可知用原核表達體系表達的Vp6蛋白，通過EDC(l-乙 基_3_(3_二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)反應在Vp6上交聯阿黴素，在酸性條件下自 組裝成病毒樣顆粒。實驗顯示Vp6-Dox病毒樣顆粒可進入巨噬細胞，不能進入A459細 胞，能對巨噬細胞特異性識別，這樣的病毒樣顆粒能成為優良的MAS和TAM相關疾病 的給藥載體
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通過以上介紹可見本發明的靶向供藥藥物載體及其製法具有突出的優點
1、利用輪狀病毒外殼蛋白自組裝的特性，用基因工程的方法體外對蛋白進行操 作，並用化學修飾的方法對其進行藥物交聯，把藥物修飾到中空的病毒樣顆粒的內表面 和外表面，並利用病毒對巨噬細胞特異識別的能力，把藥物輸送到巨噬細胞中，這樣可 降低藥物的毒性，降低藥物的用量，避免體內環境對藥物的降解，達到靶向和緩釋的功 能，降低用藥成本，提高治療效果。 2、現有的組裝往往是在昆蟲細胞中進行，這樣得到的病毒樣顆粒的量十分有 限，本發明用原核表達的方法，在大腸桿菌中高效表達了輪狀病毒蛋白Vp6，並在體外 自組裝成病毒樣顆粒，可獲得大量的蛋白，降低製造成本。 3、和其它的納米靶向給藥載體(脂質體、樹枝狀分子、嵌段共聚物、碳納米管) 等相比，病毒蛋白毒性較小，安全性較高，體內容易降解。 4、利用輪狀病毒外殼蛋白體外自組裝和巨噬細胞靶向的特性，經化學修飾，可 把治療性藥物或示蹤性藥物定向到巨噬細胞。
權利要求
用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體，其特徵在於所述藥物載體為對巨噬細胞有特異識別能力的輪狀病毒外殼蛋白Vp6經原核表達、自組裝而成的病毒樣顆粒。
2. 根據權利要求1所述的用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體，其特徵在於所 述病毒樣顆粒為中空結構，且其內表面或外表面化學修飾有藥物分子。
3. 根據權利要求2所述的用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體，其特徵在於所述病毒樣顆粒內表面或外表面通過化學修飾的藥物為治療性藥物或示蹤性藥物，或兩者 混合。
4. 權利要求1所述用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體的製備方法，其特徵在於首先提取A組輪狀病毒的結構蛋白Vp6基因；然後將這些結構蛋白Vp6基因克隆到原核 表達載體；再在大腸桿菌BL21中進行表達；最後把表達的蛋白與藥物分子進行交聯，並組裝成病毒樣顆粒。
5. 根據權利要求4所述的用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體的製備方法，其特徵 在於所述結構蛋白Vp6包括猴的輪狀病毒Vp6基因、豬的輪狀病毒Vp6基因和人的輪 狀病毒Vp6基因之一或多種混合。
6. 根據權利要求4所述的用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體的製備方法，其特徵 在於所述病毒樣顆粒與藥物的組裝為體外組裝。
全文摘要
本發明公開了一種用於巨噬細胞疾病靶向供藥的藥物載體及其製備方法，該藥物載體為對巨噬細胞有特異識別能力的輪狀病毒外殼蛋白Vp6經原核表達、自組裝而成的中空病毒樣顆粒，其內表面或外表面化學修飾有藥物分子。其製法首先提取A組輪狀病毒的結構蛋白Vp6基因；然後將這些結構蛋白Vp6基因克隆到原核表達載體；再在大腸桿菌BL21中進行表達；最後把表達的蛋白與藥物進行交聯，並組裝成病毒樣顆粒。本發明利用病毒樣顆粒對巨噬細胞的特異性識別能力，把藥物輸送到巨噬細胞中實現靶向供藥和緩釋的功能，能有效降低藥物的用量和毒性，避免體內環境對藥物的降解，提高治療效果；同時也能夠實現大批量生產，降低製造成本。
文檔編號A61K47/42GK101690822SQ200910183928
公開日2010年4月7日 申請日期2009年8月13日 優先權日2009年8月13日
發明者張智軍, 趙慶歡, 黃潔 申請人:蘇州納米技術與納米仿生研究所