糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒及其檢測方法與流程

2023-05-23 22:19:31 2

本發明屬於糖化血紅蛋白檢測
技術領域：
，具體涉及一種糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：根據idf統計，2015年全球糖尿病患者約有4.15億人，每11個人就有1人患有糖尿病。預測到2040年，全球將會有6.42億人患有糖尿病，中國糖尿病患者也將達到1.51億，糖尿病前期患者多達2.24億人。據國家衛計委和idf統計，2015年我國18歲及以上成人糖尿病患病率為10.7％，糖尿病前期患者高達16％，2015年全球18歲－80歲成年人的糖尿病患病率為9.1％。中國糖尿患者位居世界首位，趨於年輕化，具df統計，2015年我國有130萬人死於糖尿病及其併發症，其中40.8％的人年齡低於60歲，且逐年呈現年輕口基數大，人口老齡化加劇以及飲食結構等因素，導致我國糖尿病患者人數約1.5億人，位居世界第一，我國糖尿病消費群體量大，且呈現逐年患者增多的趨勢。糖化血紅蛋白(glycatedhemoglobin，或血紅蛋白a1c，或者glycosylatedhemoglobin)(下文中有時稱作「hba1c」)已被看做是篩選糖尿病、檢查可能成為前驅糖尿病人的人的血糖控制、或者監測病人的血糖控制、以及診斷糖尿病的有用工具。在血紅細胞的正常的120天壽命中，葡萄糖分子與血紅蛋白反應，形成糖化血紅蛋白。一旦血紅蛋白分子被糖化，其保持被糖化的狀態。因此，紅細胞內的糖化血紅蛋白的增多反映了在細胞的生命周期中細胞被暴露到的葡萄糖的平均水平。通過監測長期血清葡萄糖調節，測量糖化血紅蛋白可以評估糖尿病的治療效果。hba1c水平與前四周至三個月的平均血糖濃度成正比。據此，歐美國家已經將此作為糖尿病療效和調整治療方案的金標準。目前，前臨床實驗室中檢測糖化血紅蛋白的常見方法主要有兩大類：一類方法基於糖化血紅蛋白與非糖化血紅蛋白所帶的電荷不同，如離子層析法、電泳等方法；另一類方法基於血紅蛋白上糖化基團的結構特點，如親和層析、離子捕獲法和免疫法等。其中，基於硼酸親和層析法的糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測備受關注。經檢索發現，授權公告號為cn100593117c的發明專利公開了一種血紅蛋白檢測試劑盒，包括：能保留沉澱的血紅蛋白的多孔膜；第一試劑，包括鋅離子水溶液或者包括水可溶性鋅化合物；第二試劑，包括發色團－硼酸偶聯物；和任選包括水性洗滌試劑；儘管其技術方案解決了隨著試劑盒保藏時間的延長檢測結果呈現不穩定的問題，但是經臨床實踐證明其並未從本質上起到延長貨架期的作用。檢索還發現，申請公布號為cn102652264a的發明專利公開了一種用於測量糖化血紅蛋白的離心微流結構、用於測量糖化血紅蛋白的離心微流裝置和用於測量糖化血紅蛋白的方法，該技術方案將免疫吸附測定和親和色譜測量相結合，不僅檢測糖化血紅蛋白，還檢測糖化血紅蛋白變異體或幹擾物質，最終消除和/或補償或者校準糖化血紅蛋白測量中的差錯，從而使糖化血紅蛋白水平的檢測更準確。儘管該技術方案從一定程度上相對於現有技術更能準確的測定出糖化血紅蛋白的含量，但是其技術方案複雜，並且檢測時間較長，不利於便捷式家用檢測裝置的開發。申請人還檢索到，申請公布號為cn105301261a的發明專利公開了一種檢測糖化血紅蛋白的試劑盒及其製備方法和使用方法，其中，所述試劑盒包括反應液、洗滌液和反應板，但反應液和洗滌液保存條件嚴格限定為2－8℃，限制了自然條件下檢測的進行，不利於便民試劑盒的推廣。技術實現要素：針對現有技術的上述缺陷，本發明的目的是提供一種糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒及其檢測方法，特別是一種基於硼酸親和層析法的糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒及其檢測方法，以縮短檢測時間、降低採血用量、延長試劑盒貨架期、增加檢測準確性、提高檢測條件的溫和性。本發明的目的是通過如下技術方案實現的：第一方面，本發明提供一種糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒，包括r1試劑、r2試劑、r3試劑、r4試劑、糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜；所述r1試劑，其ph為弱鹼性，溶劑為濃度小於等於0.35wt％的氯化鈉水溶液，溶質及其在所述溶劑中含量為：表面活性劑0.12－0.18％w/v；所述r2試劑，其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：發色團－硼酸偶聯物0.001－0.003wt％，表面活性劑0.12－0.18％w/v；所述r3試劑，其ph為弱鹼性，具體為水性洗滌試劑；所述r4試劑液，其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：無機鋅鹽10－15mm，表面活性劑0.1－0.2％w/v。優選地，所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1。優選地，所述弱鹼性具體指ph為7.2－7.5。優選地，所述弱鹼性具體指ph為7.35－7.45。優選地，所述r1試劑，還包括：0.002％w/v的疊氮化鈉、0.05％w/v的甘油、0.005％w/v的脫脂奶粉、0.001％w/v的酪蛋白，0.01％w/v的bsa。優選地，所述r2試劑，還包括：2－8mm的六水氯化鎂、1－1.5％v/v的甲醯胺。優選地，所述r4試劑，還包括：10－15％v/v的乙醇、0.002－0.004％w/v的疊氮化鈉，0.1－0.3％w/w的氯化鈉。優選地，所述糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜選自玻璃纖維膜、硼酸鹽濾膜或纖維質膜。第二方面，本發明提供一種基於所述檢測試劑盒的糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測方法，包括如下步驟：取待檢測血樣與r1試劑，混合，得溶血後的血樣；將溶血後的血樣中加入r2試劑，混合，得糖化血紅蛋白檢測樣；將糖化血紅蛋白檢測樣置於糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上，放置一端時間後，再加入r4試劑液，再放置一段時間；用r3試劑清洗所述糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜；基於反射光度法對所述糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上的樣品位點進行檢測，即可分別獲得檢測血樣中糖化血紅蛋白、血紅蛋白含量。本發明試劑盒及檢測方法的機理在於：在r1試劑中，糖化血紅蛋白和血紅蛋白被釋放，然後糖化血紅蛋白與r2試劑中的硼酸結合，加入r4試劑後，靶標蛋白被沉積，r3試劑衝洗後，除沉積在糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上的靶標蛋白外，其他檢測樣品組分被洗去，通過上述操作，糖化血紅蛋白和血紅蛋白被沉積、檢測，準確性高。與現有技術相比，本發明具備如下有益效果：採用本發明的檢測試劑盒基於其組分種類及含量，可以縮短檢測時間、降低採血用量、延長試劑盒貨架期、增加檢測準確性、提高檢測條件的溫和性。另外，本發明的試劑盒是一種基糖化血紅蛋白和血紅蛋白檢測於一體的檢測試劑盒，不僅適用於糖尿病的預防、檢測，還適用於貧血的預防、檢測，相對於單一蛋白檢測的現有試劑盒來講更加便民實用、更加有利於市場推廣。再者，基於本發明的試劑盒組分及種類優選、檢測方法優化，在本發明糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上沉積的糖化血紅蛋白、血紅蛋白顆粒分布非常的均勻，顆粒大小適中，為2－5μm，這樣的沉積特點更加有利於檢測結果的準確性。附圖說明圖1為分別使用實施例中所述試劑盒和美國bio－rad公司生產的糖化血紅蛋白檢測試劑盒檢測相同樣本的檢測結果對比圖。具體實施例下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。實施例1實施例1提供了一種糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒，包括r1試劑、r2試劑、r3試劑、r4試劑、糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜；其中，r1試劑：其ph為7.2－7.5，溶劑為濃度等於0.35wt％的氯化鈉水溶液，溶質及其在所述溶劑中含量為：表面活性劑0.12％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；r2試劑：其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：二甲苯－苯胺－苯基硼酸偶聯物0.001wt％，表面活性劑0.12％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；r3試劑：具體為生理鹽水；r4試劑：其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：氯化鋅10mm，表面活性劑0.1％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜：纖維質膜。實施例2實施例2提供了一種糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測試劑盒，包括r1試劑、r2試劑、r3試劑、r4試劑、糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜；其中，r1試劑：其ph為7.2－7.5，溶劑是濃度為0.20wt％的氯化鈉水溶液，溶質及其在所述溶劑中含量為：表面活性劑0.18％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；r2試劑：其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：二甲苯－苯胺－苯基硼酸偶聯物0.003wt％，表面活性劑0.18％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；r3試劑：具體為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液；r4試劑：其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：硫酸鋅15mm，表面活性劑0.2％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜：玻璃纖維膜。實施例3實施例3提供一種糖化血紅蛋白、血紅蛋白檢測方法，具體是基於實施例1和實施例2提供的試劑盒進行的，具體包括如下步驟：取2.5μl待檢測血樣與100μlr1試劑，震蕩3s，得溶血後的血樣；將溶血後的血樣加入等體積的r2試劑，震蕩3s，得糖化血紅蛋白檢測樣；將糖化血紅蛋白檢測樣置於糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上，靜置5s後，再加入r4試劑液，再放置5s；用r3試劑清洗所述糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜；基於反射光度法對所述糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上的樣品位點進行檢測，採用波長分別為616nm、415nm，即可分別獲得檢測血樣中糖化血紅蛋白、血紅蛋白含量。在本實施例進行檢測的過程中，為了體現本發明試劑盒的優勢，本實施例還基於同樣的待檢測血樣進行了高效液相色譜法檢測，及採用購買市售生化試劑進行檢測，每種方法重複三次，結果見表1。表1採用不同的試劑盒、方法對同一樣品重複檢測三次的結果第一次第二次第二次實施例15.75.75.7實施例25.75.75.7hplc5.75.85.8生化試劑5.45.35.4基於上述表1所述的結果不難發現，本發明實施例1和實施例2提供的檢測試劑盒檢測結果極其接近於hplc，顯著優於市售生化試劑盒。進一步地，與hplc相比，實施例1和實施例2的試劑盒存在如下優勢：本發明的試劑盒使用者無需具備專業的醫療測試知識，只要根據試劑盒的說明書指示即可完成，熟練操作整個檢測方法不會超90s，並且重複性良好；本發明實施例的試劑盒在室溫下即可操作，環境對其幹擾及其微弱。在上述實施例實施過程中，發明人意外的發現：(1)對r1試劑做出本發明的限定具有意想不到的作用，具體是，該限定的r1試劑對血液中糖化血紅蛋白、血紅蛋白的釋放具有加速作用，在極短時間(最多3s)內即可徹底釋放，這樣不僅能增加檢測結果的準確性，而且還能間接對縮短檢測周期起到顯著作用；(2)儘管在細胞裂解液中增加表面活性劑是常用技術手段，但是發明人發現對表面活性劑的種類及其用量進行優化的情況下，紅細胞裂解產物狀態均勻穩定，受溫度影響不大，無需使用者在2－8℃下實施檢測，另外，在試劑盒貯存過程中，直接將其自然存在即可，無需對其貯存溫度進行限定；(3)在對r2試劑進行優化過程中，發明人發現，通過對發色團－硼酸偶聯物及表面活性劑含量、種類的優化，使得在將其加入溶血血樣後色團－硼酸偶聯物和糖化血紅蛋白結合速度加快，並且在將其混合物移至糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜上後，糖化血紅蛋白分布均勻，顆粒大小適中(直徑2－5μm)，與沉積膜結合牢固，能避免糖化血紅蛋白流失，增加檢測準確性；(4)在對r4試劑進行優化過程中，發明人發現，儘管鋅離子作為沉澱劑為本領域常見，但是對其濃度進行優化限定特別有利於加速血紅蛋白的沉積，並且沉積顆粒大小適中(直徑2－5μm)，顆粒分布均勻，在表面活性劑種類及含量優化的基礎上，r4試劑還無需貯存於2－8℃而直接置於常溫放置即可。在上述試劑種類及含量優化的基礎上，各個檢測環節加速進行，不僅能夠在小於90s的情況下完成檢測，而且存貯條件溫和，貨架期1年內任何時間檢測均能夠確保結果準確性。實施例4實施例4是實施例1的優選例，其優選之處在於r1試劑中的溶質及其含量，具體如下：r1試劑：其ph為7.35－7.45，溶劑為濃度等於0.35wt％的氯化鈉水溶液，溶質及其在所述溶劑中含量為：表面活性劑0.12％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；另外，r1試劑還包括0.002％w/v的疊氮化鈉、0.05％w/v的甘油、0.005％w/v的脫脂奶粉、0.001％w/v的酪蛋白，0.01％w/v的bsa；需要說明的是，r1試劑還包括0.001－0.003％w/v的疊氮化鈉、0.04－0.06％w/v的甘油、0.003－0.006％w/v的脫脂奶粉、0.001－0.003％w/v的酪蛋白、0.01－0.03％w/v的bsa的情況下依然能夠實現技術效果；只是在r1試劑還包括0.002％w/v的疊氮化鈉、0.05％w/v的甘油、0.005％w/v的脫脂奶粉、0.001％w/v的酪蛋白、0.01％w/v的bsa的效果最優；r2試劑：其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：二甲苯－苯胺－苯基硼酸偶聯物0.001wt％，表面活性劑0.12％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；還包括5mm的六水氯化鎂、1.2％v/v的甲醯胺；需要說明的是，六水氯化鎂的含量在2－8mm、甲醯胺的含量在1－1.5％v/v的條件下均可實現；r3試劑：具體為生理鹽水；r4試劑：其溶劑為甘氨酸－氫氧化鈉緩衝液，溶質及其在所述溶劑中的含量為：氯化鋅10－15mm，表面活性劑0.1％w/v；所述表面活性劑具體指tween20和tritonx－100質量比為2：1；還包括：10－15％v/v的乙醇、0.002－0.004％w/v的疊氮化鈉，0.1－0.3％w/w的氯化鈉；糖化血紅蛋白－血紅蛋白沉積膜：纖維質膜。發明人意外的發現，在對試劑盒試劑進行優化後，其整體穩定性顯著增加，具體如下：處理1：常溫放置4年的實施例4試劑盒；處理2：常溫放置2年的實施例4試劑盒；處理3：現時配置而成的實施例4試劑盒；處理4：現時配置而成的實施例1試劑盒；用上述四個處理檢測同一血樣，結果如下表2所示：表2處理1處理2處理3處理4糖化血紅蛋白含量5.75.75.75.7通過上述表4的結果可以看出，實施例4的試劑盒在存儲了4年之後，對血液檢測的準確性沒有降低，可見本實施例通過組分進行優化，最終對貨架期顯著提升。儘管不少現有技術對糖化血紅蛋白檢測試劑盒延長貨架期做出了諸多努力，但是延長的期限還是極其局限，而本發明通過試劑盒組分的優化，最終顯著改善了試劑盒的貨架期，這是本領域技術人員意想不到的。上述改進除了對試劑盒貨架期存在顯著提升作用外，發明人還發現存在如下有益效果：(1)分析範圍有所提升為了確定實施例4試劑盒的檢測範圍，發明人根據本領域常用技術配置了糖化血紅蛋白樣品梯度溶液(為0，0.5％，3％，5％，10％，12％，15％，20％，25％)，採用上述檢測方法對糖化血紅蛋白樣品梯度溶液進行了檢測，結果如下表3所示：表3通過表3可知，通過對試劑組分及含量的優化，本發明的試劑盒進一步在檢測範圍上有所提升，能夠檢測出0.5％含量級別的樣品，同時也能檢測到25％含量級別的樣品。這也說明，試劑組分及含量的優化提升了試劑盒的靈敏度。(2)批次穩定性有所提升為了確定實施例4試劑盒的批次穩定性，發明人根據本領域常用技術配置了糖化血紅蛋白樣品溶液(5％)，抽查五個批次的試劑盒基於上述檢測方法對樣品進行檢測，每個批次抽查10個試劑盒，最終統計每個批次的檢測結果平均值，具體結果見表4：表4第一批次第二批次第三批次第四批次第五批次實施例15.1％5％5％4.9％5％實施例45％5％5％5％5％通過表4可知，通過對試劑組分及含量的優化，本發明的試劑盒進一步在批次質量穩定性上有所提升，這說明，組分及含量的優化有助於試劑在物理化學性質上的穩定，從而保證其檢測結果的穩定性。(3)等效性實驗(與金標準高效液相色譜法進行方法學比對檢測)為評估上述實施例所述的糖化血紅蛋白檢測試劑盒(微粒色譜法)及檢測方法的準確性，與目前糖化血紅蛋白診斷採用的金標準高效液相色譜法進行方法學比對試驗。隨機選取檢驗科正常人和糖尿病人的共100人血液，每人取二份標本，立即送檢。實驗步驟：1)實施例1試劑盒：按照上述實施例中所述的試劑盒的實驗操作流程進行試驗；2)高效液相色譜法：採用美國bio－rad公司生產的糖化血紅蛋白檢測試劑盒(高效液相色譜法)，按照其說明書操作流程進行試驗。統計學方法：對100人的血液樣本檢測結果進行相關性分析，並求其相關係數。最終結論：請參見圖1，數據進行相關性分析，二者檢測結果高度相關，其相關係數是0.999，表明上述實施例1試劑盒檢測結果和金標準檢測結果等效。但高效液相色譜法檢測成本高，專業性太強，受環境幹擾大，穩定性差，而應用上述實施例中所述的試劑盒定量檢測hba1c，成本低廉，操作簡單，快速、靈敏。(4)可間斷性能測試大多數情況下，對糖化血紅蛋白的檢測為即時性的，即採樣完畢即刻檢測，每次檢測操作的人員、外部條件可能不同，因此難免造成誤差，最終導致連續測定的結果可比性不強；對於家用檢測試劑盒使用者來講，並非是每次採完血樣之後都有時間或者方便進行即刻檢測。為了驗證本發明的試劑盒能否克服上述技術問題，發明人進行了如下驗證：隨機選取檢驗科10名正常志願者，抽取血樣，並對血樣進行如下處理：處理1：將血樣立即加入實施例4的r1試劑，立即進行檢測，所得糖化血紅蛋白的含量分別為a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10；處理2：將血樣立即加入實施例4的r1試劑，常溫保存1個月，再進行後續檢測，所得糖化血紅蛋白的含量分別為b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10；處理3：將血樣立即加入實施例4的r1試劑，常溫保存2個月，再進行後續檢測，所得糖化血紅蛋白的含量分別為c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10；最後分別比較處理1、處理2、處理3所得對應數據，看數據波動是否明顯。結果顯示，a1、b1、c1三數據基本沒有波動，其他九組數據亦然。可見，本發明的r1試劑對樣品具有質量保證作用。為了闡述上述有益效果的機理，發明人設置如下對照，該對照是上述處理3的對照，對照之處在於：對照1：採用的試劑盒是改造的，改造之處在於將實施例4的r1試劑中的表面活性劑種類改為tween20單一種類，同時表面活性劑的含量修改為0.2％w/v；對照2：採用的試劑盒是改造的，改造之處在於將實施例4的r1試劑中的0.5％w/v的疊氮化鈉、0.05％w/v的bsa；對照3：採用的試劑盒是改造的，改造之處在於將實施例4的r2試劑中的六水氯化鎂的含量在10mm，r4試劑中的氯化鋅20mm。對對照1、對照2、對照3的數據進行統計，呈現的結果是，對照1和對照2的數據顯著差於處理2，而對照3的稍差於處理2。該結果標明，之所以在本發明提供的試劑盒在處理血樣之後可以延遲檢測，主要原因在於試劑r1的組分種類及含量，輔助原因在於r2試劑和r4試劑的協同作用。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁12