一種阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法與流程

2023-11-01 03:44:47

本發明主要涉及一種食用菌栽培技術領域，具體地說，本發明涉及一種食用菌野外保育技術領域。

背景技術：

阿魏菇（Pleurotus eryngii var. ferulae）是新疆當地對生長在傘形花科阿魏屬植物根莖部的側耳屬野生菌的統稱，是一種食、藥用價值都很高的珍稀食用菌。在中國，其野生資源僅分布在新疆準噶爾盆地邊緣氣候惡劣的戈壁阿魏灘上，並選擇性的腐生或寄生在中藥阿魏的根莖部，分布量稀少。阿魏植物每年4月返青，5月達到生長旺期，也是阿魏菇發生的高峰期，6月份阿魏植物開始乾枯，進入休眠期，直至第二年4月份再返青。近年，由於全球氣候變遷，生態破壞，以及人們對野生資源的過度採集和亂採濫挖等諸多因素使阿魏菇野生資源保有量急劇下降，一些區域的阿魏菇資源幾乎消失，亟待保育和保護。

技術實現要素：

針對現有技術現狀，特別是目前野生阿魏菇資源日益短缺的技術問題，本申請通過在青河縣阿魏菇野生資源保育區連續多年年開展的阿魏菇野外人工保育技術研究，建立了阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的技術，實現阿魏菇菌絲的定植，提供了一種阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法，使得野生的阿魏菇資源得以保護和發展，維繫了戈壁灘脆弱的生態環境，在野生阿魏菇資源的保護方面具有廣泛的適用性。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：

本發明提供了一種阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法，由以下步驟構成：

步驟1：預培養阿魏菇菌絲體並對雜菌檢測；

步驟2：將預培養好的菌絲體接種至滅菌處理的木屑培養基上，22℃～26℃暗培養，待菌絲長滿即為液體專用種，對其進行質量檢測;所述的檢測方法為：在無菌條件下，取液體專用種接種至PDA培養基平板，22℃～26℃暗培養2d～5d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的液體專用種製備菌絲體懸浮液並進行質量檢測；

步驟3：將菌絲體懸浮液用清水稀釋3倍～5倍，混勻後即為待用的液體菌種；

步驟4：阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物：

選擇沒有阿魏菇菌絲定植的阿魏植物，將阿魏根基部土壤用鐵鏟刨開，深度5cm～15cm，在不破壞阿魏根基部的腐根的情況下露出阿魏根基部，取80ml～120ml阿魏菇液體菌種均勻澆灌到阿魏根基部根組織上，然後將刨開的土壤全部回填至阿魏根基部，輕壓覆土，每年春、秋兩個時期對前1年進行的阿魏菇液體菌種回接試驗進行調查；調查方法為：用工具將阿魏根基部一側的土壤刨開，在不傷及阿魏根基部組織情況下清理乾淨露出阿魏根，觀察和記錄阿魏根基部阿魏菇菌絲的定植和生長情況。

本發明中，所述的阿魏菇菌絲體預培養包括從保藏箱中取出阿魏菇菌種，接種至PDA培養基平板上活化7d～15d，用接種針挑取0.5cm2～1cm2大小的菌餅接種至高壓蒸汽滅菌的PD液體培養基液面，保持菌餅的菌絲側朝上。然後置於22℃～26℃暗培養，待菌餅菌絲完全展開後放入搖床培養3d～7d，搖床設定轉速180rpm～240rpm，溫度為22℃～26℃；所述的雜菌檢測方法為：在無菌條件下，吸取80µl～150 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，用殺過菌的三角棒塗勻，於22℃～26℃暗培養2～5d，觀察培養基平板是否有雜菌。

優選地，菌餅取表層菌絲層。

本發明中，所述PD液體培養基是指80ml～120ml PD加富液體培養基盛放在250mL三角瓶中，三角瓶內提前放入10～20顆已滅菌的玻璃球。

本發明中，所述菌絲體懸浮液製備包括用接種棒將液體專用種搗碎，接種至盛有600ml～800ml PD加富培養基的1000ml三角瓶中，於搖床上培養，搖床設定轉速180rpm～240rpm，溫度為22℃～26℃。待專用種菌絲體長成和小米粒大小小菌絲球後對其進行質量檢測；所述的檢測方法為：在無菌條件下，吸取80µl～150 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，25℃暗培養2d～5d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的菌絲體懸浮液於4℃保存備用。

本發明的有益效果:

本發明提供的一種阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法，通過阿魏菇液體菌種製備和阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物，可以有效恢復戈壁灘上的阿魏屬植物根莖部的側耳屬野生菌菌絲，對於保護天然野生阿魏菇資源和恢復戈壁灘生態體系具有重大的現實意義。

附圖說明

圖1顯示為本發明中阿魏菇菌絲體預培養情況一。

圖2顯示為本發明中阿魏菇菌絲體預培養情況二。

圖3顯示為本發明中阿魏菇液體菌種專用種。

圖4顯示為本發明中阿魏菇液體菌種。

圖5顯示為本發明中阿魏植物根部處理情況。

圖6顯示為本發明中阿魏菇液體菌種回接情況。

圖7顯示為本發明中阿魏菇菌絲定植情況，圖中1表示定植的阿魏菇菌絲。

具體實施方式

下面對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述，但本發明的方法不限於下述實施例。

實施例一：阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法

本發明提供了一種阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法，由以下步驟構成：

步驟1：預培養阿魏菇菌絲體並對雜菌檢測。

步驟2：將預培養好的菌絲體接種至滅菌處理的木屑培養基上，25℃暗培養，待菌絲長滿即為液體專用種，對其進行質量檢測；所述的檢測方法為：在無菌條件下，取液體專用種接種至PDA培養基平板，25℃暗培養2d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的液體專用種製備菌絲體懸浮液並進行質量檢測，參見附圖3。

步驟3：將菌絲體懸浮液用清水稀釋3倍～5倍，混勻後即為待用的液體菌種。

步驟4：阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物：

選擇沒有阿魏菇菌絲定植的阿魏植物，將阿魏根基部土壤用鐵鏟刨開，深度10cm，在不破壞阿魏根基部的腐根的情況下露出阿魏根基部，取80ml～120ml阿魏菇液體菌種均勻澆灌到阿魏根基部根組織上，然後將刨開的土壤全部回填至阿魏根基部，輕壓覆土，每年春、秋兩個時期對前1年進行的阿魏菇液體菌種回接試驗進行調查；調查方法為：用工具將阿魏根基部一側的土壤刨開，在不傷及阿魏根基部組織情況下清理乾淨露出阿魏根，觀察和記錄阿魏根基部阿魏菇菌絲的定植和生長情況。

本發明中，所述的阿魏菇菌絲體預培養包括從保藏箱中取出阿魏菇菌種，接種至PDA培養基平板上活化7d～15d，用接種針挑取0.5cm2～1cm2大小的菌餅接種至高壓蒸汽滅菌的PD液體培養基液面，保持菌餅的菌絲側朝上。然後置於22℃～26℃暗培養，待菌餅菌絲完全展開後放入搖床培養3d～7d，搖床設定轉速180rpm～240rpm，溫度為22℃～26℃；所述的雜菌檢測方法為：在無菌條件下，吸取80µl～150 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，用殺過菌的三角棒塗勻，於22℃～26℃暗培養2～5d，觀察培養基平板是否有雜菌，參見附圖1和附圖2。

優選地，菌餅取表層菌絲層。

本發明中，所述PD液體培養基是指80ml～120ml PD加富液體培養基盛放在250mL三角瓶中，三角瓶內提前放入10～20顆已滅菌的玻璃球。

本發明中，所述菌絲體懸浮液製備包括用接種棒將液體專用種搗碎，接種至盛有600ml～800ml PD加富培養基的1000ml三角瓶中，於搖床上培養，搖床設定轉速180rpm～240rpm，溫度為22℃～26℃。待專用種菌絲體長成和小米粒大小小菌絲球後對其進行質量檢測；所述的檢測方法為：在無菌條件下，吸取80µl～150 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，25℃暗培養2d～5d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的菌絲體懸浮液於4℃保存備用，參見附圖4。

實施例二：阿魏菇液體菌種製備

本發明中，所述的阿魏菇菌絲體預培養包括從保藏箱中取出阿魏菇菌種，接種至PDA培養基平板上活化7d，用接種針挑取0.5cm2大小的菌餅接種至高壓蒸汽滅菌的PD液體培養基液面，保持菌餅的菌絲側朝上。然後置於22℃暗培養，待菌餅菌絲完全展開後放入搖床培養3d，搖床設定轉速180rpm，溫度為22℃；所述的雜菌檢測方法為：在無菌條件下，吸取80µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，用殺過菌的三角棒塗勻，於22℃暗培養2d，觀察培養基平板是否有雜菌，參見附圖1和附圖2。

優選地，菌餅取表層菌絲層。

本發明中，所述PD液體培養基是指80ml的PD加富液體培養基盛放在250mL三角瓶中，三角瓶內提前放入10顆已滅菌的玻璃球。

本發明中，製備木屑培養基，滅菌處理後，將預培養好的菌絲體懸液接種至木屑培養基上，22℃暗培養，待菌絲長滿即為液體專用種；對其進行質量檢測，檢測方法為：在無菌條件下，取液體專用種接種至PDA培養基平板，22℃暗培養2d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的液體專用種於4℃保存備用，參見附圖3。

本發明中，所述菌絲體懸浮液製備及質量檢測包括用接種棒將液體專用種搗碎，接種至盛有600ml PD加富培養基的1000ml三角瓶中，於搖床上培養，搖床設定轉速180rpm，溫度為22℃。待專用種菌絲體長成和小米粒大小的小菌絲球後對其進行質量檢測，檢測方法為：在無菌條件下，吸取80µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，25℃暗培養2d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的菌絲體懸浮液於4℃保存備用，參見附圖4。

實施例三：阿魏菇液體菌種製備

本發明中，所述的阿魏菇菌絲體預培養包括從保藏箱中取出阿魏菇菌種，接種至PDA培養基平板上活化15d，用接種針挑取1cm2大小的菌餅接種至高壓蒸汽滅菌的PD液體培養基液面，保持菌餅的菌絲側朝上。然後置於26℃暗培養，待菌餅菌絲完全展開後放入搖床培養7d，搖床設定轉速240rpm，溫度為26℃；所述的雜菌檢測方法為：在無菌條件下，吸取150 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，用殺過菌的三角棒塗勻，於26℃暗培養5d，觀察培養基平板是否有雜菌，參見附圖1和附圖2。

優選地，菌餅取表層菌絲層。

本發明中，所述PD液體培養基是指120ml的 PD加富液體培養基盛放在250mL三角瓶中，三角瓶內提前放入20顆已滅菌的玻璃球。

本發明中，製備木屑培養基，滅菌處理後，將預培養好的菌絲體懸液接種至木屑培養基上，26℃暗培養，待菌絲長滿即為液體專用種；對其進行質量檢測，檢測方法為：在無菌條件下，取液體專用種接種至PDA培養基平板，26℃暗培養5d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的液體專用種於4℃保存備用，參見附圖3。

本發明中，所述菌絲體懸浮液製備及質量檢測包括用接種棒將液體專用種搗碎，接種至盛有800ml PD加富培養基的1000ml三角瓶中，於搖床上培養，搖床設定轉速240rpm，溫度為26℃。待專用種菌絲體長成和小米粒大小小菌絲球後對其進行質量檢測，檢測方法為：在無菌條件下，吸取150 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，25℃暗培養5d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的菌絲體懸浮液於4℃保存備用，參見附圖4。

實施例四：阿魏菇液體菌種製備

本發明中，所述的阿魏菇菌絲體預培養包括從保藏箱中取出阿魏菇菌種，接種至PDA培養基平板上活化10d，用接種針挑取0.8cm2大小的菌餅接種至高壓蒸汽滅菌的PD液體培養基液面，保持菌餅的菌絲側朝上。然後置於25℃暗培養，待菌餅菌絲完全展開後放入搖床培養5d，搖床設定轉速210rpm，溫度為24℃；所述的雜菌檢測方法為：在無菌條件下，吸取100 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，用殺過菌的三角棒塗勻，於25℃暗培養3d，觀察培養基平板是否有雜菌，參見附圖1和附圖2。

優選地，菌餅取表層菌絲層。

本發明中，所述PD液體培養基是指80ml～120ml PD加富液體培養基盛放在250mL三角瓶中，三角瓶內提前放入15顆已滅菌的玻璃球。

本發明中，製備木屑培養基，滅菌處理後，將預培養好的菌絲體懸液接種至木屑培養基上，24℃暗培養，待菌絲長滿即為液體專用種；對其進行質量檢測，檢測方法為：在無菌條件下，取液體專用種接種至PDA培養基平板，23℃暗培養4d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的液體專用種於4℃保存備用，參見附圖3。

本發明中，所述菌絲體懸浮液製備及質量檢測包括用接種棒將液體專用種搗碎，接種至盛有700ml PD加富培養基的1000ml三角瓶中，於搖床上培養，搖床設定轉速210rpm，溫度為23℃。待專用種菌絲體長成和小米粒大小小菌絲球後對其進行質量檢測，檢測方法為：在無菌條件下，吸取110 µl菌絲體懸浮液接種至PDA培養基平板，25℃暗培養3d，觀察是否汙染細菌或真菌，選取沒有汙染的菌絲體懸浮液於4℃保存備用，參見附圖4。

實施例五：阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物

本發明中，所述寄主阿魏的選擇並對根部處理包括選擇沒有阿魏菇菌絲定植的阿魏植物，將阿魏根基部土壤用鐵鏟刨開，深度5cm，在不破壞阿魏根基部的腐根的情況下露出阿魏根基部，參見附圖5。

本發明中，所述阿魏根部液體菌種回接和根部處理是指取80ml阿魏菇液體菌種均勻澆灌到阿魏根基部根組織上，然後將刨開的土壤全部回填至阿魏根基部，輕壓覆土，參見附圖6。

本發明中，所述對阿魏菇液體菌種野外回接試驗進行調查記錄是指每年春、秋兩個時期對前1年進行的阿魏菇液體菌種回接試驗進行調查；調查方法為：用工具將阿魏根基部一側的土壤刨開，在不傷及阿魏根基部組織情況下清理乾淨露出阿魏根，觀察和記錄阿魏根基部阿魏菇菌絲的定植和生長情況，參見附圖7。

實施例六：阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物

本發明中，所述寄主阿魏的選擇並對根部處理包括選擇沒有阿魏菇菌絲定植的阿魏植物，將阿魏根基部土壤用鐵鏟刨開，深度15cm，在不破壞阿魏根基部的腐根的情況下露出阿魏根基部，參見附圖5。

本發明中，所述阿魏根部液體菌種回接和根部處理是指取120ml阿魏菇液體菌種均勻澆灌到阿魏根基部根組織上，然後將刨開的土壤全部回填至阿魏根基部，輕壓覆土，參見附圖6。

本發明中，所述對阿魏菇液體菌種野外回接試驗進行調查記錄是指每年春、秋兩個時期對前1年進行的阿魏菇液體菌種回接試驗進行調查；調查方法為：用工具將阿魏根基部一側的土壤刨開，在不傷及阿魏根基部組織情況下清理乾淨露出阿魏根，觀察和記錄阿魏根基部阿魏菇菌絲的定植和生長情況，參見附圖7。

實施例七：阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物的方法可行性分析

阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物試驗，連續做了多年，每年接種選擇春季5月份，其中，2014年接種數量為240株，2015年為250株，2016年為350株。

當年接種的試驗在當年秋季9月份進行調查，調查結果顯示：2014年阿魏菇菌絲成功定植率為83.82%，2015年成功定植率為64.28%，2016年成功定植率為66.10%，平均成功定植率為72.59%。

試驗結果表明利用阿魏菇液體菌種野外接種阿魏植物方法可以有效提高阿魏菇菌絲在野生阿魏植物根部的定植率。

在中國，其野生資源僅分布在新疆準噶爾盆地邊緣氣候惡劣的戈壁阿魏灘上，並選擇性的腐生或寄生在中藥阿魏的根莖部，分布量稀少。近年，由於環境和人為因素，阿魏菇野生資源保有量急劇下降， 一些區域的阿魏菇資源幾乎消失，亟待保護。同時，目前國內多年生產的栽培菌株均來自新疆野生子實體的分離，而近年國內栽培的阿魏菇存在菌株混亂、種性不穩定、菌種退化等問題也需要野生阿魏菇品種選育資源。但是阿魏菇野外生長環境惡劣，繁殖能力低，自然繁育成活低，要將阿魏菇液體菌種野外接種回阿魏植物更是要求苛刻。阿魏菇液體菌種製備的活性對阿魏菇菌種野外接種有著至關重要的影響，傳統方法製備的阿魏菇菌體在人工提供的環境中也會存在種性不穩定，菌種退化的問題，如果將其接種到野外惡劣環境中更是難以成活，野外接種時接種的深度和阿魏菇液體菌種的多少都會影響定植率，本發明研究結果顯示，深度過深或者過淺都會造成定植率成倍降低，接種時阿魏菇液體菌種過少也是定植率較低，阿魏菇液體菌種過多也會出現接種成功的逐年死亡情況，均不能實現恢復野外阿魏菇資源的目的。本發明提供的技術方案將已經馴化培育或者將野生阿魏菇菌種二次培育接種到野外阿魏植物的根部，對保護阿魏菇種質資源具有良好的效果，以本發明定植率，只要加大接種量，很快野生阿魏菇資源又會回到幾年前的數量。

如上所述，即可較好地實現本發明,上述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明確定的保護範圍內。