一種基於電化學dna生物傳感器的1,8-二氨基萘的測定方法

2023-05-15 10:49:31

專利名稱：一種基於電化學dna生物傳感器的1,8-二氨基萘的測定方法
技術領域：
本發明屬於電化學檢測和化學傳感器技術領域，涉及ー種基於hairpin DNA的電化學DNA生物傳感器的製備及將所製備的hairpin DNA生物傳感器用於檢測1，8- ニ氨基萘。
背景技術：
芳香胺是ー類重要的環境汙染物，已被列為優先監控的環境汙染物之一。在エ業 上芳香胺用途非常廣泛，作為重要的化工原料和精細化工中間體，常被用於印染、製藥、食品、醫藥、炸藥、農藥、化妝品、塑料、橡膠、紡織、造紙、陶瓷上釉和油漆等エ藝生產過程，尤其是印染エ業，廢水常含高濃度的芳香胺中間體，而且部分染料經過複雜的化學反應和微生物作用也最終釋放出芳香胺，從而造成大範圍的水體等環境體系的汙染。研究表明，許多芳香胺進入人體後經過體內的活化作用可改變DNA的結構，引起人體病變和誘發癌症,如導致膀胱癌、輸尿管癌、腎癌等惡性疾病，對人們的健康構成極大的威脅。因此，建立、完善和發展芳香胺汙染物的分析方法是環境綜合治理的關鍵環節之一，也是分析化學和環境化學的熱點研究課題，具有重要的研究意義。傳統的芳香胺的分析檢測方法很多，如比色法、滴定法、薄層色譜法和分光光度法等，但這些方法的靈敏度低、選擇性差，而且很難測定每種芳香胺含量。隨著儀器和分析手段的發展，氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等開始應用於分析芳香胺化合物，這些方法能同時定量測定多種芳香胺汙染物，具有高效靈敏等特點，但是具有設備昂貴、需專業技術人員操作、樣品處理繁瑣等缺點。近年來，隨著電化學技術和DNA生物傳感技術的發展，DNA生物傳感器作為ー種新型的檢測技術被用於檢測環境汙染物，具有特異性、高靈敏性、選擇性、操作簡單等優點。基於芳香胺小分子與雙鏈DNA的插入作用實現了應用電化學DNA生物傳感器對芳香胺的檢測。Wang等應用天然小牛胸腺DNA修飾的碳糊電極生物傳感器，實現了對2-氨基萘、I-氨基蒽、2-氨基蒽、9，10- ニ氨基菲、I-氨基吡等芳香胺類汙染物的檢測，與未採用DNA修飾的電極相比，靈敏性顯著提高，檢測限可達到納摩爾數量級。研究發現，這種DNA傳感器對不同芳香胺類汙染物電化學響應信號因氨基取代位置不同有較大差異。Mascini等採用單鏈、雙鏈小牛胸腺DNA修飾的絲網石墨印刷電極傳感器，採用計時電勢分析法研究並比較了 2-氨基萘、2-氨基蒽、1，2-ニ氨基蒽醌等芳香胺化合物與DNA的相互作用。研究發現芳香胺類化合物與單、雙鏈DNA修飾的DNA生物傳感器作用後鳥嘌呤氧化峰電流均降低，這主要是源於芳香胺分子與DNA鹼基發生作用後產生保護作用，使得電極表面的鹼基更不容易被氧化。Chiti等採用天然小牛胸腺DNA、鯡魚精DNA、鮭魚精DNA和含23個鹼基的DNA片段修飾的絲網石墨印刷電極傳感器，採用計時電勢分析法研究並比較了 2-氨基萘、2-氨基蒽、1，2_ ニ氨基蒽醌、吖啶黃等芳香胺化合物與雙鏈DNA的相互作用。以鳥嘌呤氧化峰電流變化為指標，研究發現DNA鹼基的序列越長鳥嘌呤氧化峰電流響應信號越強，在此基礎上採用天然DNA序列修飾的DNA生物傳感器對芳香胺進行檢測，檢測限達到亞微摩爾。Prabhakar等應用天然小牛胸腺DNA修飾的聚卩比咯_聚氯こ烯磺酸鹽/氧化銦膜電極傳感器，用循環伏安法對芳香族化合物2-氨基蒽進行了檢測，鳥嘌呤氧化峰電流與濃度具有較好的線性關係，信號-濃度在O. OOlXlO-6 6. OOXlO-6範圍線性相關，檢測限達到亞微摩爾。目前，應用電化學DNA生物傳感器對芳香胺類汙染物的檢測還比較少，且均是採用天然生物體DNA序列。雖然這些DNA生物傳感器對芳香胺類汙染物具有較高的靈敏性，但其不足之處是通過吸附作用修飾到電極表面的DNA膜的均一性、穩定性較差。到目前為止，應用人工合成的雙硫修飾DNA序列製備的金電極傳感器對芳香胺類化合物的檢測還未見報導，人工合成的含雙硫修飾的DNA片段通過金-硫鍵作用自組裝修飾到金電極表面， DNA膜結構高度有序，穩定性好且可以根據實驗對DNA鹼基序列設計、調整，從而製備專ー性、高靈敏性的DNA生物傳感器，這在完善我國現有檢測技術手段具有重要意義和較好的應用價值。

發明內容
本發明的目的在於提供一種基於金電極表面hairpin DNA的電化學生物傳感器的快速檢測1，8_ ニ氨基萘的方法。本發明所採用的hairpin DNA修飾電極的製備方法條件溫和，操作簡單，穩定性好，運用此法製備的hairpin DNA生物傳感器對I，8-ニ氨基萘的檢測具有高靈敏性的優點。I本發明的第一方面，涉及ー種hairpin DNA修飾的金電極的製備方法，具體包括下列步驟I)電極的預處理與活化將金電極在鹿皮拋光布上用O. 05 μ m的a -Al2O3粉末拋光至鏡面，拋光後先洗去表面汙物，並依次在こ醇和去離子水中超聲清洗，毎次2 3min，重複三次；然後在O. 5mol/L H2SO4溶液中經循環伏安掃描至穩定，最後用去離子水衝洗乾淨，氮氣吹乾，即可得到表面乾淨的金電極。2) Hairpin DNA 溶液的配製將固體hairpin DNA用pH = 7. 4的高離子強度Tris-NaClO4緩衝溶液溶解並稀釋到一定濃度，並用漩渦振蕩器混勻，靜置於室溫下12h，備用。3)Hairpin DNA修飾電極的製備將上述步驟I)活化處理的金電極浸泡在上述步驟2)配製的hairpin DNA溶液中，靜置於室溫下4-5天。巰基修飾的hairpin DNA通過Au-S鍵作用自組裝於金電極表面，即得到hairpin DNA修飾電極。優選地，上述步驟2)中Tris-NaClO4緩衝溶液中Tris濃度為20mM，NaClO4濃度為300mM。優選地,上述步驟2)中所使用的hairpin DNA為5'端硫基修飾的含30個鹼基的hairpin DNA序列。其中共包含三部分hairpin DNA序列靠近5'端的前9個鹼基胸腺嘧唳為柔性間_基團，用以保持hairpin結構的雙鏈部分以及hairpin DNA結構的「環」狀部分。
優選地，上述步驟2)中所述hairpin DNA雙鏈部分匹配鹼基數為5對。優選地,上述步驟2)中所述hairpin DNA濃度為5 μ Μ。本發明中，所使用的hairpin DNA結構是本領域人員所熟悉的，其獲得可以通過供
應商獲得。本發明的另一方面，涉及應用如上述製備方法得到的hairpin DNA修飾電極對1，8_ニ氨基萘檢測的方法，其具體檢測方法為以Ag/AgCl (飽和KCl溶液)為參比電極，鉬電極為對電極，以hairpinDNA修飾電極為工作電極構築三電極體系,將hairpin DNA修飾電極在K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (2mM)溶液中進行電化學阻抗測量，測完後用緩衝溶液淋洗，然後置於緩衝溶液Tris-NaClO4 (20mM，pH = 7. 4)配製的一定濃度的1，8_ ニ氨基萘溶液中20min，然後再進行電化學阻抗測定，比較作用前後阻抗值的變化。
與現有技術相比本專利技術具有以下優點I.本發明所採用的DNA序列為人工合成的雙硫修飾的DNA序列，DNA序列可以進行調整；2.本發明所採用的hairpin DNA序列的「莖」部分的匹配鹼基對為5對，對1，8_ ニ
氨基萘檢測具有較高的靈敏性；3.本發明是通過金-硫鍵作用將hairpin DNA自組裝於金電極表面,該方法得到的DNA膜穩定性好，表面結構高度有序，方法簡單易行，抗環境因素幹擾性能強；4.本發明所製備的hairpin DNA生物傳感器對1，8_ ニ氨基萘的檢測具有操作簡單、響應速度快、成本較低等特點；5.本發明所採用的電化學交流阻抗法是研究電極界面現象的ー種重要手段，對DNA電極膜層電阻的變化具有高靈敏度性。


圖I為金電極(·)及hairpin DNA修飾電極(ロ)的阻抗譜圖；圖2為使用本發明的hairpin DNA修飾電極與1，8_ ニ氨基萘作用前後的尼奎斯特阻抗譜圖DNA膜(□)，與1，8_ ニ氨基萘作用(·)；其中，橫坐標代表電化學阻抗的實 部(電阻)，單位為Ω · cm2，縱坐標代表電化學阻抗的虛部(電容)，單位為Ω · cm2 ;圖3為使用本發明的hairpin DNA修飾電極測定的電荷傳遞電阻的變化值(Λ Rct)與I，8-ニ氨基萘濃度關係曲線(□)，(·)為空白對照；其中，橫坐標代表I，8-ニ氨基萘濃度，單位為ηΜ，縱坐標代表電荷傳遞電阻的變化值，単位為Ω · cm2 ;
具體實施例方式以下實施實例對本發明做更詳細的描述，但所述實施不構成對本發明的限制。實施例II)將金電極在鹿皮拋光布上用O. 05 μ m的a -Al2O3粉末拋光至鏡面，拋光後先洗去表面汙物，並依次在こ醇和去離子水中超聲清洗，毎次2 3min，重複三次；然後在Imol/L H2SO4溶液中經循環伏安掃描至穩定，最後用去離子水衝洗乾淨，氮氣吹乾，即可得到表面乾淨的金電極；2)以pH = 7. 4的高離子強度Tris-NaClO4緩衝溶液將固體hairpin DNA溶解，其中Tris濃度為20mM，NaClO4濃度為300mM，用漩渦振蕩器混勻，並靜置於室溫下12h，在此條件下形成hairpin DNA結構；3)將活化處理的金電極浸泡在預先配製的5 μ M的hairpin DNA溶液中，靜置於室溫下4-5天，即得到hairpin DNA修飾電極；實施例2以本發明的hairpin DNA修飾電極作為工作電極，以Ag/AgCl (飽和KCl溶液)電極為參比電極，鉬電極為對電極構築三電極體系，電解液為PH = 7. 4的20mmol/LTris-NaClO4緩衝溶液配製的2mMK3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]，I，8- ニ氨基萘溶液配製濃度分另Ij 為0. Inmol/L、0. 3nmol/L、0. 6nmol/L、3nmol/L、6nmol/L、30nmol/L、60nmol/L、120nmol/L、300nmol/L及600nmol/L。應用PARSTAT2273電化學綜合測試系統進行電化學阻抗測定，實驗表明，此hairpin DNA修飾電極具有優異的性能,響應時間快,靈敏度高,對1,8-ニ氨基萘的檢測線性範圍0. 6 120nmol/L。表IHairpin DNA生物傳感器與1，8_ ニ氨基萘作用後的電化學阻抗變化(ARct)
權利要求
1.一種基於電化學DNA生物傳感器的1,8-ニ氨基萘的測定方法,其特徵在於包括以下步驟 1)電極的預處理與活化 將金電極在鹿皮拋光布上用O. 05 μ m的a -Al2O3粉末拋光至鏡面，拋光後先洗去表面汙物，並依次在こ醇和去離子水中超聲清洗，毎次2 3min，重複三次；然後在O. 5mol/LH2SO4溶液中經循環伏安掃描至穩定，最後用去離子水衝洗乾淨，氮氣吹乾，得到表面乾淨的金電極； 2)Hairpin DNA溶液的配製 將固體hairpin DNA藥品用pH = 7. 4的高離子強度Tris-NaClO4緩衝溶液溶解並稀釋到一定濃度，並用漩渦振蕩器混勻，於室溫下靜置12h以備用； 3)Hairpin DNA修飾電極的製備 將上述步驟I)活化處理的金電極浸泡在上述步驟2)配製的hairpin DNA溶液中，靜置於室溫下4-5天。巰基修飾的hairpin DNA通過Au-S鍵作用自組裝於金電極表面，從而得到hairpin DNA修飾電極。
2.如權利要求I所述的hairpinDNA修飾的金電極的製備方法,其特徵在於所述Tris-NaClO4緩衝溶液中Tris濃度為20mM，NaClO4濃度為300mM。
3.根據權利要求I或2所述的製備方法，其特徵在幹所使用的hairpinDNA為5'端雙硫修飾的含30個鹼基的hairpin DNA序列。其中共包含三部分hairpin DNA序列靠近5'端的前9個鹼基胸腺嘧啶為柔性間隔基團，用以保持hairpin結構的雙鏈部分及hairpin DNA結構的「環」狀部分。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在幹hairpinDNA的「莖」部分匹配的鹼基為5對。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述hairpinDNA的濃度為5 μ Μ。
6.—種應用如權利要求1-4中任ー項所述製備方法得到的hairpin DNA修飾電極對·1，8_ ニ氨基萘檢測的方法，其特徵在於具體步驟為以Ag/AgCl (飽和KCl溶液)為參比電極，鉬電極為對電極，以hairpin DNA修飾電極為工作電極構築三電極體系,將hairpin DNA修飾電極在K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6] (2mM)溶液中進行電化學阻抗測量，測完後用緩衝溶液淋洗，然後置於緩衝溶液Tris-NaClO4 (20mM，pH = 7. 4)配製的一定濃度的1，8_ ニ氨基萘溶液中20min，然後再進行電化學阻抗測定，比較作用前後阻抗值的變化。
7.如權利要求6所述的hairpinDNA修飾電極在水中對1，8_ ニ氨基萘的檢測。
全文摘要
一種基於電化學DNA生物傳感器的1,8-二氨基萘的測定方法。本發明屬於基於hairpin DNA修飾的金電極進行1，8-二氨基萘檢測的電化學檢測和化學傳感器技術領域，涉及一種對1，8-二氨基萘有電化學響應的hairpin DNA修飾的金電極的製備以及運用此電極1，8-二氨基萘的檢測。具體的以雙硫修飾的hairpin DNA為原料，通過金-硫鍵作用自組裝到金電極表面製備hairpin DNA修飾電極。此hairpin DNA電極與1，8-二氨基萘作用後，導致DNA膜層的阻抗發生變化，根據其響應的阻抗的變化可以對1，8-二氨基萘進行檢測。該DNA傳感器製備方法條件溫和，簡單方便，穩定性好，且具有高靈敏度且操作簡單等優點。
文檔編號G01N27/26GK102692435SQ201210111438
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者付文君, 劉新會, 鞏文雯, 李曉宏, 梁剛, 陶莉 申請人:北京師範大學