使用酶的蛋白質的改性方法

2023-05-15 10:28:36 1

專利名稱：使用酶的蛋白質的改性方法
技術領域：
[相關專利的記載]本發明基於日本國專利申請日本特願2008-066765號(2008年3月14日申請) 及特願2008-294890號(2008年11月18日申請)的優先權主張，該申請中的全部記載內 容作為引用包含於本說明書中。本發明涉及蛋白質的改性方法，其特徵在於使用作為修飾蛋白質中的穀氨醯胺 殘基的酶的轉穀氨醯胺酶和蛋白穀氨醯胺酶兩者發揮作用而進行2種酶反應。此外，本 發明也涉及含有使用此方法的改性蛋白質的食品、以特定的比例含有蛋白穀氨醯胺酶及 轉穀氨醯胺酶兩者的蛋白質改性用酶製劑、發現向底物蛋白質中添加蛋白質穀氨醯胺酶 和轉穀氨醯胺酶的適當添加量比的方法等。
背景技術：
轉穀氨醯胺酶(以下簡稱TG)為催化蛋白質及肽中的穀氨醯胺殘基的Y-羧醯胺 基和伯胺之間的醯基轉移反應的酶。TG作用於作為醯基受體的蛋白質中的賴氨酸殘基的 ε-氨基，引起蛋白質交聯聚合反應。此外，在伯胺不存在的情況下，水可作為醯基受 體而發揮作用，而催化將穀氨醯胺殘基轉化為穀氨酸殘基的脫醯胺反應。在食品中應用 時，大部分是通過蛋白質的交聯反應的，目前利用蛋白質的凝膠形成性賦予或提高，在 不加熱情況下的蛋白質的凝膠化、粘著等性質，開發應用於魚餅、火腿、香腸、面類、 豆腐、麵包等種種用途的TG製劑。另一方面，蛋白質穀氨醯胺酶(以下簡稱PG)，為對蛋白質中的穀氨醯胺殘基的 醯胺基具有脫醯胺作用的酶。其詳細記述如專利文獻1、專利文獻2、非專利文獻1等的 公開所示。依據這些文獻，PG直接作用於蛋白質中的醯胺基，因而將蛋白質中的穀氨醯 胺殘基轉轉化為穀氨酸殘基，生成羧基，因而引起蛋白質的負電荷的增加、靜電斥力的 上升、等電點的降低、水合力的增加等。其結果是，引起了蛋白質的溶解性、水分散性 的增加，乳化力和乳化穩定性的上升等種種機能特性的上升，而期待蛋白質的用途得到 擴大。因此，已知TG和PG均為產業上有用的酶，但是至於在這些酶合用的情況下得 到新的附加效果的嘗試，卻基本無具體實例的報導。相反，在專利文獻1中顯示了作為 TG反應控制劑的PG利用實例，非專利文獻2中也記載有在PG、TG共存的情況下，TG 引起的交聯反應不能發生。故就有關TG和PG的反應性的差異更詳細地描述目前的認 識。兩種酶在其底物蛋 白質中的靶標均為相同的穀氨醯胺殘基。但是，和TG相比，PG 對蛋白質中的各個穀氨醯胺殘基的底物特異性更廣。認為這是因為，在TG的情況下，除 了穀氨醯胺殘基以外必須存在賴氨酸殘基的ε-氨基，而與此相對，在PG的情況下，除 了穀氨醯胺殘基以外，只需要在反應環境中存在豐富的水即可。例如，對酪蛋白中的谷 氨醯胺殘基的反應性來說，從Km值、kcat值來看，PG比TG具有壓倒性的高催化效率， 在兩者共存的情況下，PG反應優先進行，脫醯胺化了的穀氨醯胺殘基不能作為TG的底物，不能進行交聯反應。實際上，據在使用TG的酪蛋白的交聯高分子化反應的途中添加 PG的實驗顯示，結果是酪蛋白的高分子化在添加的同時停止。此外，也確認了用PG事 先進行充分脫醯胺化的酪蛋白已經不能作為TG的底物，即不能進行交聯高分子化(非專 利文獻2)。此外，Y.S.Gu等就本酶對α-乳清蛋白的反應性進行了調查，報告稱6個谷 氨醯胺殘基中有4個進行了脫醯胺化(非專利文獻3)。另一方面，放線菌TG僅能作用 於作為上述4個中的1個的穀氨醯胺54，因此可認為PG的底物特異性廣於TG。此外， 在專利文獻1中，利用PG對穀氨醯胺殘基的高反應性，能夠在適當的時間點使TG反應 停止，列舉了 PG有代替不適於添加入食品中的EDTA和氯化銨等一般公知的TG阻斷劑 的可能性。
然而，現在為止尚無舉例根據因PG導致TG反應停止以外的觀點而將兩者合用 的方法的提案。不僅如此，至於將TG和PG兩者作用於底物蛋白質而得到目的的效果的 條件，更詳細而言，TG反應不因PG而停止，在有PG共存的條件下也不損害TG反應及 其改性效果的條件，僅從目前的認識是不能得知的。此外，對於各種底物蛋白質，使TG 和PG在何種比例下作用的情況下，能夠顯示何種效果等，顯示用於有效地使用兩酶的具 體方法的實例也不存在，故應該說是全新的嘗試，如要進行TG、PG引起的改性蛋白質 製品的開發，必須依照各用途摸索最適的反應條件是目前的現狀。此外，由於酶反應因處理時間、溫度、酶添加量、底物的種類、狀態、底物特 異性等種種因素，其反應量及其效果的程度不同，故在共同的底物中使用2種酶並不容 易，開發者、加工業者為依照用途決定所需要的食品的製造條件，而需耗費大量的時間 和勞力。究其原因，是因為酶反應依處理時間、溫度、酶添加量、底物的種類、狀態、 底物特異性等種種因素的不同而引起其反應量及其效果的程度不同，除此之外，若要使 兩種酶同時發揮作用，必須對所有的組合進行研究。因此要求開發自如使用具有共同底 物的2種酶的方法。不過，現在為止，作為對TG的底物特異性進行研究的方法，已知有使用NMR 的方法(專利文獻3)。也就是說，在15N標記的氯化銨存在下使任意蛋白質與TG作用， 將作為TG的底物的穀氨醯胺殘基的羧醯胺氮用15N標記的蛋白質用NMR進行觀測，而 追蹤TG的反應的方法。若使用這種方法，可以使用蛋白質底物同時解析反應性和底物 特異性。然而，在專利文獻3中，並未記載PG反應的穀氨醯胺殘基的羧醯胺氮能用15N 進行標記。專利文獻1 日本特開2000-50887號公報專利文獻2 日本特開2001-218590號公報專利文獻3 日本特開2002-332295號公報非專利文獻1 Yamaguchi 等、Eur.J.Biochem.Vol.268，2001，1410-1412 頁非專利文獻2 食品酶化學的最新技術和應用-食品蛋白混合物的展望-(CMC 出版)、146 153頁非專利文獻3: Y.S.Gu 等、J.Agric.Food Chem.Vol.49，2001，5999-6005 頁

發明內容
發明所要解決的課題
上述專利文獻1 3及非專利文獻1 3的全部公開內容作為引用而記載於本說 明書中。以下分析是依照本發明的觀點得出的。本發明的目的在於提供使蛋白穀氨醯胺酶及轉穀氨醯胺酶兩者作用於蛋白質而 使蛋白質改性的方法，提供含有使用兩酶進行改性的蛋白質的食品，提供含有兩酶的蛋 白質改性用酶製劑，提供簡便地發現蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的適當添加量比的 方法。解決課題的手段本發明者們針對上述情況進行了深入的研究，結果發現，現在為止，在PG存在 的情況下TG不能發揮作用，難於得到PG、TG的合用效果，但在特定條件下，在PG和 TG共存的情況下，發現兩酶對底物蛋白質發揮作用，可得到兩酶的合用效果。此外，發 現了以下事實PG和TG—樣，除了可以催化蛋白質中穀氨醯胺殘基的脫醯胺化之外， 也可以催化和銨鹽的交換反應。也就是說，TG或PG所反應的穀氨醯胺殘基的羧醯胺氮 可以用15N標記。因此發現，檢出15N標記的檢測法，例如若進行1H-15N HSQC測定， 可由NMR信號強度估算15N標記率，可獲知各反應性的差異。此外，還發現，對於各種 蛋白質，TG和PG的存在比例與各自的NMR信號強度比例具有良好的相關性。此外還 發現了在以PG對TG的信號強度比例(以下簡稱PG/TG信號強度比)在0.2 3.0的範 圍的PG/TG的酶重量比或活性比是如下情況的條件TG反應不因PG而停止，即使在 PG共存的條件下也不損害TG反應及其改性效果。即，在15N標記銨鹽存在的情況下， 使TG或PG分別作用於各種底物，使用NMR比較兩者的底物特異性，能夠簡便地發現 得到兩酶合用效果的條件。本發明人等不僅發現使PG和TG同時作用的優點，而且成功 制定現實地且容易地決定該條件的方法。也就是說，本發明如下所述。(1)蛋白質的改性方法，其通過使蛋白穀氨醯胺酶及轉穀氨醯胺酶作用於蛋白質 而使蛋白質改性，其中，蛋白穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的時間和轉穀氨醯胺酶添加到 蛋白質中的時間大致相同或者在轉穀氨醯胺酶作用於該蛋白質之前。(2) (1)中記載的方法，其中，以活性比計，添加至蛋白質中的蛋白穀氨醯胺酶 和轉穀氨醯胺酶的添加量為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.05 3 1。(3) (1)或⑵中記載的方法，其中，以重量比計，添加至蛋白質中的蛋白穀氨 醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的添加量為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.01 0.7 1。(4) (1)至(3)中任一項記載的改性方法，其中，以NMR信號強度比計，是添加 至蛋白質中的蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的添加量為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺 酶=0.2 3.0 1的條件。(5) (1)至(4)中任一項記載的方法，其中，蛋白質為選自乳蛋白、乳清蛋白、 大豆蛋白、小麥谷蛋白、血漿、肌肉蛋白質、膠原及明膠的1種或2種以上的蛋白質。(6)食品，其含有使用⑴至(5)中任一項記載的方法改性過的蛋白質。(7)蛋白質改性用酶製劑，其中，以活性比計，轉穀氨醯胺酶蛋白穀氨醯胺酶 的摻混比例為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.05 3 1。(8)蛋白質改性用酶製劑，其中，以重量比計，轉穀氨醯胺酶蛋白穀氨醯胺酶 的摻混比例為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.01 0.7 1。
(9)蛋白質改性用酶製劑，其特徵在於，以NMR信號強度比計，是轉穀氨醯胺 酶蛋白穀氨醯胺酶的摻混比例為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.2 3.0 1的條 件。(10)蛋白質中的蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的適當添加量比的發現方法， 通過使轉穀氨醯胺酶和蛋白穀氨醯胺酶分別在同位素標記的銨鹽的存在下作用於該蛋白 質，將該蛋白質的穀氨醯胺殘基的官能團進行同位素標記，測定其NMR信號強度來進 行。發明效果依據本發明，可以提供與單獨使用TG或PG的任一種酶的情況不同的蛋白質的 改性效果，即TG和PG的合用效果，具體而言，可對受食品所含蛋白質影響的該食品的 性質進行改性，其結果是能夠得到改善含有蛋白質食品的口感(硬度、順滑性等)的效 果、能夠提供蛋白質的新型改質方法。此外，能夠提供含有使用這樣的改性方法而得到 的具有新型特徵的蛋白質的食品。此外，還能提供簡便地發現在蛋白質中使TG及PG兩 種酶共同對底物發揮作用而得到前述效果那樣的合適的條件(添加條件)的方法。附圖簡述[圖IfNH4Cl存在下的α-乳清蛋白的NMR中的1HJ5N HSQC譜。(實驗例 1)發明的實施方式本發明使用的TG，廣泛應用於明膠、奶酪、酸奶、豆腐、魚餅、火腿、香腸、 面類等食品的製造和食用肉的肉質改善中(日本特開昭64-27471號公報 )。 此外，也是用於熱穩定的微膠囊的素材、固定化酶的載體的製造等、應用於產業上種種 的目的中的酶。TG催化蛋白質分子中的肽鏈內的穀氨醯胺殘基的Y-羧醯胺基的醯基轉 移反應。若TG使蛋白質分子中的賴氨酸殘基的氨基作為醯基受體而發揮作用，在 蛋白質分子中及分子間形成ε-(Y-穀氨酸)_賴氨酸鍵。需要說明的是，參考文獻1的 記載內容作為引用含在本說明書中。作為TG，有鈣非依賴性的和鈣依賴性的，均可使用於本發明中。作為前者的 實例，可列舉放線菌、枯草菌等微生物來源的(例如，參考日本特開昭64-27471號公 報)。作為後者的實例，可列舉豚鼠肝臟來源的(例如，參考日本特公平 1-50382號公報 )，人表皮角蛋白細胞TG (Phillips，M.A.等.(1990) Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，9333 )，人凝血因子 XIII(Ichinose，Α.等.(1990) Biochemistry 25，6900.)，卵菌等微生物來源的，牛血液、豬血液等動物來 源的，鮭魚、真鯛等魚來源的(例如、關信夫等、「日本水產學會志56卷125 132頁、 1990年)，牡蠣來 源的等。除此之外，可列舉通過基因重組而生產的(例如， 參考日本特開平1-300889號公報 、日本特開平6-225775號公報 、日本特開平7-23737號公報 。)等。本發明可使用任意一種，對 其來源及製法並無限定。此外，存在因為同位素標記蛋白質的性質而在含鈣的溶劑中的 酶反應不佳的情況，故對於這類蛋白質優選使用鈣非依賴性的TG。例如，上述微生物 來源的(MTG)(例如，參考日本特開昭64-27471號公報 。)等也可以滿 足此條件，可以認為是在現階段最適合的。例如，灰橙輪絲鏈輪絲菌(Streptoverticilliumgriseocameum) IFO 12776、肉桂鏈輪絲菌肉桂亞禾中(Streptoverticillium cinnamoneumsub sp.cinnamoneum) IFO 12852,茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraense)IFO I38I9 等來 源的。以下有時將茂原輪枝鏈黴菌來源的轉穀氨醯胺酶稱為MTG。需要說明的是，上 述參考文獻2 10的記載內容作為引用含在本說明書中。
本發明中使用的TG的活性單位依如下測定並進行定義。即，以苄氧羰基-L-谷 氨醯甘氨酸(Z-Gln-Gly)和羥胺作為底物進行反應，生成的氧肟酸在三氯乙酸存在的情 況下轉換成鐵絡合物後，在525nm的吸光度下測定其量。用這樣生成的氧肟酸的量作成 校正曲線，將1分鐘內生成1 μ摩爾的氧肟酸鹽的酶量定義為，1單位活性單位。此測 定方法的細節如已有的報告中所述(例如，參考日本特開昭64-27471號公報 等。)。需要說明的是，參考文獻11的記載內容作為引用含在本說明書中。本發明中使用的PG具有直接作用於蛋白質的醯胺基、不伴隨切斷肽鍵及交聯蛋 白質而脫醯胺的作用。只要具有該作用即可，對其種類並無限定。作為這樣的酶的實 例有專利文獻1或專利文獻2中公開的酶，但並不特別限定於此。PG可使用產生PG的 微生物的培養液進行配製。PG配製中使用的微生物並無特別限定，但可示例如金黃杆 菌(Chryseobacterium)屬、黃桿菌(Flavobacterium)屬、1 急桿菌(Empedobacter)屬的微生 物。至於從微生物的培養液中配製PG的方法，可使用公知的蛋白質分離、精製方法 (離心分離、UF濃縮、鹽析、使用離子交換樹脂等的各種色譜法等)。例如離心分離培養 液以除去菌體，隨後組合鹽析、色譜法等可獲得目的酶。在從菌體內回收酶的情況下， 可例如將菌體通過加壓處理、超聲波處理等破碎後，和上述同樣地進行分離、精製而獲 得目的酶。而且，也可以通過過濾、離心處理等事先從培養液中回收菌體後，進行上述 一系列的工序(菌體的破碎、分離、精製)。還可以通過冷凍乾燥、減壓乾燥等乾燥法而 使酶粉末化，此時也可使用合適的賦形劑、乾燥輔劑。本發明的PG的活性單位使用對專利文獻1記載的方法進行改良的方法，即，用 下述方法進行測定。(1)在含有30mM Z-Gln-Gly的176mM的磷酸緩衝液(pH6.5) 100 μ 1中添加含有 PG的水溶液ΙΟμΙ，在37 °C下溫育10分鐘後，加入12% TCA溶液100 μ 1以停止反應。 此時，使用20mM磷酸緩衝液(ρΗ6.0)進行適當稀釋，以使酶濃度為0.05mg/ml。(2)離心分離(12000rpm、4°C、5分鐘)後，使用F_kit氨(Roche生產)對上清 進行NH3的定量。此方法如下所述。(3)在試藥II液(F-kit附件)100 μ 1中添加上清10 μ 1和0.1Μ三乙醇胺緩衝液 (ρΗ8.0) 190 μ 1，在室溫下放置5分鐘後，取100 μ 1測定340nm處的吸光度(El)。在剩 餘的200 μ 1中加入1.0 μ 1的試藥III (穀氨酸脫氫酶)後，於室溫下再放置20分鐘後，測 定剩餘的200 μ 1在340nm的吸光度(E2)。使用附於F_kit的氨標準液製成表示氨濃度和 吸光度(340nm)的變化量的關係的校正曲線，通過此校正曲線求出反應液中的氨濃度。(4)蛋白質濃度的測定使用蛋白質分析CBB(考馬斯亮藍)溶液(Nacalai Tesque),在檢測波長595nm下進行測定。作為標準，使用BSA(Pierce會社生產)。(5)PG的活性用下式進行計算。反應液中氨濃度C mo//w/) χ反應液量(m/) χ酶稀釋率 比活性(U/mg)= ；---^^-
酶量(m/) χ蛋白質濃度(mg/ml) χ反應時間(min)在本發明中，有關PG和TG添加於需改性的蛋白質中的時間，PG添加到蛋白 質中的時間和TG添加到蛋白質中的時間大致相同，或者在TG作用於該蛋白質之前。因 此，專利文獻1中記載的將TG反應通過添加PG來停止的方法為PG添加至蛋白質中的 時間為TG作用於該蛋白質之後，故並不包含於本發明中。需要說明的是，PG添加到蛋 白質中的時間和TG添加到蛋白質中的時間大致相同，意味著在一系列原料投與的工序中 投與PG和TG。即，在商業規模的生產中，以在投與原料A後，依次投與原料B、原料 C...的方式來進行，一般是多個原料事先不混合而依次投與，但在一系列原料投與的工序 中，只要是投與PG和TG，就包含在本發明的「蛋白穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的時間 和轉穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的時間大致相同」中。當然，事先混合含有PG、TG的 多種原料而進行添加的情況，也包含在本發明的「大致同時」中。使PG、TG發生反應的溫度一般為；TC 60°C，若保持在此溫度下，在約1分 鍾 約48小時程度下二者進行反應。但是，優選在5°C 50°C程度下進行約5分鐘 約 24小時的程度。在食品中添加PG、TG的方法是在含有作為底物的蛋白質的原料中僅添 WPG、TG,或是和其他的原料一起添加也可。PG和TG的添加量隨著改性蛋白質的種 類、最終製品和作為目的的效果而可自由地變化，但例如相對於食品原材料中每克蛋白 質重量，TG的添加量在標準上為0.1 100單位。另一方面，相對於食品原材料中每克 蛋白質重量，PG在標準上為0.01 120單位。需要說明的是，兩者的上述添加量只是 標準，只要是發揮本發明所期待的效果即可，並不一定限制於此。在本發明中，作用於蛋白質的PG和TG的比例很重要。在對蛋白質添加PG的時 間與添加TG的時間大致相同或是在TG作用於該蛋白質之前的情況下，以活性比計，在 蛋白質中添加蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的添加量為PG TG = 0.05 3 1、優選 PG TG = 0.05 2 1，PG、TG均作用於蛋白質，故可以改性蛋白質。或者以重量 比計，PG TG = 0.01 0.7 1，優選 PG TG = 0.01 0.4 1，更優選 PG TG =0.01 0.3 1，PG、TG均作用於蛋白質，故可以改性蛋白質。在PG的比例大於上 述比例的情況下，PG的作用與TG相比過於有效而不能發揮合用的效果，此外，在小於 上述比例的情況下，相反地由於PG的作用過弱而無法期待合用效果。此外，以NMR信號強度比計，對蛋白質添加蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的 添加量為PG TG = 0.2 3.0 1，優選0.2 2.3 1，如在此條件下，則不管PG、 TG的添加時間，由於PG、TG均作用於蛋白質，故可以改性蛋白質。在PG的比例比上 述比例大的情況下，PG的作用與TG相比過於有效而不能發揮合用的效果，此外，在小 於上述比例的情況下，相反地由於PG的作用過弱而無法期待合用效果。本發明的NMR信號強度比如下算出TG或PG在同位素標記銨鹽(15N或是14N) 的存在下作用於底物蛋白質，在對該蛋白質的穀氨醯胺殘基進行同位素標記之後，測定 標記了的蛋白質的NMR譜，通過NMR信號強度算出。對NMR的測定法並無特別限定， 但可以採用例如在檢測15N標記了的穀氨醯胺殘基的情況下，可以測定1H和15N的相關 譜，例如可以採用測定HSQC譜。在可得到2個以上的信號的情況下，算出各信號強度的總和作為信號強度來計算。也就是說，NMR信號強度比用「使PG作用的情況下的信 號強度的和」 + 「使TG作用的情況下的信號強度的和」來表示。作為標記化合物，可 以為銨鹽，也可廣泛列舉為氯化銨、硫酸銨等。若為15N標記，則使用氮為15N的銨鹽即 可，若為14N標記，則使用氮為14N的銨鹽即可。標記方法為，在水性溶劑中約pH3.0 約pH9.0的範圍、優選約pH4.0 約pH8.0的範圍內，在溫度為約4°C 約65°C的範圍、 更優選約25°C 約60°C的範圍內，可保持需標記蛋白質及銨鹽即可。反應時間並無特別 限定，為約30秒 一周，更優選約1分鐘 約1日。在此反應中，相對於需標記蛋白質 的濃度，銨鹽濃度為約10倍以上，優選約200倍以上較好，更優選需標記蛋白質的濃度 為約IyM 約40mM的範圍，銨鹽的濃度為約10 μ M 約IOM的範圍。需要說明的 是，α-乳球蛋白、酪蛋白、大豆球蛋白、肌球蛋白、肌動球蛋白等食品中含有的蛋白質 可以進行同位素標記，故本發明的NMR信號強度比可以測定所有含蛋白質的食品。以下顯示了通過TG或PG的作用，而使蛋白質和同位素標記的氯化銨進行反應 的實例。在將α -乳清蛋白(α -lactalbumin,以下簡稱α -La)作為底物使用的情況下， 配製底物溶液(10mg/ml α-La、200mM15NH4Cl、5 % D20/20mM Tris-HCl (pH7.0)),添 加TG或PG以使底物-酶比為1000 1以後，在37°C下溫育26.5小時。溫育後的溶液 轉移至NMR樣品管中，使用Braker會社生產的Avance600等，進行1H-15N HSQC檢測。 羧醯胺的氮若使用15N標記，由於在15N上結合了 2個1H，故對於1個15N的化學位移能 成對地觀測到2個信號。算出「PG作用情況下的信號強度的和」 + 「TG作用情況下 的信號強度的和」，以此作為NMR信號強度比。
本發明的蛋白質並無特別限定。可列舉為乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麥 谷蛋白、肌肉蛋白質、血漿、膠原、明膠等。此外，還可為將這些蛋白質2種以上進行 混和得到的物質。作為符合本發明的食品，只要含有對上述蛋白質合用PG、TG而進行 改性的蛋白質即可，不論原料的種類和加工狀態。包含例如經殺菌的狀態，經脫脂的狀 態，經稀釋的狀態、經濃縮的狀態、經乾燥的狀態、除此以外，也包括經過各種各樣的 加工的狀態。隨後，對本發明的酶製劑進行說明。本發明的蛋白質改性用酶製劑只要為以下 條件的製劑即可以活性比計，，作為必須構成成分的轉穀氨醯胺酶、蛋白穀氨醯胺酶 的摻混比例為PG TG = 0.05 3 1、優選PG TG = 0.05 2 1，或以重量比 計，摻混比例為PG TG = 0.01 0.7 1、優選PG TG = 0.01 0.4 1、更優選 PG TG = 0.01 0.3 1，或以NMR信號強度比計，PG TG = 0.2 3.0 1、優選 PG TG = 0.2 2.3 1，除PG、TG之外，還可摻混在此領域中經常使用的乳糖、蔗 糖、麥芽糖醇、山梨醇、糊精、支鏈糊精、環糊精、澱粉類、多糖類、膠類、果膠等種 種任意成分。此外，還可以含有動物性蛋白質和大豆蛋白質、小麥蛋白質等植物性蛋白 質。此外，也可根據需要在在本酶製劑中摻混碳酸氫鈉、枸櫞酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、 氯化鉀等生理學上允許的無機鹽類。此外，還可以適當摻混調味料、砂糖、香料、色 素、發色劑(color coupler發色剤)、抗壞血酸、其鹽類等的有機鹽類、乳化劑、油脂等。本發明包括簡便地發現蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的適當添加量比的方 法。即，如上所述，使PG和TG在同位素標記的銨鹽的存在下分別作用於蛋白質，用同 位素標記該蛋白質的穀氨醯胺殘基的官能團、測定其NMR信號強度，發現在NMR信號強度比中，通過使蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.2 3.0 1、優選0.2 2.3 1 的條件，能確定PG和TG的適當添加量比。PG和TG的NMR信號強度比的上述適當 範圍，和底物蛋白質的種 類無關，蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.2 3.0 1，優 選0.2 2.3 1，NMR信號強度比和各底物蛋白質中的PG和TG的適當添加量比(活 性比、重量比)之間存在相關，故無需重複多次試驗來對PG和TG的適當添加量比(活 性比、重量比)進行試錯，能夠簡單的發現適當的添加量比。以下的實施例為列舉實施例來對本發明進行詳細的說明，但本發明並不限於這 些實施例。實驗例1將α -乳清蛋白(α -Iactalbumin,以下簡稱α -La) (Sigma生產)作為底物使用。 配製底物溶液(10mg/ml α-La、200mM 15NH4CL 5 % D20/20mM Tris-HCl(pH7.0)), 添加TG(來自味之素「Activa」 TG的酶精製品)或PG(專利文獻1記載的金黃桿菌 (Chryseobacterium)屬來源的)以使底物-酶比為1000 1，然後於37°C下溫育26.5小 時。溫育後的溶液移至NMR樣品管中，使用NMRCBraker會社生產Avance600)，進行 1H-15N HSQC測定。26.5小時後進行1H-15N HSQC測定的結果如

圖1所示。羧醯胺氮 使用15N標記後，由於在15N上結合了 2個1H，故對於1個15N的化學位移能成對地觀測 到2個信號。通過圖1，可以確定α -La中存在的穀氨醯胺殘基的羧醯胺氮中的一部分 為15N所標記，通過PG成功地顯示了 15N標記。這樣，使用本方法，和TG—樣，顯示 PG不僅使脫醯胺反應進行，也可使氯化銨和穀氨醯胺殘基反應。需要說明的是，NMR 信號強度為圖1的橢圓形的點的區域面積的總和，此區域面積越大表示反應量越多。實施例1在市售牛奶、0.2Μ 15NH4CL 5 % D2O中分別單獨添加實驗例1中記載的TG 或PG，算出各添加濃度中的信號強度。添加TG以使底物/酶比(S/E比)為重量比 7400/1。另一方面，添加PG至以重量比計為TG的0.002 5倍。所使用的TG的比活 性為每Img酶蛋白質為26單位，PG的比活性為每Img酶蛋白質為120單位。添加酶後 的溶液於37°C下溫育3小時後，移至NMR樣品管中，使用實驗例1記載的NMR，進行 1H-15N HSQC測定。以TG添加量為基準，與此對應的PG添加量分別用酶重量比(PG/ TG)及活性比(PG/TG)表示。求得的對應於各比的PG/TG信號強度比的結果如表1所示。[表1]酶重量比活性比I信號強度I信號強度比
pG(PG/TG)(PG/TG)(PG/TG)
2.5"g ---92J-
-12.5^g5234745
-2.5"g ml332
-0.5"g02092147L58
-0.25"gOl0.469 5
-0.025//gΟΟ 0.0462010.216使用市售牛奶配製酸奶。將市售牛奶400g加溫至50°C，以表2中記載的量添 加實驗例1記載的TG、PG0所使用的TG的比活性為每Img酶蛋白質為26單位，PG 的比活性為120單位。在50°C下進行90分鐘的酶反應後，在沸騰浴中一邊混合一邊加 熱。一達到90°C立即置於冰水中，冷卻至45°C。添加20g(相對於原料為5% )的發酵 劑(明志乳業(株式會社)保加利亞酸奶)，充分混合後分別注入試飲杯中，每杯40g。使用鋁箔紙覆蓋，於38°C下降低pH至4.5，使其發酵約3 4小時。在低溫 (4°C)下保存，翌日進行物性評價和感官評價。至於物性，使用質地分析儀(Texture Analyzer英弘精機生產)測定破斷應力。使 用IOmm直徑的圓柱形柱塞，設定破斷速度為6Cm/min(lmm/秒)。其結果如表3所示。和對照品相比，僅添加TG的比較品T的破斷應力顯著增 力口。這是TG引起乳蛋白交聯的結果。有關本發明品1 4，其破斷應力仍大於對照品， 並未損害TG引起的增加破斷應力的效果。然而，比較品T-P的破斷應力和比較品P相 比則基本無變化，故能確認TG反應因PG的加入而基本停止，TG的效果基本並未體現。[表2]
mTG ~PG酵重量比酶活性比 信號強度比 (mg) (mg) (PG/TG) (PG/TG) (PG/TG) 對照品---
本發明品 1 TG5PG ΠΓ0.0115 OOl0.0460.216
本發明品 2TG5PG Λ5 0.023 0020.092未測定
本發明品 3TG5PG Λ50.115 θ7\0461
本發明品 4TG,PG ΓΤ5 02302092L58
比較品 T TG ΓΤ5 -:::
比較品 P PG- Γ 5---
比較品 T-P~~TG5PG ΓΤ5 Γ 5146^32[表3]
權利要求
1.蛋白質的改性方法，其通過使蛋白穀氨醯胺酶及轉穀氨醯胺酶作用於蛋白質而使 蛋白質改性，其中，蛋白穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的時間和轉穀氨醯胺酶添加到蛋白 質中的時間大致相同或者在轉穀氨醯胺酶作用於該蛋白質之前。
2.權利要求1的方法，其中，以活性比計，添加至蛋白質中的蛋白穀氨醯胺酶和轉谷 氨醯胺酶的添加量為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.05 3 1。
3.權利要求1或2的方法，其中，以重量比計，添加至蛋白質中的蛋白穀氨醯胺酶和 轉穀氨醯胺酶的添加量為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.01 0.7 1。
4.權利要求1至3中任一項的改性方法，其中，以NMR信號強度比計，是添加至蛋 白質中的蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的添加量為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶= 0.2 3.0 1的條件。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中，蛋白質為選自乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋 白、小麥谷蛋白、血漿、肌肉蛋白質、膠原及明膠的1種或2種以上的蛋白質。
6.食品，其含有使用權利要求1至5中任一項的方法改性過的蛋白質。
7.蛋白質改性用酶製劑，其中，以活性比計，轉穀氨醯胺酶蛋白穀氨醯胺酶的摻 混比例為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.05 3 1。
8.蛋白質改性用酶製劑，其中，以重量比計，轉穀氨醯胺酶蛋白穀氨醯胺酶的摻 混比例為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.01 0.7 1。
9.蛋白質改性用酶製劑，其特徵在於，以NMR信號強度比計，是轉穀氨醯胺酶蛋 白穀氨醯胺酶的摻混比例為蛋白穀氨醯胺酶轉穀氨醯胺酶=0.2 3.0 1的條件。
10.蛋白質中的蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的適當添加量比的發現方法，通過使 轉穀氨醯胺酶和蛋白穀氨醯胺酶分別在同位素標記的銨鹽的存在下作用於該蛋白質，將 該蛋白質的穀氨醯胺殘基的官能團進行同位素標記，測定其NMR信號強度來進行。
全文摘要
本發明提供使蛋白穀氨醯胺酶及轉穀氨醯胺酶兩者作用於蛋白質而使蛋白質改性的方法，提供含有經這兩種酶改性的蛋白質的食品，提供含有兩酶的蛋白質改性用酶製劑，提供簡便地發現以適當添加量比將蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的方法。蛋白穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的時間和轉穀氨醯胺酶添加到蛋白質中的時間大致相同，或者在轉穀氨醯胺酶作用於蛋白質之前，或者，通過使作用於蛋白質的蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的添加比例為規定的比例而使蛋白質改性。通過使用同位素標記銨鹽標記的蛋白質的NMR信號強度等發現蛋白穀氨醯胺酶和轉穀氨醯胺酶的適當添加量比。
文檔編號C12Q1/48GK102016057SQ200980110108
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月12日 優先權日2008年3月14日
發明者三輪典子, 中村美奈, 中越裕行, 佐藤弘明, 廣瀨文之, 榛葉信久, 橫山敬一, 鈴木榮一郎 申請人:味之素株式會社, 天野酶株式會社