一種檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因的納米生物傳感器的製作方法

2023-05-21 15:18:46

專利名稱：一種檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因的納米生物傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因的納米生物傳 感器。
背景技術：
急性早幼粒細胞白血病(APL)是急性髓細胞白血病(AML)FAB分型中的M3亞型，是 嚴重危害人類健康的惡性血液病之一。它起病急，迅速惡化，表現十分兇險，出血傾向明顯， 易發生瀰漫性血管內凝血，死亡率高，治療比較困難。白血病早期診斷(基因診斷)水平將 直接影響患者的治療效果及生存質量，其重要意義不言而喻。 目前APL的臨床診斷方法主要包括染色體分析、Southern-Blot、RT-PCR及FISH等 技術，但這些方法均存在一定的局限性染色體分析費時費力、靈敏度低；Southern-Blot 雖特異性強，但對低拷貝基因序列的檢測極不靈敏，不僅方法複雜、檢測周期長、價格昂貴， 而且有放射性汙染，限制了臨床上的廣泛應用；RT-PCR操作繁瑣、價格昂貴；FISH需要使用 複雜的螢光顯色系統，且相對靈敏度不高，臨床大規模應用難以開展。因此，研究開發一種 簡便、快速、準確、靈敏、經濟的APL基因診斷技術具有極其廣闊的應用前景。
APL最為常見的染色體易位為t(15 ;17)，其易位產物PML/RARa融合基因發生於 95 %的APL中，是惡性克隆的標誌基因。 下面所述的為本發明人率先將電化學酶聯免疫法應用於快速檢測PML/RARa融 合基因採用Au納米材料構築納米修飾電極，在利用自組裝膜法將巰基修飾捕獲探針固定 在金納米修飾電極表面，對電極表面未結合的位點通過封閉劑進行封閉；利用長鏈目標鏈 的一端與5'端標記有生物素(biotin)的信號探針互補，長鏈目標鏈的另一端與捕獲探 針通過鹼基配對結合實現共雜交，將雙鏈DNA(dsDNA)片段固定化；通過辣根過氧化物酶 (HRP)上的親和素(avidin)，根據親和素與生物素之間的親和作用，將酶結合上去，利用酶 的信號放大作用，在底物3，3' ，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)中研究雜交前後電信號的差 異，對探針的特異性及靈敏度進行測試。由於類似三明治結構的設計以及酶的催化功能，極 大地增強了檢測的特異性及靈敏度，從而建立了高靈敏度、高特異性的急性早幼粒細胞白 血病基因檢測方法，應用於有效解決急性早幼粒細胞白血病早期診斷這一臨床迫切的實際 問題，無疑具有極其重要的意義。

發明內容
本發明實施例所要解決的技術問題在於提供一種檢測急性早幼粒細胞白血病 PMI/RARa融合基因的納米生物傳感器，旨在解決現有檢測方法靈敏度低、檢測周期長、價
格昂貴等。 本發明實施例是這樣實現的，一種檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基 因的納米生物傳感器，待檢測PML/RARa融合基因為L型、V型或S型，包括如下步驟
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(1)從NCBI基因資料庫中查找L型、V型及S型PML/RARa融合基因的融合位點， 選擇位點前後的鹼基作為人工合成的探針使用，探針長度為20 25鹼基，經過同源比對， 將對應序列作為APL的特異性序列進行合成。 (2)採用Au納米材料構築納米修飾電極，在利用自組裝膜法固定捕獲探針，根據 帶巰基(-SH)的捕獲探針在金電極表面可以形成自組裝單分子膜的特性來固定，對金電 極表面未結合的位點通過封閉劑進行封閉，如巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白 等. (3)使長鏈目標鏈的一端與5'端標記有生物素(biotin)的信號探針雜交，然後 利用長鏈目標鏈的另一端與捕獲探針通過鹼基配對結合實現共雜交，將雙鏈DNA(dsDNA) 片段固定化； (4)通過辣根過氧化物酶(HRP)上的親和素(avidin)，根據親和素與生物素之間 的親和作用，將酶結合上去，利用酶的信號放大作用，在底物3，3' ，5，5'-四甲基聯苯胺 (TMB)中研究雜交前後電信號的差異。 與現有技術相比，上述技術方案採用酶法，其中的辣根過氧化物酶具有信號放大 的功能，增強檢測的靈敏度，另外設計的三明治結構相對穩定，有效地減少非特異性吸附， 從而提高雜交檢測的特異性。由於該技術的檢測周期相對較短，為臨床上快速診斷提供可


圖1為本發明的檢測PML/RARa融合基因的納米生物傳感器原理圖。
圖2為本發明的檢測PML/RAR a融合基因的不同目標序列檢測圖。
圖3為本發明的檢測PML/RAR a融合基因的電信號檢測圖。 圖3中TMB在不同目標序列中i-t曲線及對應的直方圖a為APL的PML/ RARa DNA探針，b為1. 0X 10—12M完全錯配基因序列，c為單鹼基錯配基因序列，d為互補基 因序列。 圖3中雜交鏈不同濃度電化學信號a、b、c、d、e比較。
具體實施例方式
為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋 本發明，並不用於限定本發明。 本發明實施例提供的檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因的方法，待 檢測PML/RAR a融合基因為L型、V型或S型，包括如下步驟 (1)PML/RARa融合基因在17號染色體上的斷裂點固定於RARa基因的第二號內 含子內，而在15號染色體上存在三個斷裂點叢集區(breakpoint cluster region, BCR)， 稱為bcrl、bcr2和bcr3，分別位於PML基因的第六號內含子、第六號外顯子和第三號內含 子。由於PML基因斷裂點的部位不同形成三種不同的融合轉錄本(圖6):第一種類型，大約 70X的患者是bcrl或長型轉錄本，由PML基因的第六號外顯子(P6)與RARa基因的第三 號外顯子(R3)形成融合基因。第二種類型，約20X的患者為bcr3或短型本，由PML基因的第三號外顯子(P3)與RARa基因的第三號外顯子(R3)形成融合基因。第三種類型，10% 左右的患者為bcr2或變異轉錄本，由斷裂的PML基因的第六號外顯子(P6)與RARa基因 的第三號外顯子(R3)形成融合基因，並且插入一些來源不明的短片段。從NCBI基因數據 庫中查找L型、V型及S型PML/RARa融合基因的融合位點，選擇位點前後的鹼基作為人工 合成的探針使用，探針長度為20 25鹼基，經過同源比對，將對應序列作為APL的特異性 序列進行合成。以L型融合基因為例，信號探針基因採用5' -GGT CTC AAT GGC TGC CTC CCC G-3'。 (2)採用Au納米材料構築納米修飾電極(圖l)，在利用自組裝膜法固定 1X10—6mol/L捕獲探針，根據帶巰基(-SH)的捕獲探針在金電極表面可以形成自組裝單分 子膜的特性來固定，對金電極表面未結合的位點通過封團劑進行封閉，如1X10—5mol/L巰 基己醇，1X10—5!1101/1巰基乙酸，0.5%牛血清白蛋白，0.5%酪蛋白等。封閉後，需採用洗滌 劑洗滌除去非特異性吸附，如0. 2mol/LpH 7. 4PBS、0. 2% SDS等。 (3)根據長鏈目標鏈的一端與5'端標記有生物素(biotin)的1X10—6mol/Ulf 號探針雜交，而長鏈目標鏈的另一端與1 X 10—6mol/L捕獲探針通過鹼基配對結合實現共雜 交，將雙鏈DNA(dsDNA)片段固定化；在酶加入前也需要對未結合的位點通過封閉劑進行封 閉，如巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等，另外再採用洗滌劑洗滌除去非特異性 吸附，如PBS、0. 2% SDS等。 (4)通過辣根過氧化物酶(HRP)上的親和素(avidin)，根據親和素與生物素之間 的親和作用，將酶(l : 1000)結合上去，酶作用後，需採用洗滌劑洗滌除去非特異性吸附， 如0. 5%Tween 20，0. 2mol/L pH 7. 4PBS、0. 2% SDS等。主要利用酶的信號放大作用，在底 物3，3' ，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)中採用安培電流時間曲線法研究雜交前後電信號的 差異(圖1、圖2、圖3)。 本發明檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因的納米生物傳感器具有 高靈敏度，高特異性的特點，且相對其它的檢測方法成本低。本發明適應於急性早幼粒細 胞白血病基因型與腫瘤相關性的研究，白血病發生和發展的檢測。 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。 權利要求
利用納米生物傳感器檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因。
2. —種檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因的納米生物傳感器，待檢測基 因為急性早幼粒細胞白血病(APL)的PML/RARa融合基因，95 %的APL病人為t (15 ;17) (q22 ;q21)，包括不不同類型納米材料在不同類型材料電極表面組裝構築納米修飾電極； 以L型融合基因設計捕獲探針和信號探針；利用電化學酶聯免疫方法，進行急性早幼粒細 胞白血病PML/RARa融合基因測定。其特徵在於採用納米技術、化學鍵合技術、分子雜交 技術、電化學酶聯免疫技術相結合製作電化學DNA生物傳感器，該傳感器包含與待測DNA互 補的修飾核酸探針，通過與目標互補DNA進行雜交，再利用電化學分析方法檢測酶催化底 物產生電信號，從而實現對急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因的測定。
3. 如權利要求l和2所述檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因的納米生物 傳感器，其特徵在於，所述的納米生物傳感器為不同類型納米材料(Au納米粒子、碳納米管 等)在不同類型材料電極((金、玻碳、碳糊電極等)表面組裝構築納米修飾電極。
4. 如權利要求1、2和3所述檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RAR融合基因的納米生 物傳感器，其特徵在於，所述的待檢測APL的PML/RAR融合基因型別，以L型融合基因為例， 捕獲探針基因採用5' -GGTTGCTGTTGG GCAGGAAGAC-3'，信號探針基因採用5' -GGT CTC AAT GGC TGC CTC CCC G-3'。
5. 權利要求1和2所述的酶聯免疫法，依序包括如下步驟(1)利用Au納米粒子組裝 技術(電化學沉積、共價鍵合等)，在電極表面組裝Au納米粒子。採用自組裝膜法固定捕 獲探針，根據帶巰基(-SH)的捕獲探針在Au納米粒子修飾電極表面可以形成自組裝單分子 膜的特性來固定，對Au納米粒子修飾電極表面未結合的位點通過封閉劑進行封閉，如巰基 己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等；(2)使長鏈目標鏈的一端與5'端標記有生物素 (biotin)的信號探針雜交，然後利用長鏈目標鏈的另一端與捕獲探針通過鹼基配對結合 實現共雜交，將雙鏈DNA(dsDNA)片段固定化；(3)通過辣根過氧化物酶(HRP)上的親和素 (avidin)，根據親和素與生物素之間的親和作用，將酶結合上去，利用酶的信號放大作用， 在底物3，3' ，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)中研究雜交前後電信號的差異。
6. 根據權利要求5所述的酶法，其特徵在於探針DNA加入後、探針DNA與靶DNA雜交後 需採用洗滌劑洗滌除去非特異性吸附，如PBS、0. 2% SDS等。
7. 如權利要求5所述的酶法，其特徵在於採用該法對探針的特異性及靈敏度進行測 試，實現對急性早幼粒細胞白血病PML/RAR a融合基因的檢測。
全文摘要
本發明提供了一種檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因的電化學DNA生物傳感器，待檢測基因為急性早幼粒細胞白血病(APL)的PML/RARα融合基因，包括如下步驟(1)根據所選擇的待檢測APL基因型別通用引物序列的融合位點，對APL的特異性序列進行設計及合成；(2)採用Au納米材料構築納米修飾電極，在利用電化學酶聯免疫技術構建了納米電化學DNA生物傳感器用於檢測APL的PML/RARα融合基因。該法極大地增強了靈敏度，實現了對急性早幼粒細胞白血病的早期診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101705279SQ200910112089
公開日2010年5月12日 申請日期2009年6月29日 優先權日2009年6月29日
發明者劉愛林, 林新華, 陳偉, 陳敬華, 魏娜 申請人:林新華;劉愛林;陳敬華;魏娜;陳偉