一種在體基因轉導裝置的製作方法

2023-05-22 06:33:36 1

專利名稱：一種在體基因轉導裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種臨床醫學研究的實驗用儀器，特別是一種在體基因轉導 裝置，該裝置可對提供高效、安全的基因轉導，為進一步基因治療提供新的 方法和工具。
背景技術：
基因治療的效果緊密依賴於是否能將轉導基因安全、有效地輸送到靶器 官組織中。在基因載體中，有病毒載體和非病毒載體。其中病毒載體在攜 帶病毒進入細胞，並導致細胞感染毒性的過程中起著重要作用。然而，最近
有報導稱，AAV載體的血友病可以通過反作用的免疫反應而阻斷病毒載體進 入細胞(1， 2)。另外，病毒載體和宿主基因組的結合，可能會使病毒插入 染色體，引起嚴重後果。據報導有3個患有重度聯合免疫缺陷(SCID)的 兒童參加了法國基因治療實驗，實驗採用的逆病毒載體治療方法引起了白血 病，從而導致其中2個兒童死亡。究其原因，是因為病毒插入了患者的11 號染色體(3， 4)。因此，發明一套沒有病毒載體和人工合成載體的基因輸 送體系將大大有利於人類。
裸pDNA被認為是一種最簡單和最安全的基因轉導系統(5)。它由於沒 有外源蛋白質，不會刺激獲得性免疫系統(9)，因而比病毒載體具有更多的 優點。同時，骨骼肌可被用做裸pDNA轉導的主要耙器官。注射了脂質體DNA 的肌肉會出現長期的蛋白質反應(8)，這就使肌肉猶如一所能分泌治療蛋白 質的加工廠(10)。目前，由脂質體DNA結合來自於病原體、過敏原和腫瘤 蛋白的DNA疫苗已經完成了臨床第一、第二階段的實驗(6， 7)。然而，轉 導到肌肉的裸脂質體DNA的最大缺點是它的轉導效率太低。
最近，通過電極途徑在體內進行基因轉導己經成為熱門課題，特別是電 基因轉導到骨骼肌的方法。這是因為1)骨骼肌組織中沒有細胞替代，所 以在有絲分裂後不出現基因快速丟失(12)，而且轉導基因可以存在較長時 間；2)骨骼肌含有豐富的血供，為分泌蛋白質進入血液循環提供了良好的
轉運條件。電基因轉導相比裸DNA注射轉導的優點在於其個體內部變異較小 (]4)。另外，電轉導持續時間較長，可以用在不同物種的不同組織中，例 如用在靈長類動物組織中(14)。在老鼠實驗中，電基因轉導可用於調節人 類凝血因子IX， 2。/。人類凝血因子IX保持了正常狀態並持續數月時間(15， 16)。目前，通過電基因脈衝轉導藥物的臨床試驗已經廣泛開展(17)。
電基因轉導是一項應用電脈衝強化細胞外分子的技術操作，它破壞了血 漿細胞膜(18)，使得DNA、酶、抗體和其他大分子物質可以進入細胞膜。 最典型的是施加高達200-700V/cm的電流到肌肉組織(19)，從而達到高效 的基因轉導率。但這種方法會導致組織發生不可逆轉的損傷(19， 20)。據 研究調查報導，這種方法的損傷程度遠遠高於電流為100V/cm所造成的組織 損傷，甚至可直接導致細胞死亡(21)。

發明內容
本發明的目的在於，為臨床醫學研究實驗提供一種高效、安全在體基因 轉導裝置，進而為基因治療提供新方法和新工具。
為了實現上述任務，本發明採取如下技術解決方案 一種在體基因轉導裝置，其特徵在於，該裝置的硬體包括
1) 帶有雙注射器針管的雙針頭電極，用於a)給肌肉組織注射DNA; b)
給DNA所在之處的肌肉組織施加具有特定參數的激勵電場。
2) 激勵信號源，用以產生兩種激勵信號，正弦波脈衝信號和方波脈衝信 號。激勵信號的幅度可在10V-50V範圍內調整。脈衝寬度在10ms-1000ms 之內可調，脈衝間隔也在10-1000ms之內可調。 一次激發的脈衝數量在1-10個之內可調；
3) 微處理機，用以對刺激信號進行控制和調節，根據人為設定的特殊 刺激參數控制系統進行斬波操作，以產生符合參數設定要求的不同的刺激信
號
4) 鍵盤輸入與顯示模塊，輸入模塊用以實現刺激參數的設定，顯示模 塊用以指示當前設定的特殊的刺激參數。
微處理機內設有支持軟體，這些軟體包括
1) 支持產生高壓、脈寬可調的交流正弦波脈衝信號的斬波控制軟體；
2) 支持產生高壓、脈寬可調方波脈衝信號的斬波控制軟體；
3) 支持產生每次輸出脈衝數可調的控制軟體；
4) 鍵盤管理模塊用於對實驗參數進行設定、査詢、修改和刪除；
5) 顯示器管理模塊用於監視設定的參數和出錯報警。 軟體由以下模塊構成
1) 定時模塊，實現以10ms為單位的軟體定時功能；
2) 顯示模塊，實現設定好的特殊參數的顯示功能；
3) 參數設置模塊，根據系統檢測到的鍵盤按鍵的狀態變化來改變產生 的刺激信號的參數；
4) 波形輸出模塊，用以在設置好刺激信號的特殊參數後啟動刺激信號 的輸出；
5) 中斷服務模塊，使用51單片機的外部中斷0，當發生中斷時系統自 動調用此模塊進行中斷處理。
本發明的裝置具有下列技術特點-
1.這種注射器電極可以將激勵電場直接施加到DNA所在之處。因此， 在保持與普通電極具有同等轉導效率，甚至高於10倍的轉導效率的情況下， 注射器電極可大大降低施加在組織層上的激勵電場。如施加到肌肉組織層
上舗勵電場強度可妖200-70&V/cm降低到20-50V/cm，從而大大減少了肌 肉組織的損傷。
2. 高效、安全的在體基因轉導裝置含有正弦波脈衝和方波脈衝兩種電 場激勵源。施加的脈衝個數、脈衝寬度、脈衝間隔均可根據實驗需要調整。
3. 高效、安全的在體基因轉導裝置巧妙地利用了調壓斬波技術，直接 將電網電壓或外置高壓通過開關器件，進行斬波輸出，從而降低了裝置對高 壓放大器件的要求，簡化了電路設計，縮小了裝置的體積。


圖1是本發明在體基因轉導裝置的硬體框圖2是本發明具體實現的雙針管注射器電極；
圖3是本發明高壓直流穩壓源模塊的電原理圖4是本發明正弦波交流電壓源模塊的電原理圖5是本發明具體實現微處理機控制斬波器的一種電原理圖6是本發明具體實現輸出接口的一種原理圖7是本發明具體實現鍵盤控制功能的一種原理圖8是本發明具體實現顯示模塊的一種電原理圖9是本發明在體基因轉導裝置的系統軟體框圖IO是本發明的軟體系統中主程序的流程圖11是本發明的軟體系統中定時模塊(a)和顯示模塊(b)的程序流 程圖12是本發明的軟體系統中波形輸出模塊的流程圖13是本發明軟體系統中的中斷服務模塊的流程圖14是在體基因轉導裝置軟體部分的整體的流程圖15為本發明具體實現的在體基因轉導裝置的一種輸出波形；
圖16為採用本發明裝置所做實驗的基因表達水平的比較；
圖17為採用本發明裝置所做基因電轉導後肌肉損傷程度情況 圖18為採用本發明裝置所做實驗的動態基因表達和基因轉導到其他組 織的情況。
以下結合附圖對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
1.在體基因轉導裝置的構成
本發明採用雙注射器針管的雙電極針頭給肌肉組織注射DNA，同時給 DNA所在之處的肌肉組織施加具有特定參數的激勵電場，從而實現了高效、 安全的在體基因轉導。本發明為基因藥物長效治療人類一些疑難疾病提供了 新方法和新工具。
該裝置針對普通電基因轉導方法及其普通電極需要對肌肉組織層上施 加高激勵場強(200-700V/cm)，會造成肌肉組織的損傷，甚至直接導致細胞 死亡，進而限制基因藥物在人類疑難疾病治療中應用的現狀，設計了一種用 於研究如何在保持與普通電基因轉導方法具有同等轉導效率，甚至高於其轉 導效率的情況下，降低施加到肌肉組織層上激勵電場強度、減少了肌肉組織 的損傷的有效方法及其工具。 1. 1系統的硬體構成
在體基因轉導裝置的硬體框圖見圖1，包括微處理機，微處理機上連接 顯示器和控制鍵盤；微處理機的輸出連接有斬波器，斬波器上連接有激勵信 號源，斬波器通過輸出接口連接雙針管注射器電極。 1. 1. 1雙針管注射器電極
雙針管注射器電極為並行放置的一對外徑為5皿注射器針管，每個針管 出口端接有一電極針頭。兩電極針頭的間距為5 8mm。兩針頭電極通過斬 波器的輸出接口分別與激勵信號發生器正負輸出端相連，以接收來自激勵信 號發生器的激勵脈衝信號(圖2)。
1.1.2高壓/佔空比均可調的激勵信號源
本裝置的激勵信號源有兩種，g卩(10 50)V電壓/脈寬佔空比均可調直 流電壓信號發生器和士 (10 50)V電壓/脈寬佔空比均可調的正弦波交流電 壓信號發生器。
1.1.2.1直流電壓信號發生器
為了儘量的簡化電路的設計，同時減小本發明的體積，增強安全性，直 流電壓信號發生器採用了 AC/DC模塊電源，而沒有採用變壓、整流、濾波等 一系列傳統的方法。採用現成的模塊電源的另一個優點是輸出信號的紋波很 小，提升了系統的性能。220V市電經過此模塊電源後輸出35V左右的直流 電壓，為了得到10-50V輸出電壓可調的直流穩壓信號，後級又採用了直流 可調式三端穩壓器。穩壓器參考端接一個12V左右的穩壓管，將參考電壓起 點提升到10V左右。通過調整接到參考端的一個電位器來調整參考端的參考 電壓，穩壓器輸出端的電壓即可實現連續可調。如果將來系統進行升級換代， 則可將參考端的參考電壓接到一個可編程電壓的設計方案。這樣，通過編程 可以對參考電壓進行實時調整，替代了原來系統的電位器，大大的擴展穩壓 器的輸出電壓範圍，使電壓調節更精確(圖3)。 1.1.2.2正弦波交流電壓信號發生器
裝置採用的是50HZ的交流市電輸入，以產生士(10 — 50)V電壓輸出幅 度可調的50Hz交流信號。首先將外界輸入的220V電壓進行降壓處理。為了 提高安全性，盡力的避免變壓器模塊對周圍電路產生的電磁輻射影響，這裡 選用小功率隔離式電源變壓器。輸出電壓大約60V。變壓器後級接一個可控 矽交流調壓電路。當調壓電路的參數選擇合適的時候，通過調節機械電位器， 在輸出端就可以得到滿足需要的電壓(圖4)。 1. 1. 2. 3微處理機
微處理機由目前應用比較廣泛的89C51單片機及其外圍電路來實現。它
是整個系統的核心部分。裝置的五個鍵盤按鍵狀態經過一定的邏輯組合後引 入到單片機的外部中斷0引腳。單片機通過中斷處理接收外部通過鍵盤輸入 的參數。同時單片機負責控制和驅動五個七段數碼管的顯示。單片機根據外 部輸入的參數，結合內部的軟體定時模塊，控制波形輸出模塊的通斷，實現 斬波功能(圖5)。
1.1.2.4輸出接口
本裝置的輸出採用交流和直流兩個通道分別輸出的方式。核心部件是繼 電器晶片，微處理機模塊通過1/0 口控制繼電器晶片實現斬波功能。另外， 為了安全起見，每個輸出通道都加上了保險管(圖6)。 1. 1. 3鍵盤輸入與顯示模塊
裝置裝有五個機械按鈕開關，以實現鍵盤按鍵的作用。另外，為了實驗 過程中使用的方便，系統預置了腳踏開關的接口，可以方便的接入腳踏開關 對系統進行控制。當這些開關或者按鈕之中有一個按下的時候會引起單片機 的外部中斷0產生中斷。通過中斷處理程序單片機讀入開關或者按鈕的狀態 並據此對相應的參數進行設置。這樣就實現了鍵盤輸入功能(圖7)。
裝置的顯示模塊由一個解碼器和五個最常用的七段數碼管及各自的驅 動晶片組成，由微處理機控制數碼管的顯示內容和時間(圖8)。 1. 2系統的軟體構成
在體基因轉導裝置的軟體框圖見圖9。 1.2.1開發平臺和開發工具
本裝置的軟體部分採用偉福公司的單片機仿真實驗系統作為平臺，以 C51語言作為開發工具開發的。 1.2.2軟體的具體實現 1. 2. 2. 1主程序
它是整個軟體模塊的入口，整個程序流程如圖IO所示。它首先完成一
些初始化工作，例如初始化一些有用的變量，定義一些常量。然後進行系統 自檢，確定系統是否正確啟動。當確定系統啟動成功後開放系統外部中斷O， 然後進入主循環等待中斷發生。主程序根據中斷處理程序中定義的指示變量 判斷是否有中斷發生。如果系統產生中斷，在自動調用中斷處理程序後，主 程序會根據在中斷處理程序中讀取到的鍵盤按鍵狀態進行判斷，決定對參數 進行何種設置。當接收到信號輸出命令後主程序調用波形輸出函數進行信號 輸出。
1. 2. 2. 2定時模塊
這是一個全局的函數，實現軟體定時。根據系統中單片機的振蕩頻率計 算出函數內部空循環的執行次數，實現以10ms為單位的軟體計時功能。它 供軟體系統的其他函數在需要定時服務的時候調用(圖lla)。 1. 2. 2. 3顯示模塊和波形輸出模塊
供軟體系統主程序調用的一個顯示函數。通過對被分配不同地址的七段 數碼管的驅動晶片寫入不同的數據來驅動數碼管完成顯示功能(圖llb)。
波形輸出函數實現系統的信號輸出功能。當主程序根據外部的輸入設置 好刺激參數後調用此函數對繼電器進行控制，繼電器晶片有一個使能端或者 稱為控制端，輸入高電平時繼電器就導通，而反之則截止。這個函數正是利 用繼電器的這個控制端實現斬波功能(圖12)。
1. 2. 2. 3參數設置和中斷響應函數
當鍵盤按鍵動作時會引起單片機中斷，在中斷處理函數中讀入按鍵的狀 態，並置位一個指示變量，供主程序檢測使用。中斷響應函數的程序流程圖 見圖13所示。
整個軟體系統是上述這些部分協調工作的整體，本發明的整個軟體系統 的流程圖見圖14所示。
2. 在體基因轉導裝置應用實例
2. 1實驗裝置
實驗採用本發明設計的在體基因轉導裝置。圖15示出了該在體基因轉 導裝置的一種典型輸出波形及其示意波形。
2. 2實驗材料
內黴素釋放出螢光素酶(pNGVL3-Luc，美國國家基因載體實驗室)，綠 色螢光蛋白(4-氯-3， 5-二甲苯酚-表皮生長因子受體-NI， "-3多不飽和 脂肪酸(EPA， DHA)和多種維生素製劑)和人體IX因子(4-氯-3， 5-二甲苯 酚一hFIX)質體。2，2，2-三溴乙醇是採購於Sigma-阿爾德林化學製品公司 (密爾沃基，威斯康新，USA)。美國北卡羅萊納大學中心設備實驗室飼養的 攜帶FIXK0因子和R333Q因子的小白鼠，它們都具有C57BL/6背景。 2.2實驗方法
2.2. 1向小白鼠骨骼肌的交流正弦波電基因傳導
每組有三隻小白鼠，每隻小白鼠分別腹腔注射8毫克2,2，2-三溴乙醇 使之麻醉，並通過手術使每個四頭肌剝離。使用本發明研製的在體基因轉導 裝置的雙針管注射器電極每次向一塊肌肉傳遞l O微克質粒DNA，電轉導 激勵的標準參數為6個脈衝，20 V/cm場強，6 0 0 m s脈寬，3 0 0 m s 間隔。基因向所有6個四頭肌轉導完畢後一天，再進行螢光素酶表達。溶解 的DNA (每2 0微升1 O微克)通過注射電極的針管注入手術分離的四頭 肌中，並立即將每釐米15、 20、 25、 30 V等4種交變場強的激勵脈衝(其 它施加參數同上)分別施加到這6個四頭肌上。數據表達單位為每單位四頭 肌中的相對光照單位(RLU)。在各個實驗組內比較交流正弦波和直流方波的 值，進行氺p〈0. 05和林p〈0. 01的t檢驗。 2.2.2蛋白質表達分析
電穿孔並摘除四頭肌後，在指定的時間內殺死小白鼠。加入2 ml溶解 緩衝液(0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚，2mM乙二胺四乙酸，andO. 1M 3-HCl，pH值7.8)並用組織切割使肌肉得到均勻處理。在微量離心機急速離心2 分鐘後，表浮物(2微升)用來分析螢光素酶活性。在每個四頭肌上，螢光 素酶的活性以相對光單位呈現。為了分析凝膠過濾血小板，用Carl ZeisslOOO倍螢光顯微鏡檢査並拍攝肌肉切片(lO um) (Zeiss,德國)。血 液中循環hFIX的採集酶標記免疫吸附測定法決定。俘獲抗體及小白鼠抗人 因子IX多克隆抗體以1: 1200的比例用碳酸鹽緩衝液稀釋，並配以一隻羊 的抗人因子IX多克隆抗體GAFIX-APHRP (生物學的親和力，Ancaster 0N， Canada)以檢測抗體。 2.2.3小白鼠的生物發光成像
在螢光素酶注入活體小白鼠腿中8天之後，使用生物發光/光學成像系 統(異基因的，Alameda， CA)對小白鼠進行成像。數據表達單位為每單位 四頭肌中的相對光照單位(RLU)。在各個實驗組內比較交流正弦波和直流方 波的值，進行水p〈0. 05和林p〈0. 01的t檢驗。D-螢光素酶(co-3多不飽和脂 肪酸(EPA， DHA)，麥迪遜，威斯康辛州)在磷酸鹽緩衝溶液中溶解並以150 mg/kg的劑量在光產生前10分鐘經腹腔注入小白鼠體內。全身麻痺會減少 5%異氟垸，在有2.5%的異氟烷通過頭錐體進入體內的過程中保持持續麻痺 狀態。
3.在體基因轉導的實驗結果 3.1基因表達水平的比較
分別用直流方波脈衝激勵信號和交流正弦脈衝激勵信號以不同電場強 度施加到注射DNA後的肌肉組織上，觀察它們對基因電轉導效率的影響。結 果如圖16a所示，利用交流正弦波進行實驗，脈衝寬度固定為600ms，當電 場強度從10V/cm到30V/cm變化時，所有試驗組的基因表達水平都得到了顯 著提高(p〈0.01)。結果還顯示，與直流方波脈衝激勵的結果相比，交流正 弦波脈衝激勵的螢光素酶表達水平提高了 10到20倍。同時，螢光素酶的表
達水平隨著交流正弦波持續時間的增加而提高，並在持續時間達到600ms 時達到最大值(圖16b)。相反，利用直流方波脈衝法激勵，其基因表達水 平沒有隨著刺激時間的增加而提高。同樣，對於活體動物大鼠在使用直流方 波脈衝激勵(左腿)和交流正弦波脈衝激勵(右腿)將螢光素酶質粒轉導到 每條腿8天後進行的活體動物螢光素酶的表達成像(圖16c)和對肌肉切片 (10微米)在電轉導10微克CMV-eGFP質粒(100X) 5天後進行GFP表達的 螢光圖像(圖16d)，也觀察到用交流正弦波脈衝激勵法可顯著提高基因表 達水平。
3.2基因電轉導後肌肉損傷程度的分析
通過波形函數的積分運算可知，理論上正弦函數電流產生的熱量只是 方波產生熱量的70%，故，引起的肌肉組織損傷比方波激勵組的小。為檢 測肌肉損傷，在基因轉導後5天採集樣本，進行服E著色(100X)，選取通 電部位損傷最嚴重的肌肉組織切片(IO微米厚)進行顯微圖像顯示和評估。 研究發現用直流方波脈衝激勵的試驗組中發現有大面積的損傷(肌肉組織 壞死)，而交流正弦波激勵組的基因電轉導引起的損傷則較小(圖17)。為 了確認組織學觀測的正確性，從實施電轉導後2小時的大鼠的血清樣本中提 取總肌酸激酶水平(CK)和骨骼肌損傷指標。在場強為30V/cm的情況下， 交流正弦波脈衝激勵組引起的CK減少量平均比直流方波脈衝激勵組引起的 CK減少量(p<0.01)小37。％。這與組織學分析結果相吻合，也與認為交流 正弦波產生的損傷是直流方波產生損傷的70%的理論計算結果相符合。 3.3動態基因表達和基因轉導到其他組織
交流正弦波基因轉導的進一步描述包括DNA劑量的檢測，基因表達的 動態特性和轉染到其他組織。為了評估DNA劑量對基因表達水平的影響，給 大鼠注入不同劑量的螢光素酶DNA，然後利用交流正弦波進行激勵。數據結 果如圖18所示，只要注入1毫克的DNA，肌肉內螢光素酶的表達水平就能
探測到到達很顯著的水平圖18a。當注入的DNA多於5毫克的時候，基因的 表達水平達到了一個高峰。如圖18b所示，在螢光素酶DNA注射入6小時後 可以探測到基因的表達並且在7天後達到了最大值。螢光素酶可以穩定的表 達至少80天，但是第30天和80天之間的表達水平會低於峰值。儘管如此， 80天後相同的肌肉通過二次基因電轉染可以使基因表達達到原先的峰值水 平。交流正弦波不僅使得未修飾的DNA轉導到肌肉而且也轉導到其他的組 織。如圖18c所示，用直流方波脈衝激勵或者交流正弦波激勵進行電轉導後 6個小時，在肝臟和皮膚可以探測到基因表達，20小時後在腫瘤裡可以探測 到。數據顯示，儘管在這些組織裡電轉導的條件並不是最好。但是，與用直 流方波激勵的實驗組相比，肝臟裡的基因表達水平仍提高了 8倍，皮膚和 TC-1腫瘤(HPV16E7+, 0. 7x0. 8Cm2, C57BL/6 mice)中的表達水平則提高了 10倍。
一些基因治療法需要新生的基因轉導，為此，用交流正弦波激勵法將 質體DNA轉染到新生大鼠的皮膚，在電轉導後4小時測得螢光素酶的表達如 圖18d所示。基因表達水平隨著時間的推移而增加，在14小時後達到了峰 值水平，此時皮膚的表達水平為1. lxl(fRLU。基因轉導後的動物行為包括接 受母親的哺乳情況顯示它們很活潑、正常，且沒有受到傷害。這些結果表明 了這種基因治療方法對嬰兒使用是安全可靠的。
以上這些研究結果均顯示-
1) 電脈衝激勵，使細胞膜的失穩態，打開和擴大其毛孔，允許像DNA、 酵素和抗體這樣的大分子進入細胞膜，增加了對細胞外分子的吸收；
2) 電泳力在促使DNA跨細胞膜移動方面不起作用。因此，正弦波脈衝 激勵可以使在體的電基因轉導在遠低於人體安全電壓(36V)的條件下(通 常施加20V/cm的電場強度)，獲得高於直流脈衝激勵產生的基因轉導效率的 10倍；
3)本發明所述的在體基因轉導裝置可方便，並廣泛地應用在電基因脈 衝轉導藥物的臨床試驗中。它提供的高效、安全的基因轉導方法將為今後開 展對人類疑難疾病的在體基因治療開闢了新途徑。
權利要求
1.一種在體基因轉導裝置，其特徵在於，該裝置包括一帶有雙注射器針管的雙電極針頭，用於給肌肉組織注射DNA以及給DNA所在之處的肌肉組織施加具有特定參數的激勵電場；雙電極針頭通過輸出接口分別與激勵信號源正負輸出端相連，以接收來自激勵信號源的激勵脈衝信號；一激勵信號源，用以產生正弦波脈衝和方波脈衝兩種激勵信號，激勵信號的幅度在10V-50V範圍內可調，脈衝寬度在10ms-1000ms之內可調，脈衝間隔也在10ms-1000ms之內可調；一次激發的脈衝數量在1-10個之內可調；一微處理機，微處理機連接有斬波器，用以對激勵信號進行控制和調節，根據設定的激勵參數控制系統進行斬波操作，以產生符合激勵參數設定要求的不同的激勵信號；微處理機連接有鍵盤輸入與顯示模塊，其中，輸入模塊用以實現刺激參數的設定，顯示模塊用以指示當前設定的特殊的刺激參數。
2. 如權利要求1所述的在體基因轉導裝置，其特徵在於，所述的微處 理機內有支持軟體，軟體包括1) 支持產生高壓、脈寬可調的交流正弦波脈衝信號的斬波控制軟體；2) 支持產生高壓、脈寬可調方波脈衝信號的斬波控制軟體；3) 支持產生每次輸出脈衝數可調的控制軟體；4) 鍵盤管理模塊用於對實驗參數進行設定、查詢、修改和刪除；5) 顯示器管理模塊用於監視設定的參數和出錯報警。
3. 如權利要求2所述的在體基因轉導裝置，其特徵在於，所述的軟體 由以下模塊構成定時模塊，用於實現以10ms為單位的軟體定時功能； 顯示模塊，用於實現設定參數的顯示功能；參數設置模塊，用於根據系統裝置測到的鍵盤按鍵的狀態變化來改變產 生的刺激信號的參數；波形輸出模塊，用以在設置好刺激信號的特殊參數後啟動刺激信號的輸出；中斷服務模塊，使用51單片機的外部中斷0，當發生中斷時系統自動 調用此模塊進行中斷處理。
4. 如權利要求1所述的在體基因轉導裝置，其特徵在於，所述的激勵 信號源為10V 50V電壓/脈寬直流電壓信號發生器或/和土10V 士50V電壓/脈寬佔空比可調的正弦波交流電壓信號發生器。
5. 如權利要求1所述的在體基因轉導裝置，其特徵在於，所述的雙注射器針管的雙電極針頭的間距為5mm 8mm。
全文摘要
本發明公開了一種在體基因轉導方法及其裝置，包括帶有雙注射器針管的雙電極針頭；高壓交流正弦波信號發生器；高壓直流信號發生器和微機控制斬波模塊組成，本發明採用雙注射器針管的雙電極針頭給肌肉組織注射DNA，同時給DNA所在之處的肌肉組織施加具有特定參數的激勵電場，從而實現了在保持與普通電極具有同等轉導效率的情況下，將原有普通電極裝置施加到肌肉組織層上的激勵電場強度從200-700V/cm降低到20-50V/cm，進而大大減少了肌肉組織的損傷。本發明具有體積小、重量輕、參數可調、臨床使用界面友好、操作方便等優點，從而實現了安全、高效的在體基因轉導。為進一步開展臨床基因治療試驗研究提供了新方法和新工具。
文檔編號C12N15/87GK101168744SQ200710018828
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月9日 優先權日2007年10月9日
發明者鋒 劉, 珏 王 申請人:西安交通大學