用於治療涉及應激相關疾病和病症的疾病的方法

2023-12-08 23:11:51 4

專利名稱：：用於治療涉及應激相關疾病和病症的疾病的方法用於治療涉及應激相關疾病和病症的疾病的方法
背景技術：
：細胞和生物以進化上保守的方式響應環境應激作為維持穩態的機制。異常的或長期的應激反應是100多種嚴重疾病的基礎(Xu等(2005))，並且對許多醫學方法的成功產生影響。細胞應激反應特有的響應環境應激(即響應感染和變化的營養可利用性(nutrientavailability),肥胖症、異生素)的進化上保守的機制包括涉及所謂"熱休克蛋白"(HSP)的機制。HSP構成廣泛分布於植物和動物界的高度保守的蛋白質家族。雖然最初是在遭受熱應激的細胞中鑑定出HSP,但是發現HSP與許多其它的應激形式(例如感染)有關，因此更常被稱為"應激蛋白"(SP)。蛋白質的生物學功能取決於其三維結構，這大部分是由其胺基酸序列決定的，但也是由環境決定的。實際上，蛋白質構象支配著它與可能參與調節蛋白質功能的其它因子的相互作用。多肽不能夠通過正確的蛋白質摺疊而呈現和維持其正確的結構，這是對細胞功能和存活的極大威脅。因此，精密系統得以進化，以保護細胞不受錯摺疊蛋白的有害作用。因此，蛋白質摺疊、寡聚、聚集或沉積的異常情況都可能在各種各樣的慢性進行性變性性疾病的病理生理中起重要作用。這類疾病的非限制性實例包括如下疾病帕金森病(Parkinson'sDisease,PD)、彌散性路易體痴呆(diffiiseLewybodydementia,DLBD)、多系統萎縮(MSA)、萎縮性肌強直、齒狀核紅核蒼白球路易氏體萎縮症(dentatorubro-pallidoluysianatrophy,DRPLA)、弗裡德賴希共濟失調(Friedreich'sataxia)、脆性X症候群、脆性XE精神發育遲緩、神經系統亞速爾病(Machado-JosephDisease)、脊髓延髓性肌萎縮(spinobuibar3muscularatrophy)(亦牙爾甘迺迪病(Kennedy'sDisease))、脊髓小月畝小生共濟失調、亨廷頓舞蹈病(Huntington'sdisease,HD)、伴有神經絲抑蛋白包含體的家族性腦病(FENIB)、皮克病(Pick'sdisease)、皮質基底節變性(corticobasaldegeneration,CBD)、進行性核上麻痺(PSP)、肌萎縮性側索硬化/帕金森神經機能障礙痴呆復徵(amyotrophiclateralsclerosis/parkinsonismdementiacomplex)、肌萎縮性側索硬化(ALS)，唐氏症候群(Down'ssyndrome)、年齡相關性黃斑變性、白內障和肝豆狀核變性(Wilson'sDisease)。在許多情況下，已經在這些家族性疾病基礎上鑑定出遺傳突變。然而，在大多數情況下，尚不清楚最初促使或觸發耙蛋白構象轉變的特發性事件，但卻最終導致觸發細胞毒性的蛋白質的異常加工、錯摺疊、寡聚或聚集。作為細胞解毒、防禦策略的組成部分或者作為降解摺疊異常的蛋白質的一種嘗試，這類異常蛋白質常常以不同類型的細胞包含物或聚集體積聚。因此，這些包含物或聚集體成為各種各樣的這類變性性疾病的病理標誌。迄今為止，還沒有用於這些疾病的治療藥和完全有效的治療。光照射或光線療法多年來就一直廣泛用於化學和生物科學。在1930、1940和1950年代血液紫外(UV)光照射便用於治療許多疾病。這些疾病包括細菌性疾病例如敗血病、肺炎、^M炎、傷口感染、病毒感染包括急性和慢性肝炎、脊髓灰質炎、麻瘮、流行性腮腺炎和單核細胞增多症。光線療法或光照射還包括使光活化或光致敏靶標(photosensitizabletarget)暴露於光能的方法，這引起了靶標內外的改變，光活化或光致敏靶標例如細胞、血液製品、體液、化學分子、組織、病毒和藥物化合物。近年來，光線療法的應用在醫學領域日益增加。這些應用包括使汙染血液或血液製品的病毒失活、預防性治療濃縮血小板輸注引起的所有免疫反應及治療自身免疫和T細胞兩者介導的疾病，因為多種人類疾病，特別是與生物體液(例如血液)有關的人類疾病對可見光或紫外光照射治療作出有益的反應。照射應用還可包括對含有細菌或病毒等有害微生物的液體的照射滅菌。光照射可還有效消除細胞的免疫原性，使選定的細胞失活或殺死選定的細胞，使病毒或細菌失活，或者激活所需免疫應答。光線療法可用於某些血液成分或全血的抗病毒治療。例如，可通過紫外光照射使所捐獻的濃縮血小板中的致病病毒失活(WO97/36634)。雖然光照射本身是有效的，無需引入外來物質或化合物，但是也可包括引入特定的物質或催化劑，例如光活化藥物。在一項具體的應用中，非常清楚的是多種人類疾病可用與正常組成全血的其它細胞群體相比，某些類型的白細胞(包括淋巴細胞)過量產生來表徵。過量的異常淋巴細胞群體在患者中導致多種不良反應，包括身體器官功能損傷、白細胞介導的自身免疫性疾病和最終導致死亡的白血病相關疾病。實際上，這些光活化藥物的使用可包括對患者血液進行處理，所述患者血液中特定的血細胞由於疾病已變得具有致病性。該方法一4殳包括用光活化藥物(例如補骨脂素)處理致病性血細胞(例如淋巴細胞)，當光活化藥物暴露在UV輻射下時便能夠與淋巴細胞DNA形成光加合物(photoadduct)。使用補骨脂素(例如曱氧沙林(methoxsalen))的光除去法(Photopheresis)可以引起針對異常(在CTCL的情況下為癌)T細胞的免疫作用。在光除去法期間，曱氧沙林進入白細胞核，並插入雙鏈DNA螺旋中。在體外環路中，長波紫外光對準富含白細胞的血液體積。對紫外線能量起反應的曱氧沙林，連接到DNA螺旋的胸苷鹼基上。這就導致了胸苷鹼基的交聯，防止了在轉錄期間DNA的解旋。紫外線A(UVA)破壞異常T細胞，賦予它們更多的免疫原性。其它補骨脂素或補骨脂素衍生物可通過其它途徑起作用。然而，細胞被光活化後，重輸回這些發生了改變的T細胞會？1起攜帶相同表面抗原的靶T細胞產生免疫反應(Edelson(1991)AnnNYAcadSci636:154-64)。這就導致產生針對異常細胞(癌克隆或者或許是在其表面表達病毒抗原的T細胞)的高度特異性的免疫應答。據估計，每一光除去法期間(連續2天的方案)佔總外周血單核細胞5室(compartment)的大約25-50%受到處理。發明概述本發明提供體外光除去法(ExtracorporealPhot叩heresis，ECP)的獨特的作用方式。ECP可通過調節細胞應激反應特有的響應環境應激(即響應感染和變化的營養可利用性、肥胖症、異生素)的進化上保守的才幾制而起作用。一個特定途徑，即己糖胺代謝途徑似乎通過改變細胞O-連接糖蛋白組成而調節這種應激反應。本文提供的數據支持該途徑起凋亡性細胞死亡傳感器的作用並可在ECP之後參與應激反應的主張。鑑於已知僅有兩種酶影響這個途徑，並且該途徑涉及糖尿病的發生和病理，因此該途徑為ECP療法提供了新的耙標。附圖簡述圖l表示體外光除去法的臨床操作流程。圖2表示ECP改善小鼠哮喘模型炎症的柱狀圖。圖3是表示ECP保護NOD/LtJ小鼠免於糖尿病及其併發症的曲線圖。圖4柱狀圖表示ECP鈍化T1DM小鼠模型中STZ的致糖尿病作用。圖5表示ECP的免疫作用機制。圖6柱狀圖表示與ECP處理細胞共培養的樹突細胞的細胞因子分泌模式。圖7是表示體外用AC抑制MLR中T細胞增殖所產生的Treg的柱狀圖。圖8是表示ECP方案對急性期蛋白作用的系列柱狀圖。圖9是表示ECP調節肺炎小鼠模型的胰島素和胰高血糖素的柱狀圖。圖10是表示ECP對生物標記(biomarker)的作用隨時間變化的柱狀圖(基線對時間的變化倍數)。圖11是表示肺炎小鼠模型中ECP誘導的瘦蛋白分泌的柱狀圖。圖12是表示健康小鼠中生物標記時程的曲線圖。圖13系列柱狀圖表示ECP治療的健康小鼠的細胞劑量-反應關係。圖14系列柱狀圖表示吞噬AC後對DCmTOR活性的劑量依賴效應取決於DC成熟狀態。圖15柱狀圖表示0-GlcNAc抑制對MLR中AC致耐受性的影響。圖16表示阿脲(Alloxan)通過刺激T細胞增殖逆轉MLR中ECP的作用。圖17表示ECP使動物和細胞針對化學應激物產生預先條件反射。圖18表示ECP處理誘導PBMC的TSP-1分泌。圖19表示MLR中TSP-1阻斷削弱ECP的致耐受性作用。發明詳述許多最普遍的慢性病(包括糖尿病)是由對應激的響應適應不良驅動的。應激，本文從廣義上定義為穩態受到威脅的一種狀態，是由一系列刺激包括心理、環境和生理需求所引起的。研究表明，體外光除去法(ECP)是可調節應激反應並促進適應的一種療法。該方法加強細胞和組織修復，加快消除疾病。因此，該療法提供了治療目前難以治療並且通常是致命性疾病的新的安全方法。ECP是安全有效的免疫調節療法，在多種炎症性疾病中具有確實的功效。ECP的治療益處似乎是由誘導免疫耐受、部分是通過誘導調節T細胞(Treg)所引起的。本發明提供體外調節ECP功能的信號轉導途徑，如炎症性疾病模型(包括T1DM)體內所證實的一樣。在動物模型和患者中，在多次ECP治療後通常出現更好的效果。實際上，對於若干疾病很少觀察得到反應，直到若干次治療周期後才有反應。與免疫抑制法治療相比，接受ECP的患者的感染率未升高，癌症未加重。動物模型的結果表明免疫應答是保守的，產生的速度和強度與未治療對照的基本相等，但是用ECP治療的消退更快。細胞和動物用大量不同類型的藥物治療，在體外和體內使得ECP更有效。增效作用見於影響對細胞應激反應和獨特信號轉導途徑十分關鍵的系統的藥物。ECP的基因表達譜表明，ECP誘導應激反應基因的轉錄物豐度發生改變，這包括了涉及定型應激反應、程序性應激反應的許多基因。與我們的基因陣列數據一致，免疫耐受的兩個特定控制點，一個是已知的，一個是新的，均受ECP調節。兩條途徑，即己糖胺生物合成途徑(HBP)和mTOR信號轉導級聯，都涉及營養感知(nutrientsensing)和糖尿病。兩者通常都對低水平應激作出反應，為細胞對隨後的激發提供更強的耐受性，這表明了ECP誘導的應激性條件反射效應(stressconditioningeffect)。ECP在急性應激條件下是保護性的，改善重度骨髓抑制骨髓移植後的臨床結果，保護培養細胞不受促凋亡攻擊，抑制遺傳和化學誘導的小鼠模型的糖尿病進程。這些觀察結果與應激誘導的條件反射應答相一致，最好用缺血性預先條件反射(ischemicpreconditioning)表徵。預先條件反射誘導適應性功能和結構的改變，這可降低或防止隨後應激物的損害。由這種"應激性條件反射"產生的表觀改變使基因表達模式發生改變，影響急性應激反應及其消退並建立持久的保護。本發明證實ECP可誘導這一反應，提高細胞和生物的應激能力。在治療已存在的疾病時，ECP通過條件反射後(post-conditioning)的方式誘導病理更快地消退，此過程中通過條件反射方案引起的生理變化能夠開始修復，並使之更快地恢復到穩態。已經報導了免疫應答的應激性條件反射的實例。實驗數據表明，用外源應激物實施條件反射是可行的，但是該選擇具有固有風險。例如缺血、照射、體溫過高、低體溫、麻醉、內毒素暴露、佐劑暴露或病原體暴露和相對有毒藥物的方案在動物模型和幾個臨床實一驗都顯示出功步支。可安全實施的條件反射方法一直困擾了研究人員和臨床工作者數十年。現已表明ECP提供了達到這一目標的手段。本發明表明，可安全地調節應激反應，這就揭示了新的治療方法和新的藥物可針對累及全球數百萬人的疾病，並且證實應激反應與免疫系統之間新的關係。已知凋亡細胞(AC)輸注(如ECP中)，誘導Treg和耐受性樹突細胞但卻不負責AC的清除(細胞清除(efferocytosis)),誘導機制尚不清楚。本發明表明若干類化合物，特別是雷帕黴素(Rapamycin)、抗氧化劑和南蛇藤醇(Celastrol),體外與AC協同作用。這些藥物改變應激反應，而且本發明表明還可以進行細胞清除。實際上，AC輸注在體內改變應激反應和代謝基因的表達譜，在體外改變樹突細胞的表達鐠。一個實例是胞外蛋白血小板反應蛋白-1。TSP-1是應激響應性的(Zebo等(2005)和Favier等(2005))，是由凋亡細胞和吞噬細胞釋放的，研究表明TSP-1通過特異性受體相互作用，體外產生耐受性APC和Treg(Krispin等(2006)和Grimbert等(2006))。這些體外發現得到了證實，這就表明了該作用不依賴於細胞凋亡的誘導方法。還對代謝調控基因進行了研究。因為應激物對免疫系統具有重要作用，這由基因表達和能量代謝的變化得到證實(Fox等(2005)),所以本文能量代謝的血清標記顯示在響應ECP時發生改變。實際上，在治療後的小鼠中，胰島素、胰高血糖素和IGF-1的濃度以劑量和時間依賴的方式受ECP調節。已知代謝失調的動物可能具有異常的預先條件反射應答(Katakam等(2006))，因此我們研究了相關途徑(包括己糖胺生物合成途徑(HBP)酶)的基因表達。O-GlcNAc酶(O-GlcNAcase)表達響應細胞清除，抑制該酶或抑制逆調節HBP酶O-GlcNAc轉移酶，體外將顯著改變致耐受性(Kudlow(2006)和Dauphinee等(2005))。準確地講，O-GlcNAc酶抑制劑PUGNAc和鏈脲佐菌素(Streptozotocin)增強AC的作用，而用阿脲(Alloxan)抑制OGT則完全使之逆轉。HBP是應激響應性的，並涉及嗜中性粒細胞趨化性(Zachara等(2004)和Kneass等(2005))。迄今為止，由HBP同時調節的免疫耐受和應激反應尚未弄明白，但卻具有深刻含義，包括對代謝疾病、神經疾病和心血管疾病共同病理的新的深入了解(Lehman等(2005);Katakam等(2006);Mattson等(1999)和Hashizume等(2006))。術語"受治療者"或"患者"可互換使用，是指動物，優選哺乳動物，更優選人。"細胞群體"一般包括血液中存在的細胞類型。該術語可包括一種或多種類型的血細胞，準確地講為紅細胞、血小板和白細胞。細胞群體可包括白細胞的亞型，例如T細胞、樹突細胞、B細胞等。在一個實施方案中，細胞群體可包括混合或合併的細胞類型。或者，細胞群體可包括基本純的細胞類型，例如T細胞或樹突細胞(DC)。"ECP方法"或"ECP"是指體外光除去法，亦稱體外光線療法。它是已接受紫外線A和光活化化合物的細胞群體的療法。優選細胞群體來自器官或組織；更優選細胞群體是血液部分，最優選細胞群體為血沉棕黃層。ECP有時用來指其中在DNA交聯劑(例如補骨脂素(優選8-MOP))存在下用紫外線A進行細胞凋亡誘導過程的細胞群體的方法。在本發明最優選的實施方案中，採用了ECP。ECP誘導細胞凋亡的應用方法和細胞用途參見US20050163778。該方法包括將光活化化合物加到離體細胞群體中。從受治療者、接受者或供體(視情況而定)抽取血細胞後，在暴露於紫外光之前或同時，將光敏化合物(photosensitivecompound)給予包含血細胞的細胞群體中。可將光敏化合物給予包含全血或其部分的細胞群體中，前提條件是目標血細胞或血液成分接受光敏化合物。在另一個實施方案中，部分受治療者血液、接受者血液或供體血液可先用已知方法處理以基本除去紅細胞，然後10可將光活化化合物給予所得包含富含白細胞部分的細胞群體。在一個替代的實施方案中，可以體內給予光活化化合物。當將光敏化合物體內給予包含受治療者血液、接受者血液或供體血液(視情況而定)的細胞群體時，可口服給予，但也可經靜脈內和/或通過其它常規給藥途徑給予。光敏化合物的口服劑量範圍可為約0.3mg/kg至約0.7mg/kg,更準確地講，約為0.6mg/kg。當口服給藥時，可在光除去法治療前至少1小時左右和在光除去法治療前約3小時以內給予光敏化合物。用於本發明的光活化化合物包括但不限於稱為補骨脂素(或呋喃並香豆素(fbrocoumarin))以及補骨脂素衍生物的化合物，例如記載於例如US4321919和US5399719中的化合物。優選的化合物包括8-曱氧基補骨脂素；4,5'，8-三甲基補骨脂素；5-曱氧基補骨脂素；4-曱基補骨脂素；4,4-二曱基補骨脂素；4,5'-二曱基補骨脂素；4'-氨甲基-4,5',8-三曱基補骨脂素；4'-羥曱基-4，5'，8-三曱基補骨脂素；4',8-曱氧基補骨脂素和4'-(co-氨基-2-氧雜)烷基-4，5'8-三甲基補骨脂素，包括但不限於4'-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4,5'，8-三曱基補骨脂素。在一個實施方案中，可以使用的光敏化合物包含補骨脂素衍生物氨託沙林(amotosalen)(S-59)(Cerus，Corp.,Concord,CA)。在另一個實施方案中，光敏化合物包含8-甲氧基補骨脂素(8MOP)。向其中加入光活化化合物的細胞群體用激活光活化化合物的波長的光進行處理。激活光活化化合物的處理步驟優選用長波長的紫外光(UVA)進行，例如，範圍為320-400nm的波長。在光除去法治療期間，紫外光的暴露優選給予足夠長的時間以向細胞群體遞送約1-2J/cm2的能量。用於本發明方法的體外光除去法儀器包括由Therakos，Inc.，(Exton，Pa.)製造的商品名為UVARTM的儀器。該儀器的使用說明參見US4683889。UVARtm系統採用治療系統，並由三個階^史組成，包括l)採集血沉棕黃層部分(富含白細胞)，2)照射所採集的血沉棕黃層部分ii和3)重輸回經處理的白細胞。採集階段有抽血、離心和重輸回步驟6次循環。每次循環期間，將全血離心，在碗形提取機(pheresisbowl)中分離。自該分離起，在每次採集循環中均保留血漿(每次循環的體積由UVARTM儀器操作人員決定)和40ml血沉棕黃層。在下一次採集循環前，將紅細胞和所有其它血漿重輸回給患者。最後，分離出總量為240ml的血沉棕黃層和300ml的血漿，保存待UVA照射用。在照射環路內照射富含白細胞的血液始於第一次採集循環的血沉棕黃層採集期間。將所採集的血漿和血沉棕黃層與200ml肝素化生理鹽水和200mgUVADEX(水溶性8-曱氧基補骨脂素)相混合。使該混合物流過PHOTOCEPTORTM光活化室1.4mm厚夾層，該層插在PHOTOSETTETM兩側的UYA燈之間。PHOTOSETTEUVA燈照射在該可透射UYA的PHOTOCEPTORTM室兩側，允許暴露於紫外線A中180分鐘，產生的平均曝光量為1-2J/cmV淋巴細胞。最終的血沉棕黃層製備物含有估計為總外周血單核細胞組分的20%-25%,血細胞比容為2.5%-7%。在光活化期之後，在30-45分鐘的時間內將該體積輸回給患者。US20030181305描述了用於實施ECP的另一個系統。US5951509、US5985914、US5984887、US4464166、US4428744、US4398906、US4321919、WO97/36634和WO97/36581也包括了用於這一方面的裝置和方法的描述。可用於本發明方法的另一系統可參見US6793643。該系統包括採集或抽取受治療者淨體液的儀器，所採集的或抽取的淨體液體積在ECP期間可能會減少。供給細胞群體的光能的有效量可採用US6219584中所述方法和系統來確定。在細胞群體中誘導細胞凋亡的其它各種方法是眾所周知的，可以採納用於本發明。這類療法中的一種包括使細胞群體經過電離輻射(K射線、x射線等)和/或非電離電磁輻射，其包括紫外光、加熱、冷卻、血清剝奪、生長因子剝奪、酸化、稀釋、鹼化、離子強度改變、血清剝奪、照射或其組合。或者，可通過使細胞群體經過超聲處理來誘導細胞凋亡。誘導細胞凋亡的又一種方法包括體外給細胞群體施予氧化應激。這可通過在懸液中用化學氧化劑處理細胞群體來實現，氧化劑例如過氧化氫、其它過氧化物和氫過氧化物、臭氧、高錳酸鹽、高碘酸鹽等。可以採用生物可接受的氧化劑來減少與由此形成的細胞凋亡誘導的細胞群體的殘餘物和汙染物相關的潛在問題。在製備細胞凋亡誘導的細胞群體時，應當注意不要使用過量的氧化應激、照射、藥物治療水平等，因為不這樣的話便可能發生重大風險，在處理時引起至少某些細胞壞死。壞死將引起細胞膜破裂，並釋放出細胞內容物，這些細胞內容物常常具有對生物有害的結果，特別是炎症反應，因此，最好避免壞死細胞及其組分與包含凋亡細胞的細胞群體一起存在。本領域技術人員容易確定誘導細胞凋亡的細胞群體處理的適當水平和所選擇的誘導細胞凋亡的處理類型。本發明的一種方法包括得自受治療者或相容性哺乳動物細胞系的培養細胞。然後，對培養細胞進行體外處理，以誘導細胞凋亡並/人中產生細胞群體。體外療法可選自抗體、化療藥物、照射、體外光除去法、超聲、蛋白質和氧化劑。然後，將懸浮於受治療者血漿或其它合適懸浮介質(例如鹽水或哺乳動物細胞平衡培養基)中的細胞給予患者。-在本發明中，細胞凋亡的檢測和定量方法用於測定給予受治療者的製備物中細胞凋亡的存在和水平。在受治療者中獲得所需臨床益處所需要的細胞群體中凋亡細胞的數量可根據細胞來源、受治療者的病症、受治療者的年齡和體重及其它相關因素而改變，這容易通過眾所周知的方法確定。優選給予患者的凋亡細胞數為1-500億個，更優選10-100億，最優選25-75億。在一個實施方案中，經歷細胞凋亡的細胞可通過見於瓊脂糖凝膠電泳上特有的由DNA切割成為一系列片段所形成的DNA"梯"條帶來進行鑑定。在另一個實施方案中，磷脂醯絲氨酸在細胞上的表面表達可用來鑑定和/或定量測定細胞凋亡誘導的細胞群體。另一種鑑定細胞群體的公認方法是測量線粒體膜電位的變化，所述變化反映出線粒體膜的通透性。科技文獻中還記載了鑑定經歷細胞凋亡的細胞和鑑定細胞群體的其它多種方法，其中許多都採用了針對細胞群體特異性標記的單克隆抗體。改進ECP療法(或許通過己糖胺途徑)使ECP對應激反應的作用最優化可能提供新的治療機會。通過這種"整合應激反應"(integratedstressresponse，ISR，亦稱"未4斤疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse)"、"內質網(ER)應激"和其它命名)優化ECP以對免疫系統進行最佳調節，可將ECP延伸到之前未研究確定的疾病中，據信這種應激反應在所述疾病中起著病理生物學作用。這些疾病包括大多數目前難以治療且通常是致命的器官系統病理。該作用方式包括通過單次或重複給予適當數量的凋亡細胞而使細胞耐受應激時產生條件反射，凋亡細胞在此用作免疫系統的低水平應激物。以前的研究表明，其它應激物可以誘導這種預先條件反射，但是這些應激物作為治療很可能是不安全的。因此，ECP,—種安全有效的市場化療法，提供了特別改進應激反應和改變疾病進程或疾病易感性的方法。這種應激反應由多種刺激誘導，這些刺激通過對在刺激的時候還沒有準備好應對的ER提出要求，從而引起指示ER應激的信號。這些應激物包括其中發生宿主/患者細胞喪失蛋白質表達控制的條件。這包括了導致ER功能異常(例如蛋白質翻譯速率超過細胞修飾或其它適當加工蛋白質的能力)的多個細胞信號轉導事件。似乎這種應激反應性條件反射(stressresponseconditioning)不僅在吞噬凋亡細胞的細胞中被誘導，而且最終還將信號轉導從這些細胞傳至其它組織，其方式是傳輸存在應激增加的信號。這類反應需要受累組織的適應性改變，以便從系統可能遭受的起始應激或隨後的應激中完全恢復。因此，本發明將ECP擴大用於感染性疾病和相關療法包括病毒感染(例如病理或治療上誘導的雙鏈RNA暴露)、其中轉化既誘導ER應激又越過正常細胞死亡和修復反應的癌症療法、與蛋白質錯摺疊或過量表達有關的腎病和其中各種刺激誘導胞外基質蛋白過量表達和細胞過度增殖的纖維化疾病。本發明將現有治療方案擴大用於所述疾病，其中包括蛋白質聚集疾病(proteinaggregationdisease)，包4舌<旦不限於阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)、帕金森病、亨廷頓舞蹈病(Huntington'schorea);消耗病，包括但不限於朊病毒感染的海綿狀腦病和遺傳突變型克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jacobdisease,"vCJD")。包括胰島素抵抗和分泌細胞缺陷的代謝和免疫應激相關疾病，包括糖尿病、代謝症候群和其它肥胖症相關病理都與未摺疊蛋白反應相關，因此易於用ECP療法進行治療。這包括但不限於動脈粥樣硬化和相關心血管疾病，其中細胞過量產生蛋白質導致蛋白質及其聚集物的病理性沉積，及過量產生蛋白質作為其正常自然史或病理自然史(pathologicalnaturalhistories)組成部分的任何分泌細胞的疾病。通常在這個分泌範圍內要考慮的細胞包括但不限於胰腺P細胞、前列腺組織、分泌大量免疫球蛋白的免疫細胞(例如漿細胞)、分泌其它蛋白質的免疫細胞(例如產生幹擾素y的樹突細胞)和黏膜分泌細胞(例如胃腸道和氣道中的黏蛋白分泌細胞)。被刺激改變了表型以使蛋白質產量提高的細胞可受這種應激的影響，其中病理性響應該應激所導致的這種生產能力功能障礙的疾病，為ECP糹是供治療益處而提供了額外的靶組織。這包括但不限於肝臟和胃的產酶細胞、肽分泌神經元和神經內分泌組織和在響應損傷(例如傷口癒合、響應輻射損傷)時受刺激分泌胞外基質和組織重塑蛋白的細胞。暴露於溫度應激或氧化應激的任何細胞可能都需要適當的應激反應，此時ECP條件反射可有利於許多的這類情況，因為這類條件反射可提供抗損傷的抗性，或加快由這類應激所產生的損傷的修復。因此，暴露於產生活性氧類別、過氧亞硝酸鹽或其它氧化應激等環境危15害的各種情況均是ECP療法的靶標。這包括但不限於中毒(例如百草枯等農用化學品)、輻射暴露、過度運動(extremeexercise)、化學療法、麻醉、高壓暴露、誘導活性氧類別(例如由血小板衍生生長因子("PDGF")受體信號轉導系統產生的活性氧類別)的遺傳性預先條件(geneticpreconditions)禾口創傷。已知由應激反應所致細胞代謝的改變除了改變蛋白質運輸以外，還影響小分子的細胞轉運。基因表達譜顯示，ECP有益地改變多藥抗性("MDR")轉運蛋白的表達。優化ECP通過限制或改變MDR泵和轉運蛋白的表達，改變了藥物從細胞中排出，從而影響抗藥性(例如在癌症化學療法或抗生素/抗病毒治療中)。.在其它情況下，可使ECP最優化以促使藥物攝取進入細胞內。一個受到普遍認可的假設提出，衰老過程是由氧化應激對生物體的累積效應所驅動的。研究表明熱量限制部分通過改變細胞對氧化應激或對由正常或過度代謝所產生的應激的響應從而延長了壽命。已知由ECP誘導的應激反應涉及類似於由熱量限制所誘導的應激的機制，故ECP可改變衰老效應。可以應用現有方法使ECP最優化。首先，整合應激反應引起若干已知轉錄物的選擇性剪接，所述轉錄物包括直接參與這種應激反應特有的修復過程和翻譯抑制的抑制物，以及當細胞不能克服ER應激時隨之代替修復的凋亡的轉錄物。已經表明，Xbp-lmRNA的選擇性剪接發生在應激反應中，並可用本領域已知的任何方法測定，所述方法包括但不限於用外周血或正常組織活檢樣品的定量PCR。或者，監測mTOR活性用作應激反應的生物標記，因為這種應激反應的特徵是通過mTOR途徑計算時間信號。S6激酶(mTOR的直接下遊底物)的磷酸化，已被用作藥效動力學標記，以監測正在進行雷帕黴素治療的患者的免疫抑制。雖然已發表的報導描述了蛋白質印跡方法，但是也可獲得被證實用於流式細胞術分析細胞系中mTOR活性的試劑。可應用本領域已知方法監測外周血的mTOR活性，這些方法包括但不限於流式細胞術和免疫組織化學技術。如本文提供的實施例中所述，採用應激反應和細胞凋亡的生物標記，監測對不同ECP條件的反應，為測定應激相關疾病和病症中ECP的療效提供了方法。採用這些生物標記，通過改變細胞劑量和劑量方案，可提供具有以前無法達到的臨床精度的ECP。這使得作為一流療法的ECP的治療潛能最大化，並能使ECP與其它免疫調節藥物療法和治療方案的組合最優化。生物標記是指示標記基因表達水平的任何標記。該標記可以是直接標記或間接標記，可在給定生理參數並與內部對照、正常組織或其它癌相比較時，測量基因的過量表達或表達不足。生物標記包括但不限於核酸(過量表達和表達不足及直接和間接的)。採用核酸作為生物標記可包括本領域已知的任何方法，包括但不限於測定DNA擴增、RNA、微小RNA、雜合性丟失(LOH)、單核苷酸多態性(SNP，Brookes(1999))、微衛星DNA、DNA曱基化不足或過度曱基化。採用蛋白質作為生物標記包括本領域已知的任何方法，包括但不限於測定含量、活性、修飾例如糖基化、磷酸化、ADP核糖基化、遍在蛋白化等或免疫組織化學法(IHC)。其它生物標記包括成4象標記、細胞計數標記和細月包凋亡標i己。標記核酸當含有由SEQIDNO標明的序列時，則相當於該序列。基因序列時，則相當於這類基因序列。基因表達產物當其RNA、mRNA、miRNA或cDNA與具有這類序列(例如探針)的組成雜交或在肽或蛋白質情況下由這類mRNA編碼時，則相當於這類序列。基因表因表達產物足以辨認為基因或基因表達產物的序列時，則相當於這類基因或基因表達產物的序列。本說明書所描述和要求保護的本發明的方法、組合物、製造品和試劑盒包括一種或多種標記基因。本說明書全文所用的"標記"或"標記基因"是指與過量表達或表達不足的任何基因相對應的基因和基因表達產物，與應激反應或炎症相關反應有關。本發明還提供用於實施本文所述方法的微陣列或基因晶片。本發明還提供診斷/預後包(diagnostic/prognosticportfolios),其含有適於測定生物標記的試劑，生物標記例如分離的核酸序列、其互補序列或本文所述基因組合的部分，其中所述組合足以測定或表徵生物樣品中的基因表達。本發明所述任何方法還可包括測定樣品中組成型表達的至少一種基因的表達。本發明還提供按照本發明所述方法，通過鑑定應激相關反應或炎症相關反應並確定其適當治療，以用於提供治療指導的方法。本發明還提供按照本發明所述方法，通過鑑定應激相關反應或炎症相關反應並確定其相應的預後，以用於提供預後的方法。本發明還提供生物標記的測定方法，該方法包括按照本文所述方法測定標記基因的表達水平，測定用於標記基因的生物標記以測定其表達，分析本標記基因的表達，確定標記基因對於應激相關反應或炎症相關反應是否是有效和特異性的。本發明還提供用於進行本文所述測定法的試劑盒、製造品、微陣列或基因晶片、診斷/預後包和用於報告由本發明方法所獲得結果的患者報告。幾乎沒有發現組織樣品中僅憑存在或不存在特定核酸序列便具有診斷或預後價值。另一方面，有關各種蛋白質、肽或mRNA表達的信息卻越來越重要。基因組內僅僅存在具有表達蛋白質、肽或mRNA潛力的核酸序列(這類序列亦稱"基因")本身並不能決定蛋白質、肽或mRNA是否在指定細胞中表達。無論指定基因是否表達蛋白質、肽或mRNA，如果真有表達則這類表達進行的程度，完全由各種各樣的複雜因素所決定。不考慮理解和評價這些因素的困難，測定基因表達就能夠提供有關重要事件(例如應激相關反應或炎症相關反應和其它臨床上有關的現象)發生的有用信息。可由基因表達譜測出基因是否有活性或活性程度的相對指標。創建基因表達譜優選的方法包括測定由可編碼蛋白質或肽的基因所產生的RNA的量。這可通過反轉錄酶PCR(RT-PCR)、竟爭性RT-PCR、實時RT-PCR、差示RT-PCR、RNA印跡分析和其它相關試驗來實現。雖然能用單獨的PCR反應實施這些技術，但是最好是擴增進行分析。多種不同的陣列配置及其生產方法為本領域技術人員所知，可參見例如5445934、5532128、5556752、5242974、5384261、5405783、5412087、5424186、5429807、5436327、5472672、5527681、5529756、5545531、5554501、5561071、5571639、5593839、5599695、5624711、5658734和5700637。微陣列技術可供同時測定數千個基因的穩態mRNA或miRNA水平，為鑑定效果例如應激相關反應或炎症相關反應的發生或調節提供了強有力的工具。目前廣泛使用兩種微陣列技術，即cDNA陣列和寡核苷酸陣列。雖然在構建這些晶片時存在差異，但是基本所有的下遊數據分析和結果輸出都相同。這些分析結果通常是測定接收自標記探針的信號強度，所述標記探針用於測定樣品的cDNA序列，該cDNA序列能與微陣列已知位置上的核酸序列雜交。信號強度通常與cDNA的量成比例，因此與樣品細胞中所表達的mRNA或miRNA成比例。可獲得並採用多種這樣的技術。優選的方法可參見6271002、6218122、6218114、6004755和Keene等(2006)RIP-Chip:theisolationandidentificationofmRNAs,microRNAsandproteincomponentsofribonucleoproteincomplexesfromcellextracts(RIP-晶片糹田月包提取物mRNA、微小RNA和核糖核蛋白複合體的蛋白組分的分離和鑑定)，NatureProtocols1:302-307。通過比較這種信號強度來進行表達水平的分析。這最好通過繪製試驗樣品的基因表達強度與對照樣品的基因表達強度的比率矩陣來進行。例如，可以將患病組織的基因表達強度與同一類型正常組織所產生的表達強度進行比較。這些表達強度之比表示試驗樣品和對照樣品之間基因表達的變化倍數。可根據統計學檢驗得出的秩次表進行選擇，所述秩次表與應激相關反應或炎症相關反應有關因素之間各個基因差異表達的顯著性證據有關。這類檢驗的實例包括ANOVA和克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis)。該秩評定可在模型中用作權數，所述模型被設計來解釋這些權數直到截止值(cutoff)的總和，作為一種類型優於另一種類型的優勢證據。也可用以前文獻所述證據來調整權數。可以多種方式來表示基因表達鐠。最常用的是將原始螢光強度或比率矩陣排列成系統樹圖(graphicaldendogram),其中列表示試驗樣品，行表示基因。數據的排列使得相似表達鐠的基因彼此接近。每個基因的表達比率可按顏色顯現。例如，比率小於1(下調)顯示光譜的藍色部分，而比率大於1(上調)則顯示光譜的紅色部分。可獲得顯示這些數據的市售計算機軟體程序，包括"GeneSpring"(SiliconGenetics,Inc.)及"Discovery，'和"Infer，，(Partek，Inc.)。在測定蛋白質水平以確定基因表達的情況下，本領域已知的任何方法都是合適的，只要可產生合適的特異性和靈敏度。例如，可通過將蛋白質與對蛋白質特異性的抗體或抗體片段結合，並測定抗體結合蛋白的量，從而確定蛋白質水平。抗體可用放射性試劑、螢光試劑或其它可4企測試劑標記以易於檢測。^r測方法包括^f旦不限於酶:f關免疫吸附測定技術(ELISA)和免疫印跡技術。'本發明的基因表達譜還可與其它非遺傳診斷方法結合，用於診斷、預後或治療監測。例如，在某些情況下，將上述基於基因表達診斷能力的方法與得自常規標記(例如血清蛋白質標記)的數據相結合是有益的。在這些方法的一種方法中，患者定期抽血，然後，對血液進行酶免疫測定，以測定血清標記物，例如白蛋白。當標記的濃度提示應激相關反應或炎症相關反應的可能性時，採集可進行基因表達分析的樣品源。當其它測定方法得到的結果不確定時，這種方法可能是特別有用的。按照本發明製備的試劑盒包括用於測定生物標記表達的格式化測定產品。這些可包括所有或一些進行測定所需的材料例如試劑和說明書和在其中測定生物標記的介質。本發明的製造品包括用於治療、診斷、預後和其它評價疾病的生物標記表達的演示。這些譜的演示內容可被轉換到可以用機器自動讀取的介質上，例如計算機可讀取介質(computerreadablemedia)(磁性、光學介質等)。本發明的製造品還可包括用於對這類介質的基因表達譜進行評價的說明書。例如，本發明的製造品可包括裝有計算機說明書的CDROM,說明書用於對上述基因包(portfoliosofgenes)的基因表達譜進行比較。所述製造品還有數位化記錄在其中的基因表達譜，以便與患者樣品中的基因表達數據進行比較。或者，表達譜可按不同的演示格式予以記錄。一種圖解記錄就是這類格式。聚類算法，例如結合到得自上述Partek,Inc.的"DISCOVERY"和"INFER"軟體中的聚類算法，可能最利於這些數據的顯現。本發明不同類型的製造品是用於揭示基因表達譜的介質或格式化測定產品。這些可包括例如微陣列，其中互補序列或探針被固定在基質上，指示目標基因的序列與之結合，產生確定目標基因存在的可讀數據。或者，本發明的製造品可製成試劑盒，用於進行雜交、擴增和產生指示目標基因表達水平的信號，以預測或監測應激相關反應或炎症相關反應。下面的實施例供說明但並不是對本發明的限制。所引用的所有參考文獻都通過引起結合到本文中。實施例1體外光除去法是一種創新的免疫細胞療法，在美國獲準用於皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)的姑息療法，在歐洲獲準用於治療CTCL和免疫介導性疾病，包括移才直物抗宿主病、系統性硬化症、類風溼性關節炎、克羅恩病(Crohn'sdisease),fflV和實體器官移植(Suri等(2006))。Therakos光除去法採用與患者相連接的無菌閉環即時提取法裝置(pointofcareapheresisdevice),該裝置抽取並分離循環外周血單核細胞(PBMC)的大約3-5°/。。所採集的細胞用UV敏化劑8-甲氧基補骨脂素(UVADEX⑧)離體處理，然後細胞通過暴露於UV-A而被激活，並被迅速輸回給患者(參見圖1)。ECP處理細胞隨後通過細胞凋亡(一種程序性細胞死亡形式)而死亡。已經表明，靜脈內重輸回凋亡細胞(AC)通過調節細胞因子、產生耐受性樹突細胞(DC)並產生Treg,從而下調免疫應答(Meloni等(2007))。實施例2ECP在小鼠模型中的抗炎作用我們已證實，ECP減輕與小鼠OVA誘導的氣道高反應性(airwayhyper-responsiveness)有關的炎症過程。如圖2所示，在抗原性攻擊OVA敏化小鼠後，增加ECP處理細胞的劑量具有減輕氣道收縮(左圖)和炎症病理(免疫細胞浸潤，右圖)的劑量依賴性能力。在這兩個小鼠模型中，對ECP劑量和治療頻率進行了研究。總的來說，數據表明，增加ECP細胞劑量和治療頻率與更好的結果有關，尤其如果ECP是在建立顯著免疫應答之前給予。實施例3糖尿病小鼠模型中的ECP已有研究報導了ECP在糖尿病小鼠模型中的療效(Marks等(1991))。以前的研究表明，採用每周遞送ECP處理細胞，降低了NOD/LtJ小鼠和環磷醯胺治療的NOD/Wehi的糖尿病發病率。我們使用ECP的糖尿病鼠模型的經驗大致相同。自11周齡開始，用10x106個細胞一周一次治療NOD/LtT小鼠，在胰腺損傷建立後，小鼠開始出現明顯的糖尿病跡象(Turley等(2003))。然而，ECP治療的動物的血糖水平低於未治療的NOD對照(圖3,上圖)。該圖中的插圖表示20周齡未治療動物的糖尿病率為60%;而9隻ECP治療動物中僅2隻(220/0)有糖尿病。ECP治療的動物在其它方面都更健康。ECP治療小鼠中，煩渴和多尿減輕或缺乏，ECP治療的動物體重增加正常。然而，未治療NOD/LtJ小鼠則顯示明顯的體重減輕(圖3,下圖，由高峰平均體重平均減輕~8%)。實施例4我們進行了研究，分析了ECP在多次低劑量鏈脲佐菌素(STZ)T1DM模型中防止胰腺損傷的能力。與NOD模型一樣，相對於給予第一劑STZ的-7天、-3天、0天或+2天，用10x106個ECP處理細胞治療的小鼠血糖水平低於對照的血糖水平。該項實驗的結果表明，ECP可以提供充分的保護以免患上化學誘發的糖尿病(pM).l,n-5-7)。圖4。實施例5ECP誘導的免疫耐受細胞的凋亡是極為普遍的現象，即使在健康生物體中，它在組織發育和維持中發揮重要功能(Krysko等(2006))。細胞凋亡和其它形式的程序性細胞死亡在許多方面不同於由損傷或感染導致的壞死性死亡。這一區別對於免疫系統十分重要。包括釋放其它的胞內成分的細胞死亡，如壞死中，往往引起炎症反應。這一過程導致炎症的"危險信號"，與通過吞噬細胞清除AC而不引起炎症反應的穩態系統形成對照(Matzinger(2002))。實際上，清除AC誘導相反的反應，即免疫耐受。尚不清楚驅動該過程的機制，但是最新數據強調耐受誘導的兩個關4建組分。AC由患者的定居抗原呈遞細胞(APC,例如iDC和巨噬細胞)清除。該過程迅速清除AC，導致吞噬細胞表面受體，所述受體發出主動抑制DC成熟並降低共刺激分子和促炎細胞因子表達的信號(Mahnke等(2003)和Morelli等(2003))。同樣，還增加抗炎細胞因子的產生和Treg的誘導，所有這些都介導免疫耐受。這些凋亡細胞的生物學特性通常與ECP—起用於治療，限制DC活化/成熟，從而下調有害的T細胞應答。最新解釋ECP作用機制的假說見圖5。一般認為ECP誘導免疫調節作用，募集內部系統以進行修復和消退。實施例6ECP作用機制的體外研究:該的1止佐<<於唇丁3承TT通1^乂-裡2田刀巴1能的研究中。通過體外CD40配體刺激成熟的靜息iDC，當與ECP處理細胞共培養並且用細菌脂多糖刺激時，引起IL-12水平降低(LPS,圖6，左圖)。包括IL-ip、IL-6和TNFa在內的其它促炎細胞因子中也觀察到類似結果。相反地，將ECP處理細胞加到活化DC培養物中刺激了抗炎細胞因子TGFP產生的增加(圖6,右圖)。因此，抗炎作用是雙重的，既改變促炎過程又改變抗炎過程。實施例7體內研究在小鼠中開發出了一種ECP模型，供有生命的動物研究與體外模型結合。例如，從靜脈內給予ECP處理AC的小鼠脾臟分離的APC表明，當與同種異體T細胞共培養時，降低了刺激MLR的能力。同樣，當未成熟DC和T細胞與ECP處理細胞共培養時，同種異體人T細胞不會增殖得那麼強烈。因此，AC"輸送，，誘導了DC的耐受性表型，降低了其刺激T細胞應答的能力(參見圖M和圖1"。24小鼠和人體中有證據表明，AC輸注誘導Treg。Maeda及其同事指出，接觸性超敏反應模型中，ECP的免疫調節由是Treg介導的(Maeda等(2005))。Kleinclauss及其同事報導了靜脈內遞送凋亡細胞誘導了移植物抗宿主病鼠模型的TGF卩依賴性Treg細胞增殖(Kleinclauss等(2006))。人體內，在用ECP治療的實體器官移植患者中觀察到CD4+CD25+細胞上調(Lamioni等(2005))。我們提出，ECP處理細胞可驅動體外產生Treg(Strobl等(2006))。Treg通過主動抑制免疫應答而保持外周耐受(peripheraltolerance)(Tang等(2006))。ECP處理細胞與幼稚人T細胞共培養6-8天導致形成能夠抑制MLR的T細胞增殖和IFNy產生的T細胞群體。有關詳情見圖7。ECP產生的Treg表現出無反應性表型，這可通過加入IL-2而逆轉。實施例8全身應激反應和ECP誘導的免疫耐受由通過浸潤胰島的T細胞和巨噬細胞而被自身免疫破壞的產胰島素的胰腺P細胞造成T1DM(Barker(2006))。在這種(3細胞的破壞中，一個關鍵因素是免疫耐受被破壞。目前有多種正被測試的靶向致糖尿病T細胞應答的免疫抑制療法。臨床研究中表明，靶向T細胞的環孢菌素、hOKT3Yl(Ala-Ala)、抗CD3和雷帕黴素在T1DM患者的具有功效(Staeva-Vierira等(2007))。然而，許多這類策略，誘導慢性免疫抑制或具有限制其用途的有關毒性。誘導耐受，特別是控制自身反應性T細胞的療法是預防T1DM的一個有吸引力的選擇(Battaglia等(2006))。體內靶向Treg作用的治療策略特別提供了有吸引力的治療選擇。現已證實，ECP作為低水平環境應激物起作用，引起類似於急性期反應的反應。這種情況下ECP的治療作用起於"應激性條件反射"的形式，其中ECP誘導適應性反應以防止額外的損傷，並有助於恢復。儘管1型糖尿病和2型並唐尿病有共同的致病終點(disease-causingendpoint)(例如卩細胞凋亡)，但是不同的因子驅動著糖尿病各種表現的最終結果(Eizirik等(2001)和Cnop等(2005))。環境應激物在這兩種疾病中均發揮作用，這表明了支持應激反應性可改變亞細胞致病過程(Dahlquist(2006)、Ludvigsson(2006)和Knip等(2005))。因此，ECP有效治療由對持續應激不適應而引起的疾病，包括糖尿病。環境和細胞應激物對免疫功能具有重要影響。研究表明，中樞神經系統(CNS)調節免疫應答、胰腺功能和細胞對致糖尿病因子的易感性，這表明了全身應激反應與細胞效應之間的緊密聯繫(Flesner(2005)、Ader等(1992)、Morrell等(1988)和Coskun等(2004))。已充分證明了免疫系統和中樞神經系統之間的聯繫，並且最常通過慢性應激對免疫的抑制作用來進行說明。然而，被遺忘的是"炎症反射(inflammatoryreflex)"難以接通的連接，感染和組織損傷籍此急性激活或戰或逃反應(fightorflightresponse,應急反應)的組分，短暫提高先天免疫(Baumann等(1994)和Baumann等(1990))。主要調節系統間的這種相互影響為功能失常和疾病提供了機會，但是也為幹預和治癒提供了機會。在這一部分中，我們提出了ECP可調節全身應激反應系統，從而改變免疫功能的證據。原始型全身應激反應包括下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸和其它神經內分泌途徑的活化。這些是了解得十分透徹的過程，導致了可預測的或戰或逃反應的全身反應。這些途徑的活化最常被視為是對外部刺激(例如捕食的搏鬥或逃跑)的響應，當應激物出現在內部時，這些途徑的活化基本相同。例如，通過心理感知(和錯誤感知(misperceptions))的神經內分泌應激反應的活化可產生與假定的叢林中的聊子相同的生理反應，並以相同方式影響免疫系統(Rohleder等(2006)、Jara等(2006)、Leonard(2005)和Gold等(2005))。應激和炎症是能量密集過程。我們研究了ECP治療對小鼠能量代謝的內分泌標記的影響。我們在Luminex平臺上進行了多項免疫測定，同時分析了59種分析物。與應激性條件反射假設一致，多種分析物的循環濃度以劑量依賴的方式受ECP的影響，隨治療方案而變化。在肺炎小鼠模型中進行了大量的工作，其中測定了ECP"預治療"作為預防法用於預防由隨後的抗原攻擊而引起的炎症。在這項研究中，動物被敏化，隨後用OVA攻擊以誘導哮喘樣反應。炎症攻擊(inflammatorychallenge)後72小時(例如最後一劑ECP處理細胞後96小時)進行生理測定和組織釆集。測定了各種ECP方案減輕炎症的能力。如之前的圖2所示，ECP導致該模型氣道高反應性和肺部炎症細胞劑量依賴性的減輕。圖8表示獨立實驗的結果。在敏化與攻擊之間22天的時間內，一周一次按50x106個ECP處理細胞的劑量在不同時間給予。這裡所有3個ECP方案作為預防性療法在不同程度上均有效，這反映在生理和炎症病理的若干不同測定中。預料不到的是，ECP誘導的炎症生物標記i普的變化類似於急性期反應(APR)。血清C反應蛋白(CRP)、生長激素(GH)、馮維勒布蘭德因子(vonWillebrandfactor,vWF)和觸珠蛋白均以ECP依賴的方式發生改變。雖然沒有顯示，但是受ECP影響的還有在響應組織損傷、感染和其它應激物時上調的陽性急性期蛋白(APP)瘦蛋白、白血病抑制因子(LIF)、胰島素和血纖蛋白原(Baumann等(1994))。瘦蛋白除了在調節脂肪質量和飽感中的作用外，還是推定的促炎脂肪因子(adipokine)(Materese等(2005))。其它已知的被全身炎症反應改變的促炎蛋白、血管活性蛋白和止血蛋白，包括組織因子(TF)、因子VII(F7)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，都顯示對ECP作出反應。從這些數據來看顯而易見的是，所有ECP方案都影響這些APP,而且給予ECP的時間十分關鍵。當剛好在OVA攻擊前連續數天給予時，比起延長到每文化和攻擊之間3周時間內給予，相等細胞劑量的4次治療對生物標記的影響較大。引人注目的是，在OVA攻擊當天和隨後兩天治療小鼠，對這類ECP生物標記的大多數具有最大的影響。有趣的是，在敏化後11天以內給予最多6次劑量的ECP,較早方案的生物標記譜，與一周一次方案的(不論治療次數)沒有區別。此外，這些生物標記譜類似於APR。對血清生物標記的類似細胞劑量依賴性作用和方案依賴性作用也在其它炎症性疾病小鼠模型中重現。這些模型包括接觸性超敏反應、低劑量LPS、同種異體氣管環移植、甚至健康小鼠，其多樣性表明這是由ECP而不是由指定模型炎症攻擊導致的普遍現象。可預期APR增加代謝需求，因此，我們將焦點集中在反映代謝增強的有關APP生物標記上(Richardson等(2003))。在肺炎;f莫型中，對已知調節APP表達的胰島素和胰高血糖素(另一種APP)進行了測定(Campos等(1992))。與未治療小鼠相比，在鼻內OVA攻擊72小時後，ECP治療小鼠的血清胰島素和胰高血糖素降低(圖9，n=18-21，p分別<0.01和<0.05)。在OVA攻擊72小時後，ECP誘導的生物標記譜與陰性對照的沒有不同，而未治療動物則顯示胰島素和胰高血糖素均升高。與治療相關的炎症減輕的同時產生的這些生物標記譜，引導我們提出攻擊後72小時，樣品反映了該模型治療組的恢復期，其中ECP治療動物的恢復比對照的恢復更快。通過同一模型較早時間點採樣直接檢驗了這一理論(圖10)。這些結果表明，與陰性對照相比，ECP誘導增加循環胰島素(左圖)和胰高血糖素(右圖)。相對於陰性對照動物，這些分析物在陽性對照和ECP治療動物中先後升高。如圖9所示，ECP治療小鼠中，兩個生物標記72小時後返回到基線，但是此時在未治療對照動物沒有觀察到消退跡象。這種對能量代謝具有相反作用的兩種胰腺激素的同時升高最先看起來相互矛盾。普遍認為胰島素是合成代謝激素，而胰高血糖素則通常被視作分解代謝的內驅力。1970年代初期的報告證實，胰島素和胰高血糖素間的協同作用有助於大鼠從部分肝切除術中恢復，隨後的研究表明，在內毒素輸注或盲腸結紮穿孔術(兩個膿毒症模型)後，腎上腺素、去曱腎上腺素、胰高血糖素和皮質酮的血漿濃度升高(Bucher28等(1973))。這些模型中血漿胰高血糖素的升高稍後與TNF-ouIFN-y和IL-6的出現有關，因此提出，炎症期間胰高血糖素可以改變肝葡萄糖代謝以控制血糖過高和組織葡萄糖攝取增加的同時需要(Bucher等(1975》。也已知LPS和細胞因子增加瘦蛋白分泌(54)。我們研究了血清痩蛋白，觀察到它的增加，雖然在該模型中較遲的峰值保持升高至少一周(圖11)。這些對血清瘦蛋白的ECP依賴性作用也類似於APR。我們接著研究了圖10中所述相同樣品中的瘦蛋白譜以測定瘦蛋白釋放的時程。同樣，未治療小鼠和ECP治療小鼠兩者中瘦蛋白增加超過基線。與已發表的譜一致，APR中的瘦蛋白峰比在早期應答基因如IL-ip和TNFa的峰遲一些(Bomstein等(1998)和Granowitz等(1999))。因此，在炎症及其消退期間，這些內分泌僅僅起反映所消耗的能量的作用，換句話說，不是基於機制的結果，這些發現僅僅是ECP活性的間接結果。雖然據稱胰島素是抗炎激素，但是GH和瘦蛋白的增加似乎與抗炎治療反應不一致(Viardot等(2007))。這促使我們考慮替代假說。鑑於這些數據，我們提出ECP本身誘導輕微短暫的可能用作治療性"條件反射性應激(conditioningstress)"的促炎作用，它不會不同於APR。這是根據實驗提出的。將ECP處理細胞輸入健康小鼠體內，對同樣的生物標記進行了分析。圖12中的結果表明，與陰性對照相比，ECP治療小鼠的胰島素、瘦蛋白和胰高血糖素升高。這些變化的時程表明，治療後24小時出現峰濃度，48小時內消退幾乎完成。這不同於炎症模型所觀察到的時程，其中最後一次ECP治療後48小時出現ECP誘導的變化峰值。皮質醇(CORT，齧齒動物為皮質酮)是與APR的瘦蛋白有關的另一種急性期反應物(Faggioni等(1999))。在該項實驗中還測定了CORT,與其它三種生物標記相繼升高。皮質類固醇釋放如本文所述是或戰或逃反應被激活的典型徵兆(Harbuz(2002))。因此，CORT為全身應激反應和中樞神經系統提供了關鍵的連接處，這就表明了將AC輸注到外周循環影響許多不同組織和疾病的機制。為了證實這些標記與ECP作用機制之間的這種聯繫，我們接著研究了健康小鼠中生物標記劑量-反應的關係。圖13表示輸注不同數量的AC對CORT(左圖)、胰島素(中圖)和瘦蛋白(右圖)的作用。所有樣品都在ECP後24小時採集。與其它最接近機制的(mechanism-proximal)生物標記一起出現，這些激素變化與暴露成比例，在此反映在細胞劑量中(Colburn(2003))。因此，我們提供了小鼠中ECP誘導全身應激反應的證據，這使人聯想到經典的或戰或逃反應和急性期反應。在下一個部分中，我們將ECP與細胞應激反應聯繫在一起，並提供ECP誘導的應激性條件反射的機理模型。實施例9聯繫ECP與應'JL^應的分子和細胞證據全身應激物可影響器官、組織和細胞改變這一理念的固有性質是全身應激通過該機制誘導修復反應。大量證據表明，應激激素在響應或戰或逃刺激時影響能量代謝，從不太重要的系統中重新分配現成的能源。這些對兒茶酚胺和其它應激介質的全身反應起因於細胞水平上受體介導的事件，導致了生物水平上的適應性變化。各個細胞以反映全身應激反應的方式對局部環境改變作出反應。細胞在其能源利用和資源分配上作出重大改變以最好地適應給定的工丈擊，該攻擊可稱為亞細月包或戰或逃反應(sub-cellularfightorflightresponse).前一個戰略途徑導致細胞適應，由此結構和功能改變為"參戰，，以適應新改變的環境需要。後者(逃跑)誘導細胞警報信號，導致局部或全身炎症。除了修復程序外，這些反應還可誘導不能適當做出調整的細胞的凋亡性死亡(Marciniak等(2004))。這種形式的"逃跑"4吏得其資源可利用於生物的重建過程。這種反應的全身形式為短期錯誤留下空間，但是細胞在這一方面極為保守。即使在通過損傷反應限制點時的略微延遲都會引起正常細胞的凋亡。這被稱作細胞生物學的武士法則(Samurailaw)，該法則即"寧死忽錯，，(Skulachev(2001))。為了維持穩態，這些修復和對ECP的適應性反應必須發生在每個受累細胞中，在發覺應激誘導的環境改變時4吏發生。無法達到兩個穩態終點中的任一個則是糖尿病和其它'隄性病的根本原因(Marciniak等(2006))。蛋白質翻譯的過程，特別是核糖體生物發生(ribosomebiogenesis)和肽延長，是細胞中能量最密集的過程之一。為了參與應激和嘗試修復，細胞通常抑制"非必需"蛋白質的翻譯，轉變成分解代謝能量利用，為生物合成能力的提高打下基礎。.鑑於節約性質，面臨正常環境資源波動，執行這個功能的系統似乎很可能面臨應激物時起維護穩態的額外作用。已鑑定出至少3個營養l丈感性系統(nutrient-sensitivesystem)完成這個任務。由哺乳動物雷帕黴素靶(mTOR)介導的依賴ER的未摺疊蛋白反應(UPR)和不依賴ER的反應，以及己糖胺生物合成途徑(HBP)在響應不同應激物時^3敫活。在這個部分中，我們描述了這些途徑，並介紹了表明它們在ECP活性中的證據。未摺疊蛋白反應蛋白質摺疊性疾病如T1DM由細胞應激反應，尤其是進化上保守的"未摺疊蛋白反應"(UPR)的功能障礙所導致(Harding等(2004))。這個定型程序(stereotypicalprogram),有時稱為內質網(ER)應激反應，由ER定居蛋白驅動，通常能夠回復到細胞穩態。這個過程當在指定組織的受累細胞中重複時，可驅動該組織從環境危害中恢復。UPR在健康組織中也起作用，因為對正常細胞需求增加的外部信號可啟動UPR。例如，抗原與B細胞受體急性結合可激活細胞並驅動其發育和發展成分泌抗體的漿細胞。這就需要細胞生物合成機器較大的"重新組配，，，並用作啟動UPR的應激物(Iwakoshi等(2003))。UPR是快速反應系統，介導真核起始因子2a(EIF2a)的磷酸化以抑制翻譯(Harding等(2003))。翻譯機器的這個組分是啟動"帽依賴性翻譯(cap-dependenttranslation)"所必需的，所述帽依賴性翻譯驅動大多數細胞蛋白的產生(Kozak(1999))。一個基因亞型由不依賴帽的系統翻譯，該系統使用內部核糖體進入位點(IRES)翻譯mRNA(Hellen等(2001))。這種IRES翻譯存在於驅動UPR的基因中，所述基因通常編碼生物合成酶、跨膜通道和增加原料可利用性的轉運蛋白、涉及翻譯和翻譯後質量控制和抗氧化防禦系統的蛋白質(Komar等(2005)和Lin等(2007》。至少4個截然不同的途徑導致EIF2a的磷酸化以啟動UPR的不同組分。例如，上調抗氧化能力和某些下遊UPR反應基因是由被稱為整合應激反應(ISR)驅動的，並且是由轉錄激活因子4(ATF4)介導的。PERK，是一種驅動抑制帽依賴性翻譯的使EIF2a失活的激酶，導致在非必需蛋白質的翻譯和摺疊中ATP的需求降低。IRE1和ATF6啟動其它額外的UPR反應以上調參與蛋白質二級結構調節和錯摺疊翻譯產物降解的特定基因。極端急性ER應激或這些途徑的長期活化，如過載或其它應激的胰腺(3細胞一樣，通過多條不同的途徑導致ER依賴性細胞凋亡(Szegezdi等(2006))。面臨持續ER應激時無法進行這些修復和凋亡的事件可能是UPR疾病病理的重要因素。本申請的一個目的是更好地理解UPR在體外免疫耐受調節中所起的作用。HBP和mTOR是介導不依賴UPR的細胞應M應的營養應激傳感器和環境應激傳感器帽依賴性翻譯也受不依賴於UPR信號的其它應激反應信號轉導途徑的調節。值得注意的是，大多數對翻譯的替代作用由mTOR(亦稱雷帕黴素耙(TargetofRapamycin))介導，mTOR是一種對控制細胞生長和增殖十分重要的磷脂醯肌醇3-激酶相關的蛋白激酶(Sarbassov等(2005))。mTOR位於多個營養和生長因子感知信號轉導途徑的下遊，並且控制著蛋白質生物合成機器的關鍵組分，以改變細胞大小和分裂、核糖體生物發生和營養利用。通過mTOR的翻譯起始複合物關鍵組分的磷酸化可使帽依賴性翻譯繼續進行。mTOR信號轉導的營養敏感和應激敏感性質在確保細胞過程與其環境適當匹配中起著關鍵作用。已知營養敏感性途徑改變mTOR活性或者其靶標的定位，使翻譯調控的複雜性提高到另一水平。上遊信號包括Akt和AMPK,Akt是一種胰島素和生長因子受體的存活激酶效應物，而AMPK是細胞的能量供應量傳感器(Reioling等(2006))。圖14表示將AC吞噬與mTOR信號轉導聯繫起來的證據。將DC按不同的AC:DC比率(沿橫坐標標註)與AC共培養。將細胞培養不同的時間，通過流式細胞術測定衡量mTOR活性的S6激酶磷酸化(Hinton等(2004))。兩個圖都顯示出iDC和mDC的細胞劑量依賴性影響。有趣的是在這些反應中，存在顯著的依賴DC成熟狀況的差異。UPR和mTOR途徑受營養可利用性的直接影響，並且受應激的間接影響(Carreterp等(2007))。己糖胺生物合成途徑是第三個這樣的系統。HBP按與葡萄糖胞內濃度成正比地被激活(Love等(2005))。HBP活化的最終結果，即具有O-GlcNAc修飾的蛋白質增加，導致了與糖尿病相關的症狀(Amdra等(2007))。因此，細胞利用該途徑可以感知胞內葡萄糖可利用性和各種細胞應激物並對其作用反應。HBP活化的一個結果是適應。HBP驅動這一反應並且介導應激性條件反射。通過營養感知途徑的應激性條件反射應激物和葡萄糖增加HBP活性，並且增加對隨後應激的耐受性(Zachara等(2004))。穀氨醯胺果糖-6-磷酸醯基轉移酶(Giutamine:fructose-6-phosphateamidotransferase，GFAT)是HBP中的第一個和限速酶，在葡萄糖和飽感感覺中起作用(Cooksey等(2002))。GFAT介導產生的UDP-N-乙醯葡糖胺(UDP-GlcNAc)提供了用於蛋白質翻譯後N-連接和O-連接的糖基化的必需前體(Buse(2006))。一種這樣的反應包括將單糖GlcNAc加到成熟蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基上。這是由O-GlcNAc轉移酶(OGT)驅動的，該酶是HBP中的關鍵酶，既可改變蛋白質的三級結構，又可限制接近這些Ser/Thr殘基和蛋白激酶的鄰近位點(Yang(2005))。這些事件可引起參與某些信號轉導級聯的OGT底物的調節，並且改變其在細胞中的定位。後一結果是由蛋白質間相互作用的改變，特別是與凝集素和細胞蛋白伴侶相互作用的改變所致(Guinez等(2004))。這可影響其參與基因調節和/或翻譯的能力。這種情況的主要實例見於HBP活化對蛋白酶體活性和對各種轉錄因子定位的抑制作用(Gao等(2003))。血糖過高增加HBP活性，並且增加胰腺轉錄因子NeuroDI的O-GlcNAc含量。這就影響NeuroDI的定位，因此，增加了胰島素基因轉錄。雖然還沒有HBP和UPR之間直接關係的描述，但是HBP可至少間接地改變翻譯。已經表明HBP改變mTOR的信號轉導下遊，影響a4的細胞定位。該蛋白質是mTOR底物，它與某些磷酸酶形成複合物，並且調節磷酸酶以調控p70S6激酶和JAK/STAT信號轉導途徑的組分(Dauphinee等(2005))。由於a4缺乏核定位信號，因此它在胞質和細胞核之間的分布受蛋白質之間相互作用的控制。這些相互作用的中斷隨HBP活化所導致的修飾而發生，使a4保留在胞質中，並且不能調節翻譯。這些營養感知系統對應激很敏感，並且像UPR—樣，可以改變使資源需求和資源可利用性相匹配的細胞功能。在與ER應激反應系統的其它相似性中，mTOR和HBP的瞬時調節防止隨後的應激物影響。例如，多種應激物體外改變HBP活性，HBP活化的藥理模擬物具有適應性條件反射作用。最新研究表明，雷帕黴素極可能通過其對p70S6激酶和自體吞噬的作用，也誘導預先條件反射作用，防止隨後的促凋亡應激物的影響(Ravikumar等(2006))。這尤其適於與HBP和mTOR活性兩者相關的糖尿病(Marshall(2006))。mTOR途徑佔據了營養介導的信號的關鍵控制點，並且在胰腺發育和胰腺功能中起作用(Bussier等(2006))。採用MLR獲得了將營養/應激反應與免疫功能聯繫起來的更多證據。我們分別採用已知抑制HBP中的兩個關鍵酶，即OGT和O-GlcNAc選擇性N-乙醯基-P-D-葡糖苷酶(O-GlcNAc酶)的藥物，這兩種酶分別在蛋白質上添加和脫去O-GlcNAc部分。我們研究了在鏈脲佐菌素(STZ)或PUGNAc存在下的MLR,鏈脲佐菌素(STZ)和PUGNAc是兩種抗生素，已知這兩種抗生素抑制O-GlcNAc酶並且增加具有O-GlcNAc修飾的細胞蛋白質的量(Arias等(2004))。在兩種情況下，抑制劑使ECP更有效，提高AC的耐受性質。這發生在遠低於對於DC和T細胞的毒性範圍的藥物濃度下。圖15表示採用PUGNAc的結果。該藥物在所有所測劑量下對MLR本身沒有明顯作用，反映在該測定中沒有抑制增殖。然而，當加入AC時，ECP誘導的"致耐受性，，比典型AC反應(30。/。抑制，參見OmMPUGNAc結果)增加高達約50°/。。採用另一種O-GlcNAc酶抑制劑STZ也重現了這個結果。當採用阿脲抑制相反酶(opposingenzyme)OGT時，觀察到HBP涉及免疫功能的更多證據(Alk,圖16)。與PUGNAc相比，阿脲對MLR具有相反作用，並有差別地影響mDC和iDC。引人注目的是，當iDC用作APC時，Allx可再現地促進MLR的增殖(左圖)。當使用mDC時，阿脲對MLR基本無作用(未顯示)。作為衡量存活力的alamar藍還原的其它初步數據分析表明，Allx在所測定範圍內誘導培養T細胞的增殖加強(圖16,右圖)。參見表l。表l:受ECP影響最大的轉錄物一覽表tableseeoriginaldocumentpage36為了深入了解ECP的細胞和分子作用機制，我們採用Affymetrix基因表達陣列和標準生物信息學方法研究了小鼠炎症模型各種組織中的mRNA譜。在次級淋巴器官中，我們觀察到一組基因的表達發生顯著變化，所述基因通常作為程序性細胞應激反應部分而發生改變。如表1中所示，在最後一次AC輸注後96小時，ECP改變涉及代謝途徑的基因、涉及蛋白質合成和加工的基因的表達，並且改變應激反應途徑(例如O-GlcNAc酶)。這就進一步表明，應激反應途徑通過ECP改變，但是需要另外的實驗來評價各個基因在ECP反應中的作用。實施例10治療性應激性條件反射蛋白質摺疊性疾病包括最普遍的慢性疾病，並且與較高程度的發病率和死亡率有關(Xu等(2005))。用於大多數這類疾病的有效治療大部分由於我們對疾病的根本病因了解甚少而受到局限。越來越清楚的是，蛋白質摺疊性疾病的多種虛弱性以及最終致命的結果包括炎性組分(Yoshida(2007))。現有療法通常旨在限制炎症而不能改變其根本病因。在UPR病及其併發症的情況下，該方法主要的實例包括類固醇、NSAID和抗細胞因子療法。最新的策略很可能將靶向炎症的根本病因(例如防止蛋白質聚集或加快其清除)(Boyce等(2005))。即使不是所有這些療法，但大多數將採用具有相關系統毒性(systemictoxicity)的外源治療化合物或生物材料。ECP提供了新的方法，其中應用內部資源以從根本上改變引發疾病的功能障礙及由其所引起的炎症。我們4艮設ECP可通過其改變應激反應途徑的能力，來預防和消除應激相關UPR疾病的併發症。增強細胞的應激能力使得它能夠進行修復，並清除其受損的細胞組分，而且可有助於消除疾病(Badin等(2006))。已經證實，採用過量表達的熱休克蛋白或"化學伴侶(chemicalchaperone)"以協助錯摺疊蛋白質的分泌，通過化學方法改善細胞環境以改進ER功能(Imaizumi等(2001))。儘管這些策略在蛋白質過量表達系統和細胞系中獲得了成功，但是通常對於給定的錯摺疊蛋白必須使之最優化。應激性條件反射方案提供了更全面的方法，募集各種細胞修復系統，同時釋放出不同類型的細胞應激。細胞應激反應系統的同時操作是已確立的實驗性療法。二十多年的研究僅缺血性條件反射一項就已發表了遠超過4000篇的論文。一過性缺血是最常被研究的條件反射方案，實驗表明在心血管醫療、神經病和實體器官移植中具有功效(Kuntscher等(2005))。這些研究表明，可通過用短期缺血和恢復的前處理或後處理，顯著降低缺血-再灌注(1/R)損傷。該方法仍在實驗中，但是其價值得到流行病學的支持，因為如果分別先發生一過性缺血攻擊或不穩定心絞痛，則在中風或心肌梗死後觀察到組織損傷減輕(Liberato等(2005))。當採用異源應激物時，條件反射方案也同樣具有治療價值，這表明了任何治療性條件反射方案均可提供不受各種各樣的應激物影響的保護。引人注目的是，研究還表明，遠端器官或組織的條件反射可為整個生物提供保護(一種稱為遠程條件反射(remoteconditioning)的作用)。在心臟手術臨床實驗中，對條件反射進行了研究，但是被醫師採用的機會非常有限，極有可能是因為現有調節藥物(即條件反射藥物)和方法的內在危險所致。ECP用作應激性M反射方案反映治療反應的時間控制、免疫功能的保持和患者體內Treg產生的臨床經驗表明，ECP為減輕炎症提供了新的治療方法。本文所述的初步數據提示，ECP的治療作用通ii用作低水平應激物而誘導適應性反應。藥理和生化證據表明，全身應激反應系統和亞細胞應激反應系統(一些是新的)調節免疫耐受。因此，ECP誘導的"應激性條件反射"利用已被充分描述的細胞、器官和生物體的適應性現象和習慣。條件反射提供了對隨後更強烈的應激物的保護，並可誘導細胞和組織結構和功能長期持久的保護性改變。這些持久的變化，除保護不受隨後應激的影響以外，還可極大地影響病程，加速修復過程。由該4li殳推斷出某些預言，這包括了增加細胞和生物對各種應激物的耐受性。我們已經證實，在哮喘、接觸性超敏反應和器官移植的肺模型中，ECP保護小鼠不受抗原性攻擊。對化學應激的耐受性，特別是STZ的致糖尿病作用(圖17，左圖)引人注目地拓展了ECP治療用途。我們證實，在細胞水平上，與未處理對照相比，用AC預處理DC更能耐受茴香黴素誘導的核糖體毒素應激(圖17，右小圖)。因此，ECP表現出限定預先條件反射方案的特徵。值得注意的是，上述NOD/LtJ數據表明，即使在嚴重胰腺損傷發生後，ECP也具有保護作用。這些實驗為採用ECP的條件反射後提供了實例。以上現象當合起來考慮時，表明應激性條件反射作為UPR疾病的新的治療方法的潛在價值。如果ECP如我們認為的那樣是應激性條件反射療法，則它將在預防和治療應激誘導的疾病中具有不可估量的功效。在我們認識到聯繫若干完全不同的研究領域的交匯處時，我們提出了這個新的構思。特別是最近出版物，將細胞水平的應激性條件反射與上述細胞和全身應激反應聯繫在一起。在一項研究中，例如，針對各種應激物對巨噬細胞系進行預先條件反射，提高了存活力，並保持了培養物的功能(Lu等(2004))。這與上述UPR-HPA軸交匯處相結合，表明了改變細胞應激反應除了分析病理的根本病因外，還可防止隨後攻擊的影響。條件反射效應可由免疫細胞介導已經十分確定的是，免疫細胞是缺血性損傷的致病介質，然而，它們在缺血性預先條件反射中的作用仍不清楚。將脾細胞從缺血性預先條件反射小鼠過繼轉移到T細胞缺陷型接受者體內，保護了受體小鼠免受隨後的缺血性損傷(Ascon等(2006))。這些研究強有力地表明，免疫細胞是保護性缺血性預先條件反射應答的介質。在該項研究中，沒有鑑定出保護性細胞。然而，如上所述，由於全身應激反應而存在產生Treg的先例(MacConmara等(2006))。因此，有理由提出在最初缺血後啟動了調節T細胞群體，使得轉移的Treg能在接受者體內提供保護作用。實施例11血小板反應蛋白-l將應M應、Treg和ECP聯繫起來血小板反應蛋白-1(thrombospondin-l,TSP-1)是一種有助於組織結構和細胞功能產生的基質細胞蛋白(matricellularprotein),在大多數響應損傷或組織損害、生長因子、營養條件和各種環境應激物的細胞中被極大地上調(Murphy-Ullrich(2001))。一般認為基質細胞蛋白，包括TSP-l,為細胞提供有關其環境的縱向信息。這在免疫功能中是十分重要的，因為由抗原呈遞細胞和T細胞分泌並調節抗原呈遞細胞和T細胞的TSP-1是有效的抗炎蛋白(Doyen等(2003))。TSP-1的免疫調節性質，結合TSP-1是由響應應激的細胞分泌的事實，決定了該分子在應激和免疫力之間的位置。在此我們提出TSP-1是ECP的潛在效應物。TSP-1在APC中與CD36結合，在T細胞中與CD47和a鄰l結合(Chen等(2000))。TSP-1提高吞噬細胞吞噬凋亡細胞的能力，抑制其成熟及產生促炎細胞因子的能力。研究表明在T細胞中，TSP-1下調TCR信號轉導以及對IL-12的反應(Li等(2002))。TSP-1是TGF卩的主要生理激活物，最新研究表明在被激活的人CD4+CD25-T細胞中誘導Foxp3+Treg表型(Grimbert等(2006))。Treg誘導可包括和消退炎症及其損傷。在TSP-1失效小鼠中觀察到傷口癒合推遲，抗炎反應降弱，TGF卩水平降低(Agah等(2002))。在胰腺中，胰島細胞表達TSP-1，TSP-1失效小鼠表現出炎症、胰島細胞增生和腺泡發育不全，所有這些都是由於缺乏TGFP活化造成的(Crawford等(1998))。用TSP-1衍生肽經全身治療的TSP-1失效小鼠的胰腺恢復到較為正常的表型。這些觀察結果表明，TSP-1是胰腺發育的重要調節因子，可能對於該微環境內的免疫和外分泌過程十分重要。有趣的是，在Zucker糖尿病大鼠血管系統中，最近將高血糖症與TSP-1的表達聯繫起來(Raman等(2007))。已將TSP-1的上調與HBP直接聯繫在一起，TSP-1表達與葡萄糖濃度成比例。鑑於這些數據，非常有可能的是TSP-1調節療法可幹預疾病(如糖尿病)的病理進程。我們和其它研究人員已經證實，TSP-1從凋亡細胞中大量分泌。如圖18所示，在ECP處理PBMC後，觀察到TSP-1按細胞劑量依賴性的增加。單核細胞分泌大量的產生於ECP處理的PBMC懸液中TSP-1，阻斷TSP-1活性降低了ECP驅動Treg產生的能力。這與我們的研究結果相一致，其它未發表的結果表明，單核細胞是體外產生Treg必不可少的。同圖7—樣，圖19表示從用幼稚T細胞ECP處理的PBMC共培養物中分離的T細胞表現出耐受性表型。然而，如果該共培養物包括中和的抗CD36或抗CD47單克隆抗體，這兩者單用或聯用，則耐受性表型被鈍化。我們最近研究了TSP-1是否是介導由ECP體內驅動的免疫作用所必需的，我們建議研究糖尿病模型中TSP-1是否在ECP保護的卩細胞功能中起作用。參考文獻:tableseeoriginaldocumentpage41表j正).Jbwwa/o/z>WMW"o/ogy(jBa〃/more,177:3380-3387Badin,R.A.,M.F.Lythgoe,L.vanderWeerd,D.L.Thomas,D.G.Gadian和D.S,Latchman.2006.NeuroprotectiveeffectsofvirallydeliveredHSPsinexperimentalstroke(病毒傳遞的HSP在實驗性中風中的神經保護作用)./(w朋/o/cere6ra/flw/wetoZjofc/w26:371-3816Barker,丄M.2006.Clinicalreview:Type1diabetes-associatedautoimmunity:naturalhistory,geneticassociationsandscreening(臨床綜述1型糖尿病相關自身免疫自然史、遺傳關聯和篩選).JC//"五"^cn'"o/Meto691:1210-12177Ban等(1998)Photopheresisforthepreventionofrejectionincardiactransplantation(用於預防心臟移植排斥的光除去法).PhotopheresistransplantationStudyGroupNEnglJMed339:1744-518Battaglia,M.和M.G.Roncarolo.2006.InductionoftransplantationtoleranceviaregulatoryTcells(通過調節T細胞i秀導移植耐受性)./"y7ofww力/ergyZ>wgrarg">y5:157-1659Baumann,H.和丄Gauldie.1994.Theacutephaseresponse(急性期反應).7mmw"o/7Wa_y15:74-8010Baumann,H.,G.P.Jahreis和K.K.Morella.1990.Interactionofcytokine-andglucocorticoid-responseelementsofacute-phaseplasmaproteingenes.Importanceofglucocorticoidreceptorlevelandcelltypeforregulationoftheelementsfromratalpha1-acidglycoproteinandbeta-fibrinogengenes(急性期血漿蛋白基因的細胞因子應答元件與糖皮質激素應答元件的相互作用。糖皮質激素受體水平和細胞類型對於調節得自大鼠al-酸性糖蛋白和卩-血纖蛋白原基因的元件的重要性).J歷o/C/zew265:22275-2228111Bornstein,S.R.,H.L.Preas,G.P.Chrousos和A.F.Suffredini.1998.Circulatingleptinlevelsduringacuteexperimentalendotoxemiaandantiinflammatorytherapyinhumans(人急性實驗性內毒素血症和抗炎療法期間的循環瘦蛋白水平).J/"/e"ZXs178:887-89012Boyce,M.,K.F.Bryant,C.Jousse，K.Long,H.P.Harding,D.Scheuner，R.J.Kaufinan，D.Ma,D.M.Coen，D.Ron和J.Yuan.2005.AselectiveinhibitorofelF2alphadephosphorylationprotectscellsfromERstress(elF2a去磷酸化的選擇性抑制劑保護細胞免於ER應激).Sconce307:935-93913Bucher，M.L.和M.N.Swaffield.1975.Regulationofhepaticregenerationinratsbysynergisticactionofinsulinandglucagon(通過胰島素和胰高血糖素tableseeoriginaldocumentpage43tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45tableseeoriginaldocumentpage46素抵抗的Zucker肥胖大鼠中針對缺血-再灌注損傷的心肌預先條件反射被破壞)爿wJP/yw'o/ie^w//"feyCowpP/"/o/2006年9月28日；[印刷前的電子出版物]50Khan等(2006)Rapamycinconferspreconditioning-likeprotectionagainstischemia-reperfusioninjuryinisolatedmouseheartandcardiomyocytes(雷巾白黴素賦予分離的小鼠心臟和心肌細胞預先條件反射樣保護以抵抗缺血_再灌注損傷)JMo/Ce〃CaW/o/41:256-6451Kleinclauss，F.，S.Perruche,E.Masson,M.deCarvalhoBittencourt,S.Biichle，丄P.Remy-Martin，C.Ferrand,M.Martin,H.Bittard,J.M.Chalopin,E.Seilles,P.Tiberghien和P.Saas.2006.IntravenousapoptoticspleencellinfosioninducesaTGF-beta-dependentregulatoryT-cellexpansion(靜脈內輸注凋亡脾細胞誘導TGF-P依賴性調節T細胞擴增).Ce〃Dz;/T^13:41-5252Kneass等(2005)ProteinO-GlcNAcmodulatesmotility-associatedsignalingintermediatesinneutrophils(蛋白質O-GIcNAc調節嗜中性粒細胞的運動相關的信號轉導中間體)J祝o/C/zew280:14579-8553Knip,M.,R.Veijola，S.M.Virtanen,H.Hyoty，O.Vaarala和H.K.Akerblom.2005.Environmentaltriggersanddeterminantsoftype1diabetes(1型糖尿病的環境觸發和決定因素).Dz'a&eto54增刊2:S125-13654Komar，A.A.和M.Hatzoglou.2005.InternalribosomeentrysitesincellularmRNAs:mysteryoftheirexistence(細胞mRNA中內部核糖體進入位點存在之謎).《/^o/Cfem280:23425-2342855Kozak，M.1999.Initiationoftranslationinprokaryotesandeukaryotes(原核生物和真核生物翻譯的啟動).Ge朋234:187-20856Krispin等(2006)Apoptoticcellthrombospondin-1andheparinbindingdomainleadtodendriticcellphagocyticandtolerizingstates(凋亡細胞血小板反應蛋白-1和肝素結合域導致樹突細胞吞噬和耐受狀態)別ood[印刷前的電子出版物]57Krysko,D.V.,K.D'Herde和P.Vandenabeele.2006.Clearanceofapoptoticandnecroticcellsanditsimmunologicalconsequences(凋亡和壞死細胞的清除及其免疫結果).Jpo/to^11:1709-172658Kudlow(2006)Post-translationalmodificationbyO-GlcNAc:anotherwaytochangeproteinftmction(通過O-GlcNAc的翻譯後修飾改變蛋白質功能的另一條途徑)JCe//Bz'oc/ie附98:1062-7559Kuntscher，M.V.,B.Hartmann和G.Germann.2005.Remoteischemicpreconditioningofflaps:areview(瓣膜的遠程缺血性子貞先條件反射的綜述).M'cmswger_y25:346-35260Kwon，G.，C.A.Marshall,K.L.Pappan,M.S.Remedi和M.L.McDaniel.2004.SignalingelementsinvolvedinthemetabolicregulationofmTORbynutrients,incretinsandgrowthfactorsinislets(信號轉導元件通過胰島營養物、腸降血糖素和生長因子參與mTOR的代謝調節).D/a6eres53增刊3:S225-23261Lamioni等(2005)Theimmunologicaleffectsofextracorporealphotopheresisunraveled:inductionoftolerogenicdendriticcellsinvitroandregulatoryTcellsinvivo(揭示體外光除去法的免疫作用耐受性樹突細胞的體外誘導和調節T細胞的體內誘導)7>a";y/7/a"tarion79:846-5062Lamioni,A.，F.Parisi，G.Isacchi，E.Giorda,S.DiCesare,A.Landolfo,F.Cenci，G.F.Bottazzo和R.Carsetti.2005.Theimmunologicaleffectsofextracorporealphotopheresisunraveled:inductionoftolerogenicdendriticcellsinvitroandregulatoryTcellsinvivo(揭示體夕卜光除去法的免疫作用耐受性樹突細胞的體外誘導和調節T細胞的體內誘導).7Vamp/a"to"o"79:846-85063Lehman等(2005)AsinglenucleotidepolymorphisminMGEA5encodingO-GlcNAc-selectiveN-acetyl-beta-Dglucosaminidaseisassociatedwithtype2DiabetesinMexicanAmericans(墨西哥裔美國人中編碼O-GlcNAc選擇性N-乙醯基-P-D-葡糖苷酶的MGEA5單核苷酸多態性與2型糖尿病有關)Z)/。6咖54:1214-2164Leonard,B.E.2005.TheHPAandimmuneaxesinstress:theinvolvementoftheserotonergicsystem(應激中的HPA和免疫軸5-羥色胺能系統的參與).五wr屍^c/n'。W20增刊3:S302-30665Li,Z.，M.丄Calzada,J.M.Sipes，J.A.Cashel,H.C.Krutzsch,D.S.Annis，D.F.Mosher和D.D.Roberts.2002.Interactionsofthrombospondinswithalpha4betalintegrinandCD47differentiallymodulateTcellbehavior(血'J、板反應蛋白與a鄰l整聯蛋白和CD47的相互作用差異性地調節T細胞行為).77zeJowwa/o/ce〃6fo/ogy157:509-51966Liberato,B.,S.Prabhakaran和R.L.Sacco.2005.Evolvingconceptsregardingtransientischemicattacks(有關一過小生缺血-丈擊的進4匕構想).48tableseeoriginaldocumentpage49脈內輸注的同源凋亡細胞誘導抗原特異性調節性T細胞).//wwm"o/174:5968-597676Mahnke,K.,J.Knop和A.H.Enk.2003.InductionoftolerogenicDCs:'youarewhatyoueat'(耐受性DC的誘導"你吃什麼就像什麼").7>e"Aiw卿wo/24:646-65177Marciniak，S.J.和D.Ron.2006.Endoplasmicreticulumstresssignalingindisease(疾病中的內質網應激信號轉導).P/yw'o/化v86:1133-114978Marciniak,S.J.，C.Y.Yun,S.Oyadomari,I.Novoa，Y.Zhang,R.Jungreis,K.Nagata,H.P,Harding和D,Ron.2004.CHOPinducesdeathbypromotingproteinsynthesisandoxidationinthestressedendoplasmicreticulum(CHOP通過促進蛋白質合成和應激內質網的氧化誘導死亡).GewesZ)ev18:3066-307779Marks,D.I.，B.Iannoni，M.A.Coote，T.E.Mandel和R.M.Fox.1991.Preventionofcyclophosphamide-inducedandspontaneousdiabetesinNODmicebysyngeneicsplenocytestreatedwithcytotoxicdrags(NOD小鼠中通過細胞毒性藥物處理的同源脾細胞防止環磷醯胺誘發的糖尿病和自發性糖尿病).Jwto/www"/^11:73-7980Marshall,S.2006.Roleofinsulin,adipocytehormonesandnutrient-sensingpathwaysinregulatingfuelmetabolismandenergyhomeostasis:anutritionalperspectiveofdiabetes,obesityandcancer(胰島素、月旨肪細胞激素和營養感知途徑在調節燃料代謝和能量穩態中的作用糖尿病、肥胖症和癌症的營養前景).S7X￡2006:re781Matarese,G.，S.Moschos和C.S.Mantzoros.2005.Leptininimmunology(瘦蛋白免疫學).J/wm""o/174:3137-314282Mattson等(1999)CellularandmolecularmechanismsunderlyingperturbedenergymetabolismandneuronaldegenerationinAlzheimer'sandParkinson'sdiseases(在阿爾茨海默病和帕金森病能量代謝紊亂和神經元變性下的細胞和分子機制)iV!^c^/5W893:154-7583Matzinger,P.2002.Thedangermodel:arenewedsenseofself(危險模型重建的自我感覺).5We"ce296:301-30584Meloni,F.,A.Cascina,S.Miserere,C.Perotti,P.Vitulo和A.M.Fietta.2007.PeripheralCD4(+)CD25(+)TREGcellcountsandtheresponsetoextracorporealphotopheresisinlungtransplantrecipients(肺移植接受者中夕卜周CD4(+)CD25(+)TREG的細胞計數和對體外光除去法的反應).50tableseeoriginaldocumentpage51mTORture信號轉導)O"coge"e25:6373-638395Richardson,R.A.禾口H.I.Davidson.2003.Nutritionaldemandsinacuteandchronicillness(急性和慢性疾病中的營養需求)/Voc7W/fr5bc62:777-78196Rohleder,N.和A.Karl.2006.Roleofendocrineandinflammatoryalterationsincomorbidsomaticdiseasesofpost-traumaticstressdisorder(內分泌和炎寸生改變在創傷後應激障礙的共病性軀體疾病中的作用).M^erva￡wfoc77-m^31:273-28897Sarbassov,D.D,，S.M.Ali和D.M.Sabatini.2005.GrowingrolesforthemTORpathway(對於mTOR途徑的延伸作用).CwrrO//"Ce〃歷o/17:596-60398Skulachev，V.P.2001.Theprogrammeddeathphenomena,agingandtheSamurailawofbiology(程序性死亡現象、衰老和生物學武士法則).Ex/GeTO"to/36:995-102499Staeva-Vieira,T.,M.Peakman和M.vonHerrath.2007.TranslationalMini-ReviewSeriesonType1Diabetes:Immune-basedtherapeuticapproachesfortype1diabetes(1型糖尿病譯文小型綜述系列用於1型糖尿病的基於免疫的治療方法).￡x/Twwww/148:17-31100Stampfer(2006)CardiovasculardiseaseandAlzheimer'sdisease:commonlinks(心血管疾病和阿爾茨海默病的共同之處)J7WemMed260:211-23101Strobl,F.，J.Huber，A.Krutsick,K.Campbell和D.Peritt.2006.卯PhotopheresisstimulatesthegenerationofregulatoryTcells(90光除去法刺激調節T細月包的形成).Jownw/o///eaWa"c丄wwg7Va"印/""torto"25:74-74102Suri,A.，B.Calderon,T.J.Esparza，K.Frederick,P.Bi加er和E.R.Unanue.2006.Immunologicalreversalofautoimmunediabeteswithouthematopoieticreplacementofbetacells(無需更換造血系統卩細胞的自身免疫性糖尿病的免疫逆轉).5W證311:1778-1780103Szegezdi,E.，S.E.Logue，A.M.Gorman和A.Samali.2006.Mediatorsofendoplasmicreticulumstress-inducedapoptosis(內質網應激i秀導的細月包凋亡的介質).7:880-885104Tang，和J.A.Bluestone.2006.RegulatoryT-cellphysiologyandapplicationtotreatautoimmunity(調節T細胞生理學與自身免疫病的治療應用).212:217-237105Turley,S.,L.Poirot,M.Hattori,C.Benoist和D.Mathis.2003.Physiologicaltableseeoriginaldocumentpage53formulaseeoriginaldocumentpage54caaa胎ag的t鵬gcttaaccatgcctccatt鵬a3gtcta9ac憤gagccaggtacagtaagaaaaattagcc卿attcattaagttt9ccacatgacttattttgat3ttttggatacatta3ctcacttagg3gaattcaga33ag3atgggtga他33gttc3ttacagctgaata3atgtgtctaa3acaga加ttgtattctg的8gtacagtctacaactgataaaaccttatgattcttttctcccccattatgcccctatatatatcaagatttgggtactttattttagtagaaaatatatatcttttacatatgtatgtatt(at曰aatgcatagatatatgtafaaaaatttgfaagcgttagcggca加attcaccaatgcatttggacaacttgatgtaactgactttattttatgtgactataataaaa3gc3taa加ctcattctgtcaaaa33aaa3333aa3aaa3a333Aassgactcggaagattcgaggcggcgggggacaagtcggcgccccagagcggacgagtcaccaggtgtcaagatgctgcaagtacataggactggactgggcaggct卿ggtcagcc〖ctccaa卿tettcaiccacaaagctgtgttggccgtcc卿卿agga晌aa鄰ctggga卿aa卿ccccgctagctcccaagcacatcaa卿cateaccaatct卿atac鄉gtcttg3tacagccttcg助t卿卿gccattcatgBta卿actatgteaaagctggtggcattcttcag.gaggatatttctg鄉cttgtcta3ttttaggagtt3aaagacctccagagg助3aatta3tgtccaggaagactt3tgcatttttctcccacacaataaaagct鄰gaggccaetatgggcttgttggstgagattctaasiacaggaaattcgccttattgattatgagaaaatggtggatcatagaggagtacggQtagtggcatttggacagtgggctggtgtggc3ggaa始ateaacamtacatggaatgggmaaggctoc的ctttgggacatcacacacctmatgcacattggcatg9ctcat助ctacaggaatagcagtcaggctgtgcaagctgtCGgtgatdctgscta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