能夠中和B型肝炎病毒的人抗體在預防或治療B型肝炎病毒感染中的用途的製作方法

2023-05-08 09:58:41 2

專利名稱：能夠中和B型肝炎病毒的人抗體在預防或治療B型肝炎病毒感染中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及中和HBV的人抗體在預防或治療HBV感染或由此引起的疾病中的用途。
背景技術：
B型肝炎病毒(HBV)引起肝炎和肝癌。WHO已經透露約1/3的慢性HBV患者發生 肝硬化或肝癌，每年約一百萬人死於HBV相關的疾病。針對HBV的疫苗的開發使得預防B型肝炎成為可能，但是還有許多人通過HBV感 染而患有慢性肝炎。另外，有日益增加的肝移植需要，這需要開發有效的可以在肝移植中抑 制HBV感染的抗體。病毒複製抑制劑如拉米夫定被廣泛用作慢性B型肝炎的治療性藥物，但是僅使用 病毒複製抑制劑不可能治療慢性B型肝炎。病毒複製抑制劑與具有與病毒複製抑制劑不 同作用機制的抗體的組合預期可以產生對於慢性B型肝炎增加的治療效果。這樣的抗體 可以包括從具有高的抗HBV抗體滴度的血中純化的B型肝炎抗體(B型肝炎免疫球蛋白； HBIG)。但是，由於現在可獲得的HBIG的有限可用性、低特異性和可能的傳染性病原體的汙 染，所述HBIG不是理想的治療性抗體的來源。因此，已經嘗試使用重組抗體而解決上述問題。沒有血漿供應是可能的，穩定地提 供安全的產品也是可能的。已經發現，這樣的重組抗體的活性是常規的源自血漿的抗體的 活性的3000倍或更高，其可以用於預防肝移植過程中的病毒感染和治療慢性B型肝炎。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種中和HBV的人抗體在預防或治療HBV感染或由此 引起的疾病中的用途。本發明的另一個目的是提供一種使用中和HBV的人抗體而預防或治療HBV感染或 由此引起的疾病的方法。根據本發明的一個方面，提供了人抗體在預防或治療哺乳動物中的HBV感染或由 此引起的疾病中的用途，所述抗體包含具有SEQ IDN0:1的胺基酸序列的重鏈可變區(VH) 和具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列的輕鏈可變區。根據本發明的另一個方面，提供了一種預防或治療哺乳動物中的HBV感染或由此 引起的疾病的方法，所述方法包括給予治療上有效量的人抗體，所述抗體包含具有SEQ ID NO 1的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列的輕鏈可變區 (VL)。


從下列本發明的描述結合下列附圖，本發明上述的和其它的目的和特徵將變得顯而易見，其分別顯示圖1從未經本發明的抗體處理的黑猩猩中收集的血樣中的HBVDNA、HBsAg和抗HBs 的量的改變；圖2用於水動力學動物模型的HBV基因組和質粒pHBVl. 3-MBRI的結構特徵；圖3向注射了 pHBVl. 3-MBRI質粒的小鼠給予本發明的抗體和/或HBV複製抑制 劑後，血HBsAg濃度的改變；圖4向注射了 pHBVl. 3-MBRI質粒的小鼠給予本發明的抗體和/或HBV複製抑制 劑後，血抗體濃度的改變；圖5(a)免疫沉澱分析結果顯示根據使用的本發明的抗體量的本發明的抗體對患 者血中HBV的結合程度；圖5(b)免疫沉澱分析結果顯示根據使用的本發明的抗體量的患者血中HBV DNA 量的改變；圖5(c)比較性免疫沉澱分析結果顯示本發明的抗體或常規抗體對患者血中HBV 的結合程度；圖6(a)免疫組織化學染色結果顯示本發明的抗體對HBV感染的人肝組織的結合； 和圖6(b)免疫組織化學染色結果顯示具有與本發明的抗體相同的同種型的陰性對 照抗體對HBV感染的人肝組織的結合。
具體實施例方式用於預防或治療HBV感染或由此引起的疾病的方法中的人抗體包含具有SEQ ID NO 1的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和具有SEQ IDN0 2的胺基酸序列的輕鏈可變區 (VL)。本發明人已經在試驗中使用黑猩猩證明了本發明的抗體中和HBV的效率。特別 地，輸入了 HBV和本發明的抗體的混合物的黑猩猩在隨後的一年中沒有被HBV感染。另外， 當向被HBV感染的黑猩猩給予本發明的抗體時，HBV表面抗原(HBsAg)的量開始減少，但 是隨著本發明的抗體量的減少而增加。免疫沉澱分析顯示本發明的抗體與患者血樣中的 HBV強烈結合，免疫組織化學染色分析顯示本發明的抗體還與被HBV感染的人肝組織強烈
糹口口。用於本發明方法的人抗體在韓國專利號467706中公開，並且可以通過細胞系 HBAb-49 (KCLRF-BP-00054)產生。如在本發明的實施例中所述的，在動物實驗中抗體顯示了出色的針對HBV的中和 活性。因此，抗體可以用於預防或治療HBV感染，例如，在肝移植過程中的HBV感染，和由此 引起的疾病例如慢性肝炎。因此，本發明還提供了用於預防或治療HBV感染或由此引起的疾病的藥物組合 物，其含有帶有藥學上可接受載體的作為活性成分的人抗體，所述抗體由具有SEQ ID N0:1 的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和具有SEQ ID NO :2的胺基酸序列的輕鏈可變區(yL)組 成。藥物製劑可以根據任何常規的過程製成各種藥物製劑。為了製備藥物製劑，優選地使用載體混合或稀釋抗體，或將抗體包埋在容器類載體中。當載體用作稀釋劑時，其可以 是作為抗體的載體、賦形劑或介質的固體、半固體或液體的材料。因此，製劑可以是片、丸、 粉末、囊、酏、懸浮液、乳劑、溶液、糖漿、氣溶膠、軟的或硬的明膠膠囊、無菌的可注射溶液、 無菌的粉末等的形式。合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、矽酸 鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶體纖維素、聚乙烯吡咯酮、水、羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸 丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物組合物可以另外包括填充劑、抗凝集劑、潤滑劑、浸 溼劑、調味劑、乳化劑、防腐劑等。藥物組合物還可以通過使用任何本領域熟知的方法在將 其給予哺乳動物後提供快速的、持續的或延遲的抗體釋放。本發明的抗體可以與抗病毒藥物如幹擾素、抗HBV單克隆抗體、抗HBV多克隆抗 體、核苷同系物、DNA聚合酶抑制劑、siRNA藥物或治療性疫苗一起使用。可以給予哺乳動物(包括人)本發明的抗體從而預防或治療HBV感染或由此引起 的疾病。抗體的劑量可以根據各種相關的因素如要治療的個體的狀況、疾病的類型和嚴重 程度、給藥的速率和醫生的意見而調整。本發明的抗體可以在單一劑量中或分開劑量中範 圍為約0. 001-10mg/kg(體重)/劑，優選0. 005-lmg/kg/劑的有效量腸道外給藥。在某些 情況下，上述劑量以下的量可以是更恰當的。可以使用比上述劑量大的量，只要其不造成嚴 重的副作用，每日可以在分開劑量中給予這樣的大劑量。下列實施例是為了說明本發明而不限制其範圍。實施例1 對黑猩猩中中和HBV能力的評估為了確認本發明的人抗體顯示出體內中和HBV的能力，進行了下列實驗。將獲自！fepatitisResearch Foundation (New York, USA)的 HBV 100CID50(50% 黑猩猩感染劑量)放入三個管中。將0. Img和IOmg的本發明的抗體Ofepabig-Gene，Green Cross, Korea)分別加入兩個管中，另一個管中不加抗體。將PBS (磷酸鹽緩衝的鹽水)加 入管中至最終體積為3ml，將混合物在37°C孵育1小時，然後在4°C過夜，並用液氮冷凍以制 備測試樣品。向三隻黑猩猩 Ofepatitis Research Foundation, New York, USA)靜脈給予測試 樣品，上述黑猩猩以前未感染HBV。每隻黑猩猩的抗體劑量列在表1中。表 1 從給予抗體的一周前至給予抗體後8周每周收集血樣，從給予抗體後8周起每2 周測定與HBV感染相關的標誌物如HBV DNA、HBsAg(HBV表面抗原)，抗_HBs (HBsAg的抗 體)，抗-HBc (HBV核心抗體)，ALT和AST。另外，通過血和尿的測試評價抗體的體內安全 性，黑猩猩1至3的結果分別顯示於表2-4中。另外，測定了黑猩猩1的HBVDNA，HBsAg和 抗-HBs的量的改變，結果顯示於圖1中。表2 (黑猩猩1) 表3 (黑猩猩2) 表4(黑猩猩3) 如在表2至4中顯示的，在作為對照的黑猩猩1中觀察到HBV感染，而在給予了本 發明的抗體和HBV的黑猩猩2和3中未觀察到病毒感染。這些結果顯示本發明的抗體具有 優異的HBV中和能力。另外，在肝功能、血和尿的測試中未發現異常值，顯示抗體在體內是 安全的。實施例2 對小鼠模型中HBV中和能力的評價2-1)含有HBV DNA的質粒的構建將HBV (adr 亞型)基因的 1. 3 序列(Gene Bank accession No. DQ683578) (從HBV基因組的增強子I的上遊至多聚腺苷酸化區的下遊的HBV基因；見圖2)插入 pcDNA3. 1 (Invitrogen, USA)的PmeI限制位點中，得到的質粒pHBVl. 3-MBRI通過使用 EndoFree PlasmidKit (Qiagen, Germany)而製備。2-2)質粒注射將2-1)中製備的20μ g pHBVl. 3-MBRI質粒溶於生理鹽水溶液中至對應於 小鼠重量9%的體積，並以0. 3ml/秒的速率(水動力學注射)注射進入免疫缺陷的 C57BL/6J-Prkdcscid/SzJ 雌性小鼠(8 周大，Jacksonlaboratory, USA)的尾靜脈中。2-3)給予本發明的抗體和HBV複製抑制劑每次HBsAg水平達到最高水平，將本發明的抗體以基於20g小鼠體重的5mg/ kg的濃度注射進入小鼠的尾靜脈中。在早期只將100 μ IPBS注射進入對照小鼠的尾靜 脈中，80天後，如上述注射本發明的抗體。作為比較的組，將1片Zeffix(Lamivudine，GlaxoSmithKline PLC) (HBV治療性藥物)稀釋於蒸餾水中，每天以基於20g小鼠體重的 5mg/kg的濃度口服給予100 μ 1混合物100天，從第101天開始給予50mg/kg的濃度口服給 予100 μ 1混合物，從第124天至第160天給予500mg/kg的濃度口服給予100 μ 1混合物。2-4)分析HBsAg水平的改變在實驗中，每3至4天進行眼出血，通過使用GENEDIA HBsAgELISA 3. 0試劑盒 (Greencross MS, Korea)分析血中HBsAg水平和殘餘的抗體量。收集血樣並稀釋。測定ELISA吸收度，在10倍稀釋的血樣中測定的吸收度顯示於 圖3中。如圖3中顯示的，Zeffix處理的組中HBsAg水平維持恆定，而在本發明的抗體處 理的組中重複出現增加和減少HBsAg水平的循環。這一結果顯示本發明的抗體具有優異的 中和HBsAg的效力。據信未觀察到Zeffix的影響，因為這種類型動物模型對於聚合酶抑制 劑可能不適合。另外，本發明的抗體和Zeffix共處理的組顯示了與本發明的抗體處理的組 相似的吸收度式樣。在PBS處理的組中，HBsAg水平維持恆定，但是在第80天注射本發明 的抗體後降低，這也顯示本發明的抗體具有優異的中和HBsAg的效力。同時，使用標準的ELISA方法測定血中抗體的量。特別地，將純化的重組HBsAg溶 液稀釋於PBS中至5 μ g/ml的濃度，將100 μ 1所得溶液的等份加載至Nunc immuno module 的每個孔中並在2至8°C孵育過夜，去掉溶液。然後將300μ1 1%BSA/PBS封閉緩衝液加 入每個孔中並在室溫孵育1小時。當反應完成時，去掉封閉緩衝液，加入標準溶液、測試溶 液和摻入的測試溶液的每種100 μ 1並在室溫孵育90分鐘。然後，去掉反應溶液，用洗滌溶 液(PBS/0. 05%吐溫20)洗滌五次。將用1%85々^^5溶液稀釋25，000倍的100 μ 1山羊抗 人IgG Fab特異性的過氧化物酶共軛物(Sigma)加至每個孔中並在室溫孵育60分鐘。用 上述洗滌溶液洗板五次，將100 μ 1底物溶液(1 1的TMB微孔過氧化物酶底物溶液A和 B的混合物，KPL，USA)加至每個孔中並在室溫孵育30分鐘。然後，將100 μ 1停止溶液(1Ν H2SO4)加至每個孔中，在測量波長450nm和參考波長620 650nm測定吸收度從而確定血 樣中抗體的量。結果顯示於圖4中。如圖4中顯示的，本發明的抗體處理的組以及抗體和Zeffix共處理的組均顯示抗 體濃度的相似式樣。參考圖4和圖3，重複出現通過抗體與HBsAg的反應而增加和降低抗體 水平(降低和增加HBsAg水平)的循環。實施例3 抗體的HBV結合能力的免疫沉澱分析進行了免疫沉澱以檢查本發明的抗體是否結合B型肝炎患者(由Ajou University, School of Medicine, Korea ) i巾白勺 HBV。3-1)B型肝炎患者血樣的製備用山羊抗人IgG (Fe特異性)瓊脂糖共軛物(Research DiagnosticsInc.， Flanders, NJ)孵育1000 μ 1B型肝炎患者的血樣(用0. 2% BSA/PBS緩衝溶液稀釋10倍) 以去除免疫球蛋白。3-2)本發明的抗體與山羊抗人IgG瓊脂糖共軛物的結合反應將10 μ 1本發明的抗體(0. 1，0. 5，1和5μ g)和PBS與50 μ 1山羊抗人IgG瓊脂 糖共軛物(Research Diagnostics)混合併在室溫攪拌下孵育1小時。向其中加入IOmg人 免疫球蛋白(I. V. -Globulin-S,Green Cross，Korea)，將所得的混合物在室溫攪拌下孵育1小時以封閉山羊抗人IgG瓊脂糖共軛物的結合區。作為比較組，如上述處理源自血的HBV抗 體(Hepabig, Green Cross, Korea)、TT-F9 (抗破傷風類毒素人抗體，GreenCross, Korea), 和HuS 10 (抗B型肝炎病毒表面抗原人源化抗體GreenCross，Korea)的每種中的1 μ g。3-3)抗體結合的山羊抗人IgG瓊脂糖共軛物和患者血樣的混合物的製備將200 μ 1 3-1)中製備的血樣與3-2)中製備的抗體結合的山羊抗人IgG瓊脂糖 共軛物混合，將所得的混合物在室溫攪拌1小時以便使抗體與患者血樣中的HBV進行反應。3-4) HBV沉澱的分析將3-3)中所得的溶液離心，用上清液進行Cobas Amplicor HBVMonitor Test, v2. O (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) UflJ胃 HBVDNA。用0. 2% BSA/PBS緩衝溶液洗滌殘餘瓊脂糖10次，並用100 μ 1相同緩衝溶液重 懸，然後加入 5μ1 10% SDS, 2 μ 1 50mM EDTA 和 200 μ g 蛋白酶 K(Sigma-Aldrich)並在 55°C孵育30分鐘。然後，用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)處理上 清液以分離 DNA，使用 LiquiMix GM PCR預混合液(Neurotics，Korea)，引物M3 (SEQ ID N0: 3)和P0L8(SEQ ID NO 4)進行PCR以擴增HBV特異性DNA，PCR在下列條件下進行55°C變 性5分鐘；35個循環(950C 1分鐘，550C 1分鐘和72°C 1分鐘)；72°C最後延伸10分鐘。在 1.0%瓊脂糖凝膠上分析擴增的DNA。結果顯示於圖5中。在圖5的(a)和(c)中，每條泳 道的被分析的樣品如下圖 5 (a)1 用0. 1 μ g本發明的抗體處理的組，2 用0. 5 μ g本發明的抗體處理的組，3 用1 μ g本發明的抗體處理的組，4 用5 μ g本發明的抗體處理的組，5 =PBS圖 5 (C)1 =PBS2 用1 μ g TT-F9 (抗破傷風類毒素人抗體)處理的組，3 用1 μ g H印abig處理的組，4 用1 μ g HuS 10 (抗B型肝炎病毒表面抗原人源化抗體)處理的組，5 用1 μ g本發明的抗體處理的組。如在圖5的(a)和(b)中顯示的，沉澱的HBV的量與用於免疫沉澱的抗體的量成 比例，免疫沉澱後上清液中HBV的量與用於免疫沉澱的抗體的量成反比。另外，當使用相同 量的抗體時，源自血的HBV抗體Ofepabig)由於其弱的HBV結合能力而不沉澱HBV，而具有 強結合能力的本發明的抗體特異性沉澱HBV(見圖5(c))。實施例4 抗體的HBV結合能力的免疫組織化學分析進行免疫組織化學染色以檢查本發明的抗體是否結合HBV感染的組織。HBV 感染的人肝組織(Spring Bioscience, Fremont, CA, USA. Catalog No. STS-025)的冷凍片子用丙酮固定並用甲醇稀釋的過氧化氫處理。然後，用正常 的兔血清、抗生物素和生物素順序處理片子。使用Immunoprobe biotinylation kit (Sigma-Aldrich)將本發明的抗體和同種型陰性對照抗體(人IgGl，Sigma-Aldrich)共軛結合至生物素，然後在此處理Str印tABComplex/HRP(Dako，Netherlands)。用3，3' -二 氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)將上面的試劑染色並用蘇木精復染。結果顯示於圖6中。如圖6中顯示的，同種型陰性對照抗體不結合HBV感染的人肝組織(見(b))，而本 發明的抗體強烈地與其結合(見(a))。雖然已經就上面的特定具體實施方式
描述了本發明，應該認識到可作出各種修飾 和改變，所述修飾和改變也落入本發明的範圍內，如接下來的權利要求所限定的。
權利要求
一種用於預防或治療哺乳動物中B型肝炎病毒(HBV)感染或由此引起的疾病的人抗體的用途，所述抗體包含具有SEQ ID NO1的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和具有SEQ ID NO2的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
2.根據權利要求1所述的用途，其中抗體從細胞系HBAb-49(KCLRF-BP-00054)中製備。
3.根據權利要求1所述的用途，其中抗體中和HBV。
4.根據權利要求1所述的用途，其中抗體與抗病毒藥物一起使用。
5.根據權利要求4所述的用途，其中抗病毒的藥物選自幹擾素、抗HBV單克隆抗體、抗 HBV多克隆抗體、核苷類似物、DNA聚合酶抑制劑、siRNA藥物或治療性疫苗。
6.根據權利要求1所述的用途，其中以範圍為0.001-10mg/kg (體重)/劑的量給予哺 乳動物抗體。
7.一種預防或治療哺乳動物中的HBV感染或由此引起的疾病的方法，所述方法包括以 有效量向其給予人抗體，所述抗體包含具有SEQID N0:1的胺基酸序列的重鏈可變區(VH) 和具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列的輕鏈可變區。
全文摘要
本發明提供針對B型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的人抗體的用途。所述抗體顯示優異的中和HBV能力，因此，可以用於預防或治療HBV感染或由此引起的疾病。
文檔編號A61K39/395GK101878037SQ200880118406
公開日2010年11月3日 申請日期2008年11月21日 優先權日2007年11月30日
發明者吳宣姃, 奉紀兌, 崔真設, 張基奐, 徐東赫, 柳憬桓, 洪廣元, 辛庸源, 辛龍男, 金世鎬, 金判勁 申請人:株式會社綠十字