甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌的mecA變體菌株的檢測的製作方法

2023-05-07 03:31:56 2

甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌的mecA變體菌株的檢測的製作方法
【專利摘要】本發明提供用於檢測攜帶變體mecA基因的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant?Staphylococcus?aureus)的改進的檢測。該檢測對於消除由於患者樣品中MRSA中這一變體的存在的某些假陰性結果尤其有用。
【專利說明】甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌的mecA變體菌株的檢測發明領域
[0001]本發明涉及甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)的分子檢測。更具體地，本發明涉及包括帶有mecA基因變體的另外菌株的MRSA的改進的檢測。
[0002]發明背景
[0003]在1961年,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一個菌株首次顯示對甲氧西林的抗性。現在，甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)是導致醫院感染和社區感染的最流行的抗生素抗性病原體之一。MRSA菌株的出現是由於移動的遺傳元件葡萄球菌盒染色體 mec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCCmec)被獲取並插入到易感金黃色葡萄球菌菌株的染色體中。事實上，這一 SCCmec元件攜帶mecA基因，該基因造成甲氧西林抗性(Staphylococcal Cassette Chromosome mec ;Ito 等人，2001，Antimicrob.Agents Chemother.45(5):1323-1336 ；Hiramatsu,等人，2001，Trends Microb1l.0ct ；9 (10):486-93)。mecA 基因編碼修飾的青黴素結合蛋白(Penicillin Binding Protein),稱為PBP2a或PBP2』。不同於天然PBP，這一 PBP2a具有對β -內醯胺抗生素的低親和性，這允許甚至在β-內醯胺抗生素的存在下繼續合成細胞壁。
[0004]SCCmec元件可被摻入到金黃色葡萄球菌和其他凝固酶陰性的葡萄球菌，主要是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)的染色體中。SCCmec的特徵是存在末端反向和同向重複(terminal inverted and direct repeat)、一組位點特異性重組酶基因(ccrA和ccrB)、和mecA基因複合體(Ito等人，1999, Antimicrob.Agents Chemother.43:1449-1458 ；Katayama 等人，2000，Antimicrob.AgentsChemother.44:1549-1555)。這一mecA基因盒SCCmec插入金黃色葡萄球菌基因組的位點是已知的且序列是保守的(Ito 等人,2001, Antimicrob.Agents Chemother.45:1323-1336)。在插入金黃色葡萄球菌染色體中之後，SCCmec具有左末端接合點(left extremityjunct1n)和右末端接合點(right extremity junct1n)(參見圖1),以及分別包括SCCmec盒和染色體DNA的周圍的左末端接合區和右末端接合區,在接合點處SCCmec序列與金黃色葡萄球菌染色體序列是連續的。此前已經分析了圍繞SCCmec DNA的左邊界和右邊界(即，分別為attL和attR)的區域的核苷酸序列、以及圍繞SCCmec DNA整合位點(即，attBscc, SCCmec DNA的細菌染色體附著位點)的區域的核苷酸序列。對整合位點的序列分析揭示，attBscc位於新的開放閱讀框(ORF) orfX的3』端。orfX編碼159個胺基酸的多肽，最近被注釋為 23S rRNA 甲基轉移酶(http://www.uniprot.0rg/uniprot/Q6I7F2)。已經另外研究了 SCCmec 的 mecA 區域的結構(Oliveira, D.C.,等人,2000, Antimicrob.AgentsChemother.44(7):1906-1910)。
[0005]通常，在患者的MRSA檢驗中，重複地從患者獲取鼻拭樣並培養，以確定是否存在MRSA菌株。正在開發更新的方法，其允許直接從鼻拭樣和以短得多的時間量鑑定MRSA。樣品也在演變，許多文章顯示對在同一患者取樣多個解剖部位以增加檢測MRSA攜帶者的可能性的興趣。部位可以是鼻加咽喉、腋窩、腹股溝和或會陰。(MethicillinResistant Staphylococcus aureus colonisat1n at different Body Sites: aProspective, Quantitative Analysis,Mermel 等人 2011,Journal of ClinicalMicrob1logy)。
[0006]擴增是公知的技術，且已經開發了多種方法，包括基於轉錄的擴增諸如轉錄介導的擴增(transcript1n-mediated amplificat1n, TMA ;美國專利號 5，766, 849 ；5，399，491 ;5，480，784 ;5，766，849 ；和 5，654，142)和基於核酸序列的擴增(nucleicacid sequence-based amplificat1n, NASBA ；5, 130, 238 ；5,409, 818 ；5,654,142 ；和6，312，928)、和循環核酸擴增技術(熱循環)諸如聚合酶鏈式反應(polymerase chainreact1n, PCR ;美國專利號 4，683，195 ;4，965，188 ;4，683，202)和連接酶鏈式反應(ligase chain react1n，LCR ;美國專利號5，792，607)。已知的擴增方法還包括鏈置換擴增(strand displacement amplificat1n, SDA)、自主序列複製(self-sustainedsequence replicat1n, 3SR)、Q-β 複製酶、和級聯滾環擴增(cascade rolling circleamplificat1n, CRCA)。
[0007]利用核酸的檢測方法也是本領域中公知的。通常為了多種檢測目的標記核酸。例如，美國專利號 4, 486, 539 (Kourlisky) ;4，411，955 (Ward) ；4, 882, 269 (Schneider)和4，213，893 (Carrico)中描述的方法，闡述了用於檢測特異性核酸序列的標記的檢測探針的製備。還描述了用於不同檢測方法， 諸如靶捕獲、HPA、TaqMan、分子信標和夾心雜交的探針設計(例如，美國專利號4，486，539、和美國專利號4，751，177 ;5，210，015 ；5，487，972 ;5，804，375 ;5，994，076)。核酸雜交技術和條件是本領域技術人員已知的，並已在除了許多其他出版物之外例如，Sambrook等人Molecular Cloning A LaboratoryManual,第 2 版.Cold Spring Lab.Press, Dec.1989 ;美國專利號 4，563，419 (Ranki)和4，851，330 (Kohne)以及在 Dunn,等人，Cell 12，第 23-26 頁(1978)中描述。
[0008]開發的以基於mecA基因和金黃色葡萄球菌特異性染色體序列的檢測來檢測並鑑定MRSA的早期分子方法已經被描述。(Saito等人，1995，J.Clin.Microb1l.33:2498-2500 ；Ubukata 等人，1992，J.Clin.Microb1l.30:1728-1733 ;Murakami 等人，199 I，J.CIin.Microbiο I.29:2240-2244 ; Hiramatsu 等人,1992, Microb1l.1mmunol.36:445-453)。然而，在僅基於盒接合點的檢測的試驗中，對包含SCCmec的右末端的小片段的甲氧西林易感金黃色葡萄球菌分離株已經觀察到假陽性(參見 Rupp, J.等人，J.Clin.Microb1l.44 (6): 2317 (2006))。另外,Ramakrishnan 和Riccelli描述了利用具有與SCCmec盒插入位點的左接合點附近的區域,包括部分SCCmec盒序列和插入區域中的部分金黃色葡萄球菌序列(左末端接合區)互補的序列的寡核苷酸探針檢測MRSA的方法(美國專利公布號US20060057613)。
[0009]用於確定對特別是由金黃色葡萄球菌攜帶的甲氧西林抗性的概念已被公布:
[0010]-SCCmec 右末端接合點擴增概念(Hiramatsu 等人 W097/31125 ;EP O 887424 ;美國專利號 6，156,507 ;以及另外的，Huletsky 和 Rossbach W002/099034 (2002) ;Huletsky 等人 J.Clin.Microb1l.42(5):1875-1884 (2004))
[0011]-由Francois和合作者描述的免疫-富集(immuno-enrichment)概念(Francois, P等人.J.Clin.Microb1l.41 (I):254-260(2003) ;W002082086)，其中免疫-富集隨後是擴增三種標誌物(mecA基因、金黃色葡萄球菌特異性標誌物、和表皮葡萄球菌特異性標誌物)
[0012]-SCCmec右末端接合點擴增和mecA擴增的組合(Jay,等人US20090203013 ；W02009085221，其通過引用全文併入)。
[0013]SCCmec右末端接合點概念基於覆蓋SCCmec整合位點的右末端接合區的區域的擴增。原理如下=SCCmec盒通常在稱為orfX的金黃色葡萄球菌特異性開放閱讀框上遊整合金黃色葡萄球菌染色體；擴增(例如，PCR)檢驗組合了位於盒的右部(SCCmec盒的「右末端接合區」)的多個正向引物、一個反向引物和探針，後二者位於金黃色葡萄球菌染色體orfX中，即，SCCmec與orfX的右末端接合點下遊(orfX的「右末端接合區」)。Hiramatsu等人描述了具有在盒的右末端接合區中的兩個正向引物以擴增當時描述的主要SCCmec類型的檢測(一個引物用於SCCmec I和II型，且第二引物用於III型)。Huletsky等人陳述，如果僅使用Hiramatsu描述的兩個正向引物，沒有檢測到多種MRSA菌株，且他們確定了新類型的盒，稱為MREJ型，該新類型的盒在SCCmec盒的右部分具有序列變化。市售可得的(Infect1 Diagnostics Inc.)檢測組合了位於盒的右部分的五個正向引物(一個引物設計用於檢測MREJ i和ii型，且其他四個引物用於MREJ ii1、iv、v和vii型)、位於orfX中的一個反向引物、和覆蓋orfX區域的相同部分和鑑定已鑑定的orfX變體所需的三個通用探針。這一檢測以實時PCR的方式進行。然而，報導的(Huletsky等人2004)這一檢測的特異性顯示，4.6%的MSSA(檢測的569中的26個)被錯誤鑑定。用利用單基因座(右末端SCCmec盒-orfX接合點)PCR檢驗的另一市售檢測也報導了假陽性結果(Rupp, J,等人，J.Clin.Microb1l.(44)6:2317 (2006))。
[0014]US20090203013提出了 MRSA假陽性的主要來源並提供了檢測此前未被當時可獲得的檢測處理的MRSA的改進的檢測。這一申請假設，此前的分子方法鑑定的假陽性在一些情況下可由MSSA菌株中在缺失包含mecA的染色體區域後存在殘餘SCCmec右末端片段或存在不包含mecA的SC Cmec來解釋。另外，其假設，一部分假陽性可能是由於非特異性擴增；事實上，由於反向引物和探針位於MRSA和MSSA 二者共同的orfX中，正向引物非特異性退火到MSSA染色體上將導致MSSA的擴增和檢測。該申請提出了假陽性的兩種來源並提供了改進的檢測。利用這一原理的檢驗已推向市場(NucliSENS EasyQ?MRSA, b1Merieux, SA, Marcy I』 Etoile, France)。
[0015]此前，在用於檢測金黃色葡萄球菌中甲氧西林抗性的檢驗中，確定mecA基因存在於SCCmec盒中，導致菌株抗甲氧西林,或確定mecA基因不存在(從盒中切除或無盒)，其中總結出，菌株是對甲氧西林易感的。考慮到公共資料庫中對於來自MRSA或來自其它甲氧西林抗性病原體的mecA基因可獲得的許多序列，顯示mecA基因是充分保守的，僅發現一些特定的突變。
[0016]最近檢測到一種甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌，通過常規PCR和微陣列測序發現其缺少 mecA(Shore, A.C.等人，Antimicrob.Agents Chemother.Do1:10.1128/AAC.00187-11(2011 年 6 月 2 日)和 Garcia-Alvarez, L.等人，Lancet do1:10.1016/S1473-3099(11)70126-8(2011 年 6 月 3 日)Methicillin_resistant Staphylococcusaureus with a novel mecA homologue in human and bovine populat1n in theUK and Denmark: a descriptive study.)。全基因組測序揭不了具有高度趨異的blaZ-mecA-mecR1-mecI的30kb SCCmec兀件，並指出，SCCmec兀件中存在的該mec兀件與金黃色葡萄球菌mecA同系物具有70%序列同一性；另外，該SCCmec元件與此前鑑定的SCCmecXI 型(Internat1nal Working Group on the Classificat1n of StaphylococcalCassette Chromosome Elements的網站上列出的序列類型425牛MRSA菌株LGA251)幾乎相同。SCCmec元件被整合在orfX中與所有其他SCCmec元件相同的核苷酸位置。該菌株另外包括E類複合體、由ccrAl-ccrB3組成的8型盒染色體重組酶(ccr)複合體、砷抗性操縱子和側翼的同向重複。目前的檢測方法將不會將這一菌株鑑定為MRSA。
[0017]Shore等人使用FR823292菌株作為參考菌株並使用mecA_M10/0061引物。Garcia-Alvarez等人研究了 LGA251基因組中趨異的mecA,這一 mecA變體位於稱為「type-XI SCCmec」的新盒中。他們使用LGA251菌株作為參考菌株並使用mecA_LGA251引物。事實上，2個出版物指代同一客體。兩種mecA變體共有非常高的相似性百分比(99% )，且同時顯示與迄今已知的所有mecA序列弱的總體相似性。
[0018]隨著新的亞型和菌株被鑑定，檢測此類亞型和菌株的手段變得必不可少。當目前現有的檢驗先前意外地沒有檢測到其並因而可導致假陰性結果時，這是特別重要的。本發明通過提供可檢測此類菌株的檢驗滿足了關於檢測包含變體mecA的菌株的這一需求。此外，這一新發明在同一檢驗中證實了金黃色葡萄球菌菌株和甲氧西林抗性基因二者的存在。這一檢驗可單獨使用，或可與用於其他SCCmec類型的現有檢驗組合使用。


【發明內容】

[0019]本發明提供一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA變體元件,所述方法包括:
[0020]利用包含以下的寡核苷酸組對樣品進行擴增反應:
[0021]a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0022]b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列，
[0023]其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包含MRSA，則MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域被擴增。
[0024]本發明另外提供一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述方法包括:
[0025]利用以下對樣品進行擴增反應:
[0026]a.第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0027]I)第一 mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0028]2)第二 mecA變體寡核苷酸,所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和
[0029]b.第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0030]I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0031]2)第二 mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列，
[0032]其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包含MRSA，則MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域被擴增。
[0033]本發明還提供一種用於擴增甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA變體元件，所述試劑盒包含第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0034]a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0035]b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列。
[0036]另外，本發明提供一種用於擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述試劑盒包含:
[0037]a)第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0038]I)第一 mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0039]2)第二 mecA變體寡核苷酸，所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和
[0040]b)第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0041]I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0042]2)第二 mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列。
[0043]附圖簡述
[0044]圖1總體顯示了帶有插入的SSCmec盒的MRSA染色體的區域，標出左末端接合點和右末端接合點。
[0045]圖2總體顯示了帶有攜帶mecA變體(mecALeA251)的插入的SCCmec盒的MRSA染色體的區域。
[0046]發明詳述
[0047] 如本文討論的，本發明提供對甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌菌株的鑑定，所述菌株包含變體mecA基因(通常用目前市售可得的MRSA檢測試劑盒檢測不到)，且所述菌株在結構上布置為使得單個擴增反應可擴增mecA的相關部分和在SCCmec盒插入金黃色葡萄球菌染色體的插入點處的末端接合點二者。本發明提出了假陰性結果的新發現的來源並提供了改進的檢測。
[0048]除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如所公開的發明所屬領域的技術人員所通常理解的相同含義。儘管與本文描述的方法和材料相似或等價的任何方法和材料可用於實踐或檢測本發明，優選的方法、裝置和材料是如所描述的。
[0049]如本文和所附的權利要求書中所用的，除非上下文另有清楚規定，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the) 」包括複數指代對象。
[0050]由本發明鑑定的菌株是甲氧西林抗性的，但它們不含有迄今已知是充分保守的經典的mecA基因。在這種情況中，甲氧西林抗性由新的mecA變體基因賦予。一種記載的mecA變體在出版物中被不同地稱為mecALGA251、mecAM_Q61、mecA同系物和mecA新變體(這一變體最近被提議重新命名為「mecC」 [Ito, T.等人，Guidelines for Reporting Novel mecA GeneHomologues, Agents Chemother.do1: 10.1128/AAC.01199-12]);然而，其他 mecA 變體可用本發明檢測。如在說明書和權利要求書中使用的，術語「mecA變體」將用於指代賦予甲氧西林抗性並可被請求保護的方法特別是在擴增反應中檢測的任何mecA變體基因，所述擴增反應以單個引物組擴增包含mecA變體的相關部分(即，足以鑑定其為mecA變體)和在SCCmec盒插入金黃色葡萄球菌染色體的插入點處的末端接合點二者的區域。注意,隨著擴增技術進一步開發，更長的擴增子可變得可能，使得用於檢測mecA變體基因的引物組可被設計以在距包含mecA變體基因的相關部分和SCCmec盒的末端接合點的這一靶區域更遠處雜父。
[0051]此前研究的MRSA菌株中SCCmec盒的大小是趨異的，但一般發現mecA基因為在orfX的方向距金黃色葡萄球菌染色體(在本文有時稱為「下遊」)約8000至15，000bp，且在另一方向更長(參見圖1和圖2a)。在新的SCCmec XI型中，已發現mecA變體基因位置更接近orfX，距離僅約1500bp (參見圖2b)。儘管傳統MRSA擴增設計的申請可能已經預測了兩部分的檢驗設計一除了檢測接合點以外還檢測mecA變體基因一 申請人:反而考慮和認識到從mecA變體基因到orfX的較短距離的潛在用途。因此，本發明有利地利用mecA變體基因中的引物和末端接合區中的金黃色葡萄球菌染色體區域(參見圖2，例如，跨右末端接合點)中的另一引物，直接擴增mecA變體基因與金黃色葡萄球菌染色體末端接合區(即，跨末端接合點)之間的區域。儘管仍是非傳統的長擴增子， 申請人:已經發現，這一設計令人驚訝地良好工作。另外，這一新發明解決了差的特異性的問題，因為僅需要一次擴增，且這一擴增在同一反應中證實金黃色葡萄球菌菌株和變體甲氧西林抗性基因二者的存在。
[0052]本發明提供一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA變體元件,所述方法包括:
[0053]利用包含以下的寡核苷酸組對樣品進行擴增反應:
[0054]a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0055]b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列，
[0056]其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包含MRSA，則MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域被擴增。金黃色葡萄球菌染色體DNA的區域可以在右末端接合區中。
[0057]與靶特異性地雜交的本發明的寡核苷酸可被選擇為在選擇的雜交條件下與其靶選擇性雜交的那些，即，其與其預期的靶結合但不與非靶結合。為了適當的嚴格性，可選擇雜交/擴增條件以實現靈敏度，如本領域已知的(例如，Sambrook和Russell, MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press ;第3版(2001))。可對選擇的寡核苷酸進行微小的修飾，只要反應條件允許修飾的寡核苷酸與靶特異性地雜交。
[0058]具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列的第一寡核苷酸和具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列的第二寡核苷酸各自可作為引物起作用，且各自被定向使得，在與其特異性靶核酸雜交後，和在包含引物的擴增反應起始後，形成包含MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域的擴增子。此類反應被設計以跨SCCmec在其插入金黃色葡萄球菌染色體處的末端接合點進行擴增(即，足夠地接近接合點，從而擴增反應可延伸跨過接合點)。因此，可用於擴增接合點的針對mecA變體的引物對通常將與兩個區域雜交，一個區域在mecA變體中，且一個區域在金黃色葡萄球菌染色體區域中，實際上圍繞接合點，並且每個引物將被定向為雜交以能夠諸如引導以5』-3』方向朝向接合點擴增。通常，針對mecA變體的引物將被設計以在接合點的 1600nt、1550nt、1500nt、1450nt、1400nt、1350nt、1300nt、1200nt、I10nt、1000nt、900nt、800nt、700nt、600nt、500nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、50nt、30nt、25nt、20nt、等等內雜交；然而，由於新技術允許更長的擴增子，引物可被設計為在距接合點更遠距離處雜交。由於具有mecA變體基因的SCCmec的結構和mecA變體基因與接合點的距離，具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列的引物通常將被設計為比具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列的引物在距接合點更遠處雜交。
[0059]用於擴增orfX-mecA變體的寡核苷酸組還可包含第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，且其中如果樣品包含MRSA，則檢測到第三寡核苷酸的雜交。此類寡核苷酸可作為用於檢測擴增產物的探針起作用，並因此被選擇以能夠與第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域特異性地雜交。在某些實施方案中，此類探針可與金黃色葡萄球菌染色體DNA的區域，諸如orfX的區域特異性地雜交。在另一實施方案中，探針可與SCCmec盒DNA的右末端接合區的區域(例如，在blaZ序列中)特異性地雜交，且在另外的實施方案中，探針可與mecA變體的區域特異性地雜交。擴增可通過選擇的任何手段檢測。例如，該第三寡核苷酸可通過多種手段的任一種和以多種方法的任一種被標記。因此，如果樣品包含MRSA，則發生兩個引物之間的核酸的擴增，且第三寡核苷酸，其可以是標記的探針，可與擴增子雜交。第三寡核苷酸的雜交可通過任何已知手段被檢測。可選地，嵌入染料(intercalating dye)可用於檢測來自兩個引物的擴增。如果使用探針，探針可被設計以與SCCmec盒DNA的右末端接合區的區域特異性地雜交。例如，探針可被設計以與金黃色葡萄球菌染色體DNA的區域諸如金黃色葡萄球菌染色體DNA的orfX的區域特異性地雜交。可選地，探針可被設計以與mecA變體的區域特異性地雜交。
[0060]本發明中任何靶的存在或不存在可通過進行提供產物檢測的任何分析確定，例如，如果使用標記的探針，通過適當的檢測裝置檢測雜交的標記。在這樣的實施方案中，缺少可檢測信號指示靶的不存在；可檢測信號的感知指示靶的存在。
[0061]能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的第一寡核苷酸或引物的實例可包括但不限於，在orfX區域中特異性地雜交的寡核苷酸。此類寡核苷酸的實例包括SEQ ID N0:9和10。具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列的第二寡核苷酸的實例可包括但不限於，選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、
7、16、17和21。這些具體實例作為正向引物特別有用(即，用於引導朝向SCCmec的右末端接合點的擴增)。可用作探針、能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域(在金黃色葡萄球菌染色體DNA中雜交)和第二寡核苷酸的雜交區域(在mecA變體的區域中雜交)之間的區域中特異性地雜交的第三寡核苷酸的實例可包括但不限於，如SEQ ID N0:8、18和19所列的核酸序列。
[0062]MRSA的基因組結構此前已被表徵。如權利要求書中所用的,「SCCmec盒」(有時稱為「mecDNA」，例如，在Hiramatsu美國專利號6，156，507中)具有如本領域中已知的定義，即，MRSA或MR-CNS的染色體上存在的整合的外來的DNA，並包含mec基因複合體、一組位點特異性重組酶基因(ccrA和ccrB)、和末端反向和同向重複(在3』和5』端二者)；如說明書中所用的，這一術語包括見於包含mecA變體的菌株中的SCCmec的任何變化形式。「mecA基因」包括賦予甲氧西林抗性(即，編碼PBP2a或PBP2』(青黴素結合蛋白))所需的所有序列。
[0063]如本領域已知的，SCCmec盒向金黃色葡萄球菌染色體的插入產生SCCmec DNA與金黃色葡萄球菌染色體DNA的兩個接合點、和兩個相應的接合區域，其中SCCmec序列與金黃色葡萄球菌染色體序列是連續的。因此，接合點位於SCCme c盒的左和右末端(參見圖1)。這兩個區域被Ito等人(Antimicrob.Agents Chemother.May200145 (5):1323-1336, 「Structural Comparison of three Types of StaphylococcalCassette Chromosome mec Integrated in the chromosome in Methicillin-ResistantStaphylococcus aureus」)稱為「右 SCCmec-染色體接合點(Right SCCmec-ChromosomeJunct1n) 」和「染色體-左 SCCmec 接合點(Chromosome-Left SCCmec junct1n) 」，且在本文分別稱為「右末端接合點」和「左末端接合點」。在右末端接合點處，與SCCmec盒鄰接的金黃色葡萄球菌基因組序列是基因orfX，其在一些文獻中稱為「IntM」。如在權利要求書中所用的，「末端接合區」是SCCmec盒或金黃色葡萄球菌染色體核酸在右或左末端接合點或插入位點的以下距離內的區域，從而在SCCmec(例如，J3區域)或orfX中雜交的引物，在引物延伸反應或轉錄型(例如，NASBA或TMA)反應中，可跨該接合點延伸，例如，在接合點的 600nt、550nt、500nt、450nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、10nt 或 50nt 內(以任一方向)。取決於使用的擴增技術，有用的距離可以變化。因此，取決於使用的上下文，「末端接合區」可以指SCCmec DNA中的區域或金黃色葡萄球菌染色體DNA中的區域；兩種用法都指在接合點的以下距離內的此類DNA，從而在適當的標準延伸或擴增條件下，適當選擇的在SCCmec (例如，J3區域)或orfX中雜交的引物可以朝向接合點的方向從其跨接合點地延伸或轉錄。即，「SCCmec盒的末端接合區」將是SCCmec DNA中靠近其與金黃色葡萄球菌染色體DNA的鄰接或整合位點的區域；且「0忖乂的末端接合區」將是orfX DNA中靠近與SCCmec DNA的鄰接(SCCmec整合位點)的區域。類似地，「金黃色葡萄球菌染色體DNA的末端接合區」將是金黃色葡萄球菌染色體DNA中靠近與SCCmec DNA的接界(abutment)的區域。可選地，這一區域也可被稱為金黃色葡萄球菌染色體DNA在SCCmec末端接合點中的區域。如此，「右末端接合區」是指圍繞接合點的在SCCmec盒右(或下遊)側的區域，且「左末端接合區」是指圍繞接合點的在SCCmec盒左(或上遊)側的區域(參見圖1)。
[0064]有利地，人們可利用已知的方法進行擴增反應以檢測此前表徵的MRSA菌株(包含最初描述的mecA基因)的存在,所述方法諸如包括檢測SCCmec插入接合點和mecA序列的方法(即，Jay等人)，以及擴增以檢測新發現的包含mecA變體的菌株的存在。此類擴增和檢測反應可例如在分別的容器中進行，或在單個容器中作為多重反應進行。如此，除了檢測mecA變體的反應以外，檢驗可包括檢測例如，標準(即，如對SCCmec 1-X型描述的)SCCmec盒插入、標準(即，如對SCCmec 1-X型描述的)mecA基因、和/或金黃色葡萄球菌特異性染色體區域的接合區域的反應。
[0065]「擴增mecA DNA的部分」是指對樣品進行擴增反應，產生包括對應mecA基因的任何部分的序列的擴增產物，例如，包括SEQ ID N0:12和13中所列核酸序列的引物之間的區域的擴增產物。例如，引物可包括如SEQ ID NO: 12和13中所列的核酸序列。可利用包括這些序列的引物、和基本上由這些序列組成的引物、以及由這些序列組成的引物。擴增可例如，利用包含引物的靶核酸之間的核酸序列的探針檢測，或利用嵌入染料檢測。可容易地設計引物和探針用於與已知的mecA序列雜交。
[0066]接合點.如果存在mecA變體，本發明方法除了擴增mecA變體還可包括，通過在擴增反應中利用用於擴增SCCmec盒與金黃色葡萄球菌染色體DNA的右末端接合點的第二寡核苷酸組，擴增在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)，其中SCCmec盒包含mecA，所述第二寡核苷酸組包含:
[0067]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0068]b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0069]其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包括包含mecA的MRSA，則右接合點被擴增。第二寡核苷酸組還可包含第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在MRSA的在第一接合寡核苷酸的雜交區域與第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，其中如果樣品包括包含右末端接合點的MRSA，則檢測到第三接合寡核苷酸的雜交。
[0070]第三接合寡核苷酸可以是探針。第三接合寡核苷酸可具有能夠在SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，或其可具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。可選地，可進行檢測方法諸如使用嵌入染料。第一接合寡核苷酸可作為擴增引物起作用，可具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
[0071]本發明的任何反應中使用的引物和探針能夠與靶核酸特異性地雜交。特異性雜交是本領域已知的，且通常，特異性雜交通過引物/探針與靶核酸的核酸同一性或高相似性和/或通過使用嚴格的雜交條件(例如，嚴格的溫度和/或鹽條件)實現。特異性雜交提供與反應中的靶的選擇性雜交。
[0072]通常，對於擴增orfX-mecA變體核酸以外的擴增反應(諸如擴增接合點、非變體mecA和/或金黃色葡萄球菌染色體區域)，選擇引物使得利用其和第二引物(位於金黃色葡萄球菌基因組序列中)合成的擴增產物的長度將為大約10nt至350nt。儘管可設計PCR擴增以產生更長或更短的擴增子 U^i^n，50nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、100nt 或更長)，本發明中對於用於檢測 mecA、接合點或金黃色葡萄球菌染色體基因的基於轉錄的(例如，NASBA或TMA)或PCR型反應的優選的擴增子長度將是約10nt至300nt之內(例如150nt、200nt、250nt、300nt)的長度。另外，對於多重擴增反應，無論是基於轉錄的或基於PCR的，在10nt至300nt的範圍中或更短的擴增子是對這些靶優選的，以增強檢測的靈敏度。注意，利用具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列的第一寡核苷酸和具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列的第二寡核苷酸的擴增將具有比可形成本檢驗的部分的其他擴增中通常使用的更長的擴增子。還注意的是，隨著擴增方法被進一步開發和精煉，更長的擴增子可變得可能且最終是常規的，並由本發明涵蓋。
[0073]引物被定向使得，「在擴增條件下，接合點被擴增」包括引物被定向使得，在與其特異性靶核酸雜交後，和在包括引物的擴增反應起始後，形成包含該接合點的擴增子。此類反應被設計以跨接合點擴增(即，足夠地接近接合點，使得典型的擴增反應將延伸跨過接合點)。因此，可用於擴增接合點的引物對通常將與圍繞接合點的兩個區域雜交，且每個引物將被定向為以5』 -3』方向朝向接合點雜交。通常，引物將被設計以在接合點的600nt、500nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、50nt、30nt、25nt、20nt、等等內雜交。因此，選擇用於檢測擴增產物的探針以能夠在SCCmec盒的右末端接合區的在引物的靶序列之間的區域內特異性地雜交。例如，探針可在金黃色葡萄球菌基因組序列(例如，orfX、在金黃色葡萄球菌探針的靶序列與接合點之間)中或在SCCmec (在SCCmec引物的靶序列與接合點之間)中或跨接合點雜交。在某些實施方案中，此類探針可完全在SCCmec盒內或主要在SCCmec盒內特異性地雜交。在一個實施方案中，其中探針主要在SCCmec盒內特異性地雜交，探針雜交的區域可另外包含接合點，且因此包含orfX的鄰接接合點的至少一個、或兩個或三個或數個核苷酸。通常，選擇引物使得利用其和第二引物(位於金黃色葡萄球菌基因組序列中)合成的擴增產物的長度將是大約10nt至350nt。儘管可設計PCR擴增以產生更長的擴增子(例如，150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、100nt或更長)，本發明中對於用於檢測mecA、接合點或金黃色葡萄球菌染色體基因的基於轉錄的(例如，NASBA或TM)或PCR型反應的優選的擴增子長度將是約10nt至300nt之內(例如150nt、200nt、250nt、300nt)的長度。另外，對於多重擴增反應，無論是基於轉錄的或基於PCR的，在10nt至300nt的範圍中或更短的擴增子是對這些靶優選的，以增強檢測的靈敏度。考慮到本文的教導和本領域中的知識和技術，可容易地設計可用於擴增末端接合區的特異性引物。
[0074]如權利要求書中所用的，「擴增條件」是適合用於所選的擴增反應的那些，如本領域技術人員已知的，諸如用於各種擴增反應中的那些。此類條件可針對特定反應、引物等等優化，如也是本領域技術人員已知的。如已知的，此類擴增條件除了其他方面之外包括與擴增所需的試劑例如，核苷酸和酶接觸，以及適當選擇的溫度、鹽和PH條件。此外，如在權利要求書中所用的，引物或探針可以是引物或探針組，即，多個引物或探針。此類引物/探針組可在其中期望擴增和/或檢測多於一種類型或亞型的MRSA的反應中利用，且其中選擇用於引物和/或探針雜交的靶MRSA區域的核酸序列在類型和/或亞型之間不同。可針對每種類型或亞型設計單獨的引物/探針，如本文示例的。
[0075]mecA.本方法可另外包括通過在擴增反應中利用用於擴增mecA元件的第三寡核苷酸組，擴增包含mecA的金黃色葡萄球菌，所述第三寡核苷酸組包含:
[0076]a.第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠在mecA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0077]b.第二 mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能夠在mecA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，其中第一 mecA寡核苷酸和第二 mecA寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，mecA的部分被擴增。第三寡核苷酸組還可包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸具有能夠在mecA的在第一 mecA寡核苷酸的雜交區域與第二 mecA寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0078]其中如果樣品包括包含mecA的MRSA，則檢測到第三mecA寡核苷酸的雜交。可選地，可使用檢測方法諸如使用嵌入染料。用於mecA的引物的實例可包括SEQ ID NO: 12和13。
[0079]擴增mecA DNA的部分是指對樣品進行擴增反應，產生包括對應mecA基因的任何標識部分(indentifying port1n)的序列的擴增產物,例如,包括SEQ ID NO: 12和13中所列核酸序列的引物之間的區域的擴增產物。擴增可利用在引物的靶核酸之間雜交的探針檢測，或利用嵌入染料檢測。可容易地設計引物和探針，用於與已知的mecA序列雜交。
[0080]金黃色葡萄球菌染色體.本方法還可包括利用用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0081 ] a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0082] b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，其中第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增。第四寡核苷酸組還可包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，其中如果樣品包含金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域，則檢測到第三寡核苷酸的雜交。此類第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸可作為探針起作用。金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA可以是任何已知的金黃色葡萄球菌特異性基因組區域，諸如在基因spa、orfX或nuc中的區域。用於spa的引物的實例可包括SEQ ID N0:24和25，且探針的實例可包括SEQ ID N0:26o用於orfX的引物的實例可包括SEQ ID N0:9和10，且探針的實例可包括SEQ ID NOill0用於nuc的引物的實例可包括SEQ ID NO: 27、28和30，且探針的實例可包括SEQ ID N0:29。可選地，可進行檢測方法諸如使用嵌入染料。
[0083]本發明包括一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述方法包括利用以下對樣品進行擴增反應:
[0084]a.第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0085]I)第一 mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0086]2)第二 mecA變體寡核苷酸,所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和
[0087]b.第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0088]I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0089]2)第二 mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包含MRSA，則MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域被擴增。第一寡核苷酸組還可包含第三mecA變體寡核苷酸，所述第三mecA變體寡核苷酸能夠在MRSA的在第一 mecA變體寡核苷酸的雜交區域和第二 mecA變體寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，且其中如果樣品包括包含mecA變體元件的MRSA，則檢測到第三mecA變體寡核苷酸的雜交。第二寡核苷酸組還可包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸能夠在MRSA的在第一 mecA寡核苷酸的雜交區域和第二 mecA寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，且其中如果樣品包括包含mecA的MRSA，則檢測到第三mecA寡核苷酸的雜交。此類第三寡核苷酸可以是探針。可選地，可進行檢測方法諸如使用嵌入染料 。例如，第一 mecA變體寡核苷酸可包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15和20。第二 mecA變體寡核苷酸可包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO: 16、17和21。第三mecA變體寡核苷酸可包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:8、18和19。在此類方法中，mecA變體可以是π^οΑ?ω251或其可以是另一種mecA變體。
[0090]接合點.擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,還可包括擴增另外的MRSA和/或金黃色葡萄球菌元件。例如，所述方法可包括，通過在擴增反應中利用用於擴增SCCmec盒與金黃色葡萄球菌染色體DNA的右末端接合點的第二寡核苷酸組，擴增在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA),其中SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸組包含:
[0091 ] a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0092]b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0093]其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包括包含mecA的MRSA，則右接合點被擴增。第三寡核苷酸組還可包含第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在MRSA的在第一接合寡核苷酸的雜交區域與第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，其中如果樣品包括包含右末端接合點的MRSA，則檢測到第三接合寡核苷酸的雜交。第三接合寡核苷酸可具有能夠在SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列。第一接合寡核苷酸可具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。第三接合寡核苷酸可具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。可選地，可進行檢測方法諸如使用嵌入染料。
[0094]金黃色葡萄球菌.擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,還可包括利用用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含以下:
[0095]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0096]b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，其中第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增。第四寡核苷酸組還可包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0097]其中如果樣品包含金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域，則檢測到第三寡核苷酸的雜交。此類第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸可作為探針起作用。可選地，可進行檢測方法諸如使用嵌入染料。金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA可選自，例如，spa、orfX和nuc ;然而，可使用如可以是本領域技術人員已知的其他金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA靶。
[0098]應認識到，除了檢測mecA變體存在的擴增反應，本發明包括，可另外擴增一種或更多種另外的相關序列，諸如帶有mecA變體的SCCmec類型以外的SCCmec類型的SCCmec接合點、mecA(非變體)、和金黃色葡萄球菌特異性染色體序列的擴增反應。人們可以在多重反應或在單獨的反應中組合這些另外的擴增反應的任一個或全部。
[0099]多重擴增反應是指，用於擴增多於一種靶的特異性試劑在一起接觸，使得在同一反應容器中可發生多於一種擴增。另外，可包括用於多於一種靶的檢測試劑。因此，通過將用於擴增和檢測多於一種靶的所有特異性試劑置於接觸，人們可進行多重擴增和檢測反應。因此，在多重反應中，人們可在同一反應中擴增多個靶區域。多個擴增反應也可順序地運行。如果多重不是期望的或不可行，還可利用同時擴增，其中允許單獨的反應同時進行，但用於多於一種擴增反應的試劑不必都在同一反應容器或管中，而是在分別的反應容器中進行。應理解的是，即使在多重擴增反應中，每個反應將在提供的條件下以單獨的反應進行的任何速度發生。檢測也可以是「同時」的，表示如果在反應容器中包括用於每個反應的適當的探針，那麼在適當的條件下，多於一種靶的檢測可在單個反應容器(多重)或在多於一種反應容器(適當的探針被分配到相關的反應容器)中實現。如果期望，此類檢測可在同一反應容器中作為多重或同時擴增反應進行，且另外，可在擴增反應繼續時進行(即，實時)。在單個容器中可包含為採用的具體擴增和檢測方法定製的反應混合物的所有組分。因此，「反應混合物」可包括用於進行反應的所有必需試劑，其可包括但不限於，在反應期間維持PH在所選水平的緩衝劑、鹽、輔因子、清除劑、等等。
[0100]如權利要求書中所用的，「擴增條件」是適合用於所選的擴增反應的那些，如本領域技術人員已知的，諸如用於各種擴增反應中的那些。此類條件可針對特定反應、引物等等優化，如也是本領域技術人員已知的。如已知的，此類擴增條件除了其他方面之外包括與擴增所需的試劑例如，核苷酸和酶接觸，以及適當選擇的溫度、鹽和PH條件。此外，如在權利要求書中所用的，引物或探針可以是引物或探針組，即，多個引物或探針。此類引物/探針組可在其中期望擴增和/或檢測多於一種類型或亞型的MRSA的反應中利用，且其中選擇用於引物和/或探針雜交的靶MRSA區域的核酸序列在類型和/或亞型之間不同。可針對每種類型或亞型設計單獨的引物/探針，如本文示例的。
[0101]如本文使用的，「具有」靶DNA的部分中包含的核酸序列的寡核苷酸是指該序列與靶DNA序列、或其互補序列具有足夠的同一性，以在嚴格雜交條件下與該靶DNA特異性地並選擇性地雜交。其包括與序列具有完全序列同一性的核酸序列。
[0102]通常，產生擴增子(多核苷酸擴增反應的產物)的擴增反應是「模板驅動的」，因為，反應物，無論是核苷酸或寡核苷酸的鹼基配對，在產生反應產物所需的模板多核苷酸中具有互補序列。在一方面，模板驅動的反應是以核酸聚合酶的引物延伸或以核酸連接酶的寡核苷酸連接。擴增可包括任何已知的或新設計的擴增方法，包括在公布的方法中使用的那些(例如，基於轉錄的擴增諸如轉錄介導的擴增(TMA)和基於核酸序列的擴增NASBA (如本文示例的)、和循環核酸擴增技術(熱循環)諸如聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、和連接酶鏈式反應(LCR)、以及任何擴增方法，例如，自主序列複製(3SR)、鏈置換擴增(SDA)、分支DNA (bDNA)、循環探針技術(CPT)、固相擴增(SPA)、滾環擴增技術(RCA)、固相RCAJSS SDA和核酸酶依賴性信號擴增(NDSA)，其所有都是本領域技術人員已知的)。擴增反應可以是「實時」擴增，如果允許隨著擴增反應進展測量反應產物的檢測化學反應是可獲得的，例如實時PCR或實時NASBA。因此，本發明包括可用於增加基於核酸的診斷檢測的靈敏度和/或速度的任何核酸擴增方法或任何其他程序的使用。本發明還包括任何檢測技術的使用，包括擴增後檢測技術、與檢測的組合的任何擴增技術、任何雜交核酸晶片或陣列技術、和任何擴增晶片或擴增和雜交晶片技術的組合。通過任何核苷酸測序方法的檢測和鑑定也在本發明中。
[0103]本發明中可利用多種檢測方法。利用核酸探針的檢測方法是本領域公知的。本試劑盒的和/或用於本方法中的探針可被適於所選檢測方法的任何選擇的標記物標記，所述標記物中的許多是本領域已知的，諸如磷酸酶(例如，鹼性磷酸酶)、生物素、親和素、過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶)、地高辛(digoxigenin)、螢光染料(諸如Cy3和Cy5染料、螢光素、FAM、R0X)、化學發光標記物、發色團標記物、放射性標記物(例如,放射性同位素)和配體。可使用用於不同檢測方法諸如IE -捕獲、HPA、TaqMan、分子信標、scorp1ns和夾心雜交的探針設計。雜交條件可根據所選的探針類型和檢測反應類型來選擇。另外，可使用嵌入染料。嵌入染料是與雙鏈DNA特異性地結合、在如此結合後明亮地發螢光；在雙鏈DNA不存在時，沒有物質與其結合，僅以低水平發螢光的染料。檢測通過測量擴增循環的整個期間突光的增加來監測。如果需要，嵌入染料可與熔解分析(melt analysis) 一起使用，如本領域已知的。嵌入染料的實例可包括但不限於，溴化乙錠、SYE3R? Green、LC Green、LC Green Plus、ResoLight、EvaGreen、Chromofy 和 SYT09。本領域技術人員將已知其他的嵌入染料且新的此類染料可變得可獲得。
[0104]本方法還提供用在此類擴增和檢測方法中的有用的試劑盒。具體地，本發明提供一種用於擴增甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA變體元件，所述試劑盒包含第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0105]a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0106]b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列。此類試劑盒還可包含第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。此類第三寡核苷酸可以是探針。在優選的實施方案中，第一寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:9和10。還在優選的實施方案中，第二寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、7、14、15、16、17、20和21。此外，在另一優選的實施方案中，第三寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8.:8、18和19所列的核酸序列。這一試劑盒可用於檢測的mecA變體可以是HiecAum251或另一種mecA變體。
[0107]本發明的用於擴增甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA變體元件，還可包含一種或更多種另外的元件，包括用於檢測另外的MRSA和MSSA元件的寡核苷酸組。儘管在本文有時描述為「第二」、「第三」或「第四」寡核苷酸組，另外的核苷酸組的選擇是與其他選擇獨立的。例如，試劑盒可包含用於擴增一種或更多種帶有mecA變體的SCCmec類型以外的SCCmec類型的SCCmec接合點、mecA(非變體)、和金黃色葡萄球菌染色體序列的寡核苷酸組。在一個實例中，試劑盒可包含第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0108]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0109]b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能夠在SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列。在另一實例中，所述試劑盒可包含用於擴增mecA元件的第三寡核苷酸組，所述第三寡核苷酸組包含:
[0110]a.第一 mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠在mecADNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0111]b.第二 mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠在mecADNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列。另一實例假設，所述試劑盒可包含用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0112]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0113]b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0114]本發明的另一種試劑盒提供了一種用於擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件。
[0115]a)第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0116]I)第一 mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0117]2)第二 mecA變體寡核苷酸,所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和
[0118]b)第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0119]I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0120]2)第二 mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列。試劑盒在第一寡核苷酸組中還可包含第三mecA變體寡核苷酸，所述第三mecA變體寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。在第二寡核苷酸組中其可包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。在特定實例中，第一 mecA變體寡核苷酸可包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:9和10。在另一實例中，第二 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、7、14、15、16、17、20和21。在另一實施方案中，在第一寡核苷酸組中，第三mecA變體寡核苷酸包含如SEQ ID N0:8.:8、18和19所列的核酸序列。在任何這種試劑盒中，mecA變體優選地可以是mecA^^ ;然而,其可以是另一種mecA變體。
[0121]本發明的試劑盒還可包含第三寡核苷酸組，所述第三寡核苷酸組包含:
[0122]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列jPb.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在包含mecA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下,在MRSA的存在下,其中SCCmec盒包含mecA, SCCmec盒右插入接合點被擴增。第三寡核苷酸組還可包含第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在MRSA的在第一接合寡核苷酸的雜交區域與第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0123]本發明的試劑盒還可包含第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0124]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0125]b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，其中第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，在MRSA的存在下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增。第四寡核苷酸組還可包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0126]本發明的探針，包括在此類試劑盒中包含的那些，可有利地被標記用於檢測，如本領域技術人員已知的。標記物可針對特定設計和將進行的擴增反應類型適當地選擇。引物和探針反應物可以以多種狀態的任一種提供，包括乾燥的、凍幹的、壓片的(pelleted)、噴霧乾燥的、或以液體形式。
[0127]本發明的試劑盒可包含另外的組成部分，諸如用於選擇的擴增方法的試劑(除了其他的之外，例如，擴增酶、緩衝液、和/或限制性酶)、對照、反應容器、等等。如果將使用嵌入染料，其可被包含在試劑盒中。另外，本發明的試劑盒可包括構成如本文描述的試劑盒的容器。組成部分可在單個容器或在多於一種容器中提供。此類試劑盒對於進行多重擴增可以是有用的。
[0128]注意，對包含胸苷的引物和探針序列的提及可被容易地調適以在對特定檢驗有用時，利用尿苷取代胸苷。此外，核苷酸可通過加入化學基團或可通過類似物(例如，2』 -O-甲氧基形式)取代單獨的殘基來修飾。另外的此類修飾的核苷酸是本領域已知的；一些實例包括羥甲基核苷酸、甲基化核苷酸、氟化核苷酸、α硫代磷酸核苷酸、胺修飾的核苷酸、甲氧基核苷酸、羧甲基核苷酸、硫代核苷酸、肌苷、二氫尿苷、假尿苷、懷丁苷(wybutosine)、Q苷、C7dGTP。另外的修飾的核苷酸見於美國專利號5，405，950和5，633，364 ( 二者都是Mock和Lovern的)。此外，探針可包括DNA、RNA、修飾的DNA或RNA、PNA、使用核苷酸鹼基作為與靶選擇性地雜交的手段的其他合成的核酸或核酸取代物。
[0129]本方法可用於任何選擇的樣品，諸如直接的患者樣品，例如，鼻或腹股溝拭樣、會陰拭樣、腋窩拭樣、咽喉拭樣、直腸拭樣、來自傷口的樣品，都特別適用於篩選，以及特別適用於診斷，支氣管肺泡灌洗液或血液(例如，敗血病或血液培養物)。此類樣品通常包含生物體的混合群體。另外，如果需要，這一方法可適用於僅具有單個細菌物種或菌株的樣品，例如，利用MRSA的分離、培養、捕獲、和/或富集的樣品。
[0130]本發明另外的方面在本文以下描述。
[0131] 本發明還涉及一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA變體元件,所述方法包括:
[0132]利用包含以下的寡核苷酸組對樣品進行擴增反應:
[0133]a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0134]b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列，
[0135]其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包含MRSA，則MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域被擴增。
[0136]任選地，金黃色葡萄球菌染色體DNA的末端接合區是右末端接合區。
[0137]任選地，寡核苷酸組還包含第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，且
[0138]其中如果樣品包含MRSA，則檢測到第三寡核苷酸的雜交。
[0139]任選地，根據本發明的方法還包括將所擴增的樣品與嵌入染料接觸，其中如果樣品包含MRSA，則檢測到染料向擴增產物的嵌入。
[0140]任選地，第三寡核苷酸與金黃色葡萄球菌染色體DNA的區域特異性地雜交。
[0141]任選地，第三寡核苷酸與金黃色葡萄球菌染色體DNA的orfX的區域特異性地雜交。
[0142]任選地，第三寡核苷酸與SCCmec盒DNA的右末端接合區的區域特異性地雜交。
[0143]任選地,第三寡核苷酸與mecA變體的區域特異性地雜交。
[0144]任選地，第一寡核苷酸與金黃色葡萄球菌染色體DNA的orfX的區域特異性地雜交。
[0145]任選地，mecA變體是 mecAu^i。
[0146]任選地，第一寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO: 9和10。
[0147]任選地，第二寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、7、14、15、16、17、20 和 21。
[0148]任選地，第三寡核苷酸包含如SEQ ID N0:8、ll、18和19所列的核酸序列。
[0149]任選地，根據本發明的方法還包括，通過在擴增反應中利用用於擴增SCCmec盒與金黃色葡萄球菌染色體D NA的右末端接合點的第二寡核苷酸組，擴增在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)，其中SCCmec盒包含mecA，所述第二寡核苷酸組包含:
[0150]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0151]b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0152]其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包括包含mecA的MRSA，則右接合點被擴增。
[0153]任選地，第二寡核苷酸組還包含第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在MRSA的在第一接合寡核苷酸的雜交區域與第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0154]其中如果樣品包括包含右末端接合點的MRSA，則檢測到第三接合寡核苷酸的雜交。
[0155]任選地，第三接合寡核苷酸具有能夠在SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0156]任選地，第三接合寡核苷酸具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
[0157]任選地，第一寡核苷酸具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
[0158]任選地，根據本發明的方法還包括，通過在擴增反應中利用用於擴增mecA元件的第三寡核苷酸組，擴增包含mecA的金黃色葡萄球菌，所述第三寡核苷酸組包含:
[0159]a.第一 mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠在mecADNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0160]b.第二 mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠在mecADNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0161]其中第一 mecA寡核苷酸和第二 mecA寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，mecA DNA的部分被擴增。
[0162]任選地，第三寡核苷酸組還包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸具有能夠在mecA的在第一 mecA寡核苷酸的雜交區域和第二 mecA寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列
[0163]其中如果樣品包括包含mecA的MRSA，則檢測到第三mecA寡核苷酸的雜交。
[0164]任選地，根據本發明的方法還包括利用用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0165]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0166]b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0167]其中第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增。
[0168]任選地，第四寡核苷酸組還包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0169]其中如果樣品包含金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域，則檢測到第三寡核苷酸的雜父。
[0170]任選地，金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA選自由spa、orfX和nuc組成的組。
[0171]本發明還涉及一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述方法包括:
[0172]利用以下對樣品進行擴增反應:
[0173]a.第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0174]I)第一 mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0175]2)第二 mecA變體寡核苷酸,所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0176]b.第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0177]I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0178]2)第二 mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列，
[0179]其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包含MRSA，則MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域被擴增。
[0180]任選地，第一寡核苷酸組還包含第三mecA變體寡核苷酸，所述第三mecA變體寡核苷酸能夠在MRSA的在第一 mecA變體寡核苷酸的雜交區域和第二 mecA變體寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，和
[0181]其中如果樣品包括包含mecA變體元件的MRSA，則檢測到第三mecA變體寡核苷酸的雜交。
[0182]任選地，第二寡核苷酸組還包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸能夠在MRSA的在第一 mecA寡核苷酸的雜交區域和第二 mecA寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，且
[0183]其中如果樣品包括包含mecA的MRSA，則檢測到第三mecA寡核苷酸的雜交。
[0184]任選地，根據本發明的方法還包括將所擴增的樣品與嵌入染料接觸，其中如果樣品包含MRSA，則檢測到染料向擴增產物的嵌入。
[0185]任選地，第一 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ IDN0:6、7、14、15 和 20。
[0186]任選地，第二 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ IDN0:16、17 和 21。
[0187]任選地，第三mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ IDN0:8、18 和 19。
[0188]任選地，mecA變體是 mecALGA251。
[0189]任選地，根據本發明的方法還包括，通過在擴增反應中利用用於擴增SCCmec盒與金黃色葡萄球菌染色體DNA的右末端接合點的第二寡核苷酸組，擴增在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)，其中SCCmec盒包含mecA，所述第二寡核苷酸組包含:
[0190]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0191]b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0192]其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果樣品包括包含mecA的MRSA，則右接合點被擴增。
[0193]任選地，第三寡核苷酸組還包含第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在MRSA的在第一接合寡核苷酸的雜交區域與第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0194]其中如果樣品包括包含右末端接合點的MRSA，則檢測到第三接合寡核苷酸的雜交。
[0195]任選地，第三接合寡核苷酸具有能夠在SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0196]任選地，第一接合寡核苷酸具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
[0197]任選地，第三接合寡核苷酸具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
[0198]任選地，根據本發明的方法還包括利用用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0199]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0200]b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0201]其中第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增。
[0202]任選地，第四寡核苷酸組還包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0203]其中如果樣品包含金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域，則檢測到第三寡核苷酸的雜父。
[0204]任選地，金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA選自由spa、orfX和nuc組成的組。
[0205]本發明的另一目的是一種用於擴增甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入,其中SCCmec盒包含mecA變體元件,所述試劑盒包含第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0206]a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0207]b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列。
[0208]任選地，根據本發明的試劑盒還包含第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。
[0209]任選地，第一寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO: 9和10。
[0210]任選地，第二寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、7、14、15、16、17、20 和 21。
[0211]任選地，第三寡核苷酸包含如SEQ ID N0:8、18和19所列的核酸序列。
[0212]任選地，mecA變體是 mecALGA251。
[0213]任選地，根據本發明的試劑盒還包含第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0214]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0215]b.第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能夠在SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0216]任選地，根據本發明的試劑盒還包含用於擴增mecA元件的第三寡核苷酸組，所述第三寡核苷酸組包含:
[0217]a.第一 mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠在mecADNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0218]b.第二 mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠在mecADNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0219]任選地，根據本發明的試劑盒還包含用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0220]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0221 ] b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0222]本發明的另一目的是一種用於擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述試劑盒包含:
[0223]a)第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含:
[0224]I)第一 mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0225]2)第二 mecA變體寡核苷酸,所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0226]b)第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含:
[0227]I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和
[0228]2)第二 mecA寡核苷酸,所述第二mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列，
[0229]每個組被定向使得，當樣品與寡核苷酸組被置於擴增條件下時，如果樣品包含MRSA，則可發生擴增。
[0230]任選地，根據本發明的試劑盒在第一寡核苷酸組中還包含第三mecA變體寡核苷酸，所述第三mecA變體寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。
[0231]任選地，根據本發明的試劑盒在第二寡核苷酸組中還包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸能夠在MRSA的在第一寡核苷酸的雜交區域和第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。
[0232]任選地，第一mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO: 9和10。
[0233]任選地，第二 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ IDN0:6、7、14、15、16、17、20 和 21。
[0234]任選地，第三mecA變體寡核苷酸包含如SEQ ID N0:8、18和19所列的核酸序列。
[0235]任選地，mecA變體是 mecA!^；^。
[0236]任選地，根據本發明的試劑盒還包含第三寡核苷酸組，所述第三寡核苷酸組包含:
[0237]a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0238]b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在包含mecA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0239]其中第一接合寡核苷酸和第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，在MRSA的存在下，其中SCCmec盒包含mecA，SCCmec盒右插入接合點被擴增。
[0240]任選地，第三寡核苷酸組還包含第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在MRSA的在第一接合寡核苷酸的雜交區域與第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0241]任選地，根據本發明的試劑盒還包含第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含:
[0242]a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和
[0243]b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，
[0244]其中第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，在MRSA的存在下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增。
[0245]任選地，第四寡核苷酸組還包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌DNA的在第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列。
[0246] 本發明在以下實施例中示例。如遍及說明書中教導的，mecA變體的檢測可以以任何期望的組合、以多重或多個單重形式與另一期望的檢驗，諸如用於mecA、基因組金黃色葡萄球菌和/或SCCmec接合點的引物和/或探針組合。
實施例
[0247]擴增備件
[0248]利用PCR的擴增可在標準條件下進行。此類條件可包括:
[0249]混合物製備(反應以25 μ L進行):
[0250]

【權利要求】
1.一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)的方法,所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)染色體DNA中包含SCCmec盒的插入,其中所述SCCmec盒包含mecA變體元件,所述方法包括: 利用包含以下的寡核苷酸組對所述樣品進行擴增反應: a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和 b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列，和任選地， c.第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能夠在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的雜交區域和所述第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交， 其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果所述樣品包含所述MRSA，則所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的雜交區域和所述第二寡核苷酸的雜交區域之間的所述 區域被擴增，且其中如果使用所述第三寡核苷酸，那麼如果所述樣品包含所述MRSA，則檢測到所述第三寡核苷酸的雜交。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述金黃色葡萄球菌染色體DNA的末端接合區是右末端接合區。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述第三寡核苷酸與以下特異性地雜交: 金黃色葡萄球菌染色體DNA的區域；金黃色葡萄球菌染色體DNA的orfX的區域；SCCmec盒DNA的右末端接合區的區域；或所述mecA變體的區域。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸與金黃色葡萄球菌染色體DNA的orfX的區域特異性地雜交。
5.根據權利要求1所述的方法，其中: -所述第一寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:9和10 ;和/或 -所述第二寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、7、14、15、16、17,20和21和/或 -如果使用所述第三寡核苷酸，則所述第三寡核苷酸包含如SEQ ID N0:8、ll、18和19所列的核酸序列。
6.根據權利要求1至5的任一項所述的方法，所述方法還包括，通過在擴增反應中利用用於擴增SCCmec盒與金黃色葡萄球菌染色體DNA的右末端接合點的第二寡核苷酸組，擴增在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA),其中所述SCCmec盒包含mecA,所述第二寡核苷酸組包含: a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列； b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在所述包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，和任選地， c.第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的雜交區域與所述第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列，其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果所述樣品包含所述包含mecA的MRSA,則所述右接合點被擴增， 且其中如果使用所述第三接合寡核苷酸，那麼如果所述樣品包含所述包含所述右末端接合點的MRSA，則檢測到所述第三接合寡核苷酸的雜交。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述第三接合寡核苷酸具有能夠在以下中特異性地雜交的核酸序列: -所述SCCmec盒的右末端接合區的區域，或 -orfX。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述第一寡核苷酸具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
9.根據權利要求1至8的任一項所述的方法，所述方法還包括，通過在擴增反應中利用用於擴增mecA元件的第三寡核苷酸組，擴增包含mecA的金黃色葡萄球菌，所述第三寡核苷酸組包含: a.第一mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠在mecA DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠在mecA DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中所述第一 mecA寡核苷酸和所述第二 mecA寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，所述mecA DNA的部分被擴增 且其中，任選地，所述第三寡核苷酸組還包含第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸具有能夠在所述mecA的在所述第一 mecA寡核苷酸的雜交區域與所述第二 mecA寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中如果使用所述第三mecA寡核苷酸,那麼如果所述樣品包含所述包含mecA的MRSA,則檢測到所述第三mecA寡核苷酸的雜交。
10.根據權利要求1至9的任一項所述的方法，所述方法還包括利用用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含: a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，所述金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增 且其中，任選地，所述第四寡核苷酸組還包含第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在所述金黃色葡萄球菌DNA的在所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中如果使用所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，那麼如果所述樣品包含所述金黃色葡萄球菌DNA的在所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的所述區域，則檢測到所述第三寡核苷酸的雜交。
11.一種擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中所述SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述方法包括: 利用以下對所述樣品進行擴增反應: a.第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含: 1)第一mecA變體寡核苷酸,所述第一mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和 2)第二mecA變體寡核苷酸,所述第二mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和任選地 3)第三mecA變體寡核苷酸，所述第三mecA變體寡核苷酸能夠在所述MRSA的在所述第一 me cA變體寡核苷酸的雜交區域和所述第二 mecA變體寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，其中如果所述樣品包含所述包含mecA變體元件的MRSA，則檢測到所述第三me cA變體寡核苷酸的雜交；和 b.第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含: 1)第一mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列， 2)第二mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列，和任選地 3)第三mecA寡核苷酸,所述第三mecA寡核苷酸能夠在所述MRSA的在所述第一mecA寡核苷酸的雜交區域和所述第二 mecA寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交，其中如果所述樣品包含所述包含mecA的MRSA,則檢測到所述第三mecA寡核苷酸的雜交； 其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果所述樣品包含所述MRSA，則所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的雜交區域和所述第二寡核苷酸的雜交區域之間的所述區域被擴增。
12.根據權利要求11所述的方法，其中: -所述第一 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:6、7、14、15和20 ;和/或 -所述第二 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO:16、17和21和/或 -如果使用所述第三mecA變體寡核苷酸，則所述mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO:8,18 19。
13.根據權利要求1至11的任一項所述的方法，其中所述mecA變體是mecAm；^。
14.根據權利要求11所述的方法，所述方法還包括，通過在擴增反應中利用用於擴增SCCmec盒與金黃色葡萄球菌染色體DNA的右末端接合點的第三寡核苷酸組，擴增在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)，所述第二寡核苷酸組包含: a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在所述包含mecA的MRSA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，如果所述樣品包含所述包含mecA的MRSA，則所述右接合點被擴增，和任選地， c.第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的雜交區域與所述第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中如果所述樣品包含所述包含所述右末端接合點的MRSA，則檢測到所述第三接合寡核苷酸的雜交。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述第三接合寡核苷酸: -具有能夠在所述SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，或 -具有能夠在orfX中特異性地雜交的 核酸序列。
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述第一接合寡核苷酸具有能夠在orfX中特異性地雜交的核酸序列。
17.根據權利要求11至14的任一項所述的方法，所述方法還包括利用用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含: a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，所述金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增，和任選地 c.第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在所述金黃色葡萄球菌DNA的在所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列， 其中如果所述樣品包含所述金黃色葡萄球菌DNA的在所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的所述區域，則檢測到所述第三寡核苷酸的雜交。
18.根據權利要求10至17的任一項所述的方法，其中所述金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA選自由spa、orfX和nuc組成的組。
19.根據權利要求1至18的任一項所述的方法，所述方法還包括將所擴增的樣品與嵌入染料接觸，其中如果所述樣品包含所述MRSA，則檢測到所述染料向擴增產物的嵌入。
20.一種用於擴增甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中所述SCCmec盒包含mecA變體元件，所述試劑盒包含第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含: a.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有能夠與金黃色葡萄球菌染色體DNA在末端接合區中的區域特異性地雜交的核酸序列，和 b.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸具有能夠與mecA變體的區域特異性地雜交的核酸序列， 和任選地C.第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能夠在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的雜交區域和所述第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交。
21.根據權利要求20所述的試劑盒，其中: -所述第一寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO:9和10;和/或 -所述第二寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、14、15、16、17,20和21，和/或 -如果存在所述第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
22.根據權利要求20或權利要求21所述的試劑盒，所述試劑盒還包含以下寡核苷酸組的一種或更多種: -第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含: a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在所述SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列；和/或 -第三寡核苷酸組，所述第三寡核苷酸組用於擴增mecA元件，所述第三寡核苷酸組包含: a.第一mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠在mecA DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠在mecA DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列；和/或 -第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組用於擴增金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA，所述第四寡核苷酸組包含: a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列。
23.一種用於擴增樣品中甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，所述甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌染色體DNA中包含SCCmec盒的插入，其中所述SCCmec盒包含mecA或mecA變體元件,所述試劑盒包含: a)第一寡核苷酸組，所述第一寡核苷酸組包含: 1)第一mecA變體寡核苷酸,所述第一 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和 2)第二mecA變體寡核苷酸,所述第二 mecA變體寡核苷酸具有能夠與mecA變體元件的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和任選地， 3)第三mecA變體寡核苷酸，所述第三mecA變體寡核苷酸能夠在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的雜交區域和所述第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交；和 b)第二寡核苷酸組，所述第二寡核苷酸組包含: I)第一 mecA寡核苷酸,所述第一 mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第一區域特異性地雜交的核酸序列，和 2)第二mecA寡核苷酸,所述第二 mecA寡核苷酸具有能夠與mecA的第二區域特異性地雜交的核酸序列；和任選地， 3)第三mecA寡核苷酸，所述第三mecA寡核苷酸能夠在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的雜交區域和所述第二寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交， 每個組被定向使得，當樣品與所述寡核苷酸組被置於擴增條件下時，如果所述樣品包含所述MRSA，則可發生擴增。
24.根據權利要求23所述的試劑盒，其中: -所述第一mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID N0:9和10，和/或 -所述第二 mecA變體寡核苷酸包含選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NO:6、7、 14、15、16、17、20 和 21，和 / 或 -所述第三mecA變體寡核苷酸包含如SEQ ID NO:8、18和19所列的核酸序列。
25.根據權利要求20至24的任一項所述的試劑盒,其中所述mecA變體是mecAm；^。
26.根據權利要求23所述的試劑盒，所述試劑盒還包含以下寡核苷酸組的一種或更多種: -第三寡核苷酸組，所述第三寡核苷酸組包含: a.第一接合寡核苷酸，所述第一接合寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌染色體DNA在右末端接合區中的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二接合寡核苷酸，所述第二接合寡核苷酸具有能夠在所述包含mecA的SCCmec盒的右末端接合區的區域中特異性地雜交的核酸序列，其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，在所述MRSA的存在下，其中所述SCCmec盒包含mecA, SCCmec盒右插入接合點被擴增；和任選地， c.第三接合寡核苷酸，所述第三接合寡核苷酸具有能夠在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的雜交區域與所述第二接合寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列；和/或 -第四寡核苷酸組，所述第四寡核苷酸組包含: a.第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的區域中特異性地雜交的核酸序列；和 b.第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA的第二區域中特異性地雜交的核酸序列，其中所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得，在擴增條件下，在MRSA的存在下，金黃色葡萄球菌特異性DNA的部分被擴增， 和任選地， c.第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸，所述第三金黃色葡萄球菌寡核苷酸具有能夠在所述金黃色葡萄球菌DNA的在所述第一金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域與所述第二金黃色葡萄球菌寡核苷酸的雜交區域之間的區域中特異性地雜交的核酸序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK104169437SQ201280070541
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2011年12月23日
【發明者】弗郎索瓦·帕耶, 賽琳·尚邦, 凱西·聖-派屈克 申請人:生物梅裡埃公司