一株產γ‑癸內酯的滴孔菌及其應用的製作方法
2024-04-04 23:22:05
本發明涉及一株產γ-癸內酯的滴孔菌及其在製備γ-癸內酯中的應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
內酯類香料以其獨特的香氣品質在香料行業中佔有重要位置，可用於食品和日用品香精的調配。其中，應用較為廣泛的一種是γ-癸內酯。γ-癸內酯(gamma-decalactone，gdl)，又稱為丙位癸內酯，其分子式為c10h18o2，γ-癸內酯的香氣閾值為11μg/kg，香氣閾值很低，香氣很強，具有甜果香、桃子、椰子、香草以及奶油香氣的味道。γ-癸內酯被美國食品和藥物管理局將其列為一般公認為安全的食品添加劑。中國食品添加劑使用衛生標準也將其列為允許使用的食品用香料。γ-癸內酯是調配牛奶、奶油、黃油、桃子、杏子、漿果、芒果、蘋果、草莓、椰子、柑橘、巧克力等食用香精的常用原料。
天然γ-癸內酯存在於很多水果中，如桃子、草莓、椰子、芒果、杏子等。從這些天然原料中提取是製備天然γ-癸內酯的主要方法。但是由於植物原料的生產受地域和季節限制，難以實現持續和大量的供應。目前γ-癸內酯的主要生產方法是化學合成。然而合成香料生產過程中殘留的化學物質可能對人體健康帶來不利，而且化學合成法合成的γ-癸內酯是無旋光的外消旋混合物，而利用微生物生產則可以得到具有旋光活性和較純的產物，是天然香料生產的大趨勢。
目前發現能夠合成或轉化產生γ-癸內酯的微生物主要為酵母菌和部分絲狀真菌，其中研究最多的為耶羅威亞解脂酵母yarrowialipolytic，該菌種及利用該菌種發酵產生γ-癸內酯的技術已獲得國外專利的保護。
γ-癸內酯是多種微生物代謝的中間產物，以蓖麻油為前體利用微生物發酵可以產生γ-癸內酯。但是，根據目前有關微生物產生γ-癸內酯的文獻，多數報導是有關γ-癸內酯的代謝途徑理論方面的研究，少數涉及的γ-癸內酯的生產的報導也是菌種經過基因工程操作的突變菌株才能達到克級的生產能力。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一株產γ-癸內酯的滴孔菌及其在製備γ-癸內酯中的應用。利用本發明所述菌株可有效地轉化蓖麻油生成γ-癸內酯，實現通過微生物發酵法獲得以γ-癸內酯為主要目的產物的願望。
本發明所述產γ-癸內酯的滴孔菌a-9屬於多孔菌科滴孔菌屬，其特徵在於：該菌株名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，菌株已於2017年5月25日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏號為cgmccn0.13895。
上述產γ-癸內酯及三萜類化合物的滴孔菌a-9是一株發明人自主野外採摘分離純化得到的滴孔菌，其生物學特徵是：子實體無柄，呈現半圓形，大小約20×15cm，單片菌蓋厚度約0.5-1.5cm，菌蓋覆瓦狀排列。子實體正面呈現淡黃色至橙色，邊緣顏色較深，呈現波浪狀或瓣狀，較圓滑，子實體背面呈現白色，邊緣黃色，布滿菌孔。菌絲系統二體型，具有生殖菌絲和骨架菌絲。生殖菌絲具有擔子菌菌絲的顯著特點，即鎖狀聯合。同時該菌生殖菌絲還具有簡單隔膜，但是簡單隔膜的數量較少，且往往出現於菌絲的前端。生殖菌絲的直徑從2-3μm到5-7μm不等。
對本發明所述產γ-癸內酯的滴孔菌a-9cgmccn0.13895測定18srrna以及its的基因序列的結果顯示，其18srdna序列長度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。通過形態觀察和18srrna以及its的基因序列比對，初步鑑定為piptoporussp.。
本發明所述產γ-癸內酯的滴孔菌a-9菌種選育的基本方法是：
菌種系採自於野外的擔子菌子實體。將新鮮的子實體以無菌手術刀切開，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種於pda平板，30℃培養。待菌絲墊直徑達2-3釐米時，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種於新的pda平板，經反覆多次轉接，直至分離得到純菌種。將該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，該菌株已於2017年5月25日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏號為cgmccn0.13895。
本發明所述的產γ-癸內酯的滴孔菌(piptoporussp.)a-9在製備γ-癸內酯中的應用。
其中，所述應用方法涉及的步驟順序如下：
(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；
(2)斜面培養活化：將菌種接種於斜面培養基，27～33℃條件下，靜止培養96～102小時，備用；
(3)種子培養：將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環於90～100ml液體種子培養基中，置旋轉轉速為160～180轉/分鐘、旋轉半徑為40mm的搖床上，27～33℃培養72～96小時，得種子液；
(4)以γ-癸內酯為目的產物發酵培養
搖瓶發酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種於裝有80～100ml(500ml三角瓶)發酵培養基的搖瓶中，27～33℃，轉速為150～180轉/分鐘，ph為5.0±0.5，搖瓶發酵144～168小時，即獲得含γ-癸內酯的發酵產物；
或者，5l發酵罐發酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種於罐裝有3.3～3.5l發酵培養基的5l發酵罐中，27～33℃進行通風攪拌培養，其中攪拌轉速為200～300r/min，通氣量8l/min，罐內壓力1.0±0.02mpa，發酵時間為144～168小時，發酵液初始ph值為5.0～6.0，發酵過程中定時取樣測定發酵液中的菌體乾重和γ-癸內酯的濃度，當發酵液中γ-癸內酯濃度不再上升時，結束髮酵，即獲得含γ-癸內酯的發酵產物；
其中：上述斜面培養基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda；
上述液體種子培養基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；
上述以γ-癸內酯為目的產物發酵培養基的組成是：可溶性澱粉10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，蓖麻油100g，吐溫-20體積比0.05％，七水合硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，十二水合磷酸氫二鈉1.2g/l；去離子水1l，ph5±0.5，滅菌117℃，30min。
上述的應用中，步驟(2)、(3)、(4)所述培養溫度優選30℃。
上述的應用中，步驟(2)所述培養時間優選100小時。
上述的應用中，步驟(3)所述培養時間優選80小時。
上述的應用中，步驟(4)所述培養時間優選150～160小時。
上述的應用中，步驟(4)所述發酵培養基初始可溶性澱粉濃度優選20g/l～30g/l。
上述的應用中，步驟(4)所述發酵培養基的ph優選為5.0。
上述γ-癸內酯按下述方法測定：
氣相色譜檢測：標準樣品製備：取6.33μlγ-癸內酯標準樣品加入到3ml色譜純乙酸丁酯中，即得到濃度為2g/l的γ-癸內酯標準樣品，以此樣品稀釋得到濃度分別為1g/l，0.5g/l，0.25g/l，0.1g/l的標準樣品。
gc分析條件：
進樣口spl1：溫度250℃，壓力：23mpa，控制方式線速度，線速度10.3cm/min，總流量12.5ml/min，柱流量0.5ml/min，吹掃流量2ml/min，分流比20:1，進樣體積1μl。
柱溫：起始溫度100℃，以8℃/min升至250℃，250℃保持20min。
檢測器：氫火焰離子檢測器fid，檢測器溫度275℃，氫氣流量40ml/min，空氣流量400ml/min，尾吹流量3ml/min。
載氣：高純氮氣
取樣時取1ml培養物於5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml於1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測。
本發明公開了一株產γ-癸內酯的滴孔菌(piptoporussp.)a-9，作為自主採摘分離鑑定的新菌株，發明人未檢索到有關利用滴孔菌a-9以生產γ-癸內酯為目的產物的文獻報導，也未檢索到滴孔菌屬其他菌種產γ-癸內酯或與cgmccn0.13895菌株有相當的高產率的文獻報導。實驗證實利用本發明所述滴孔菌cgmccn0.13895可發酵轉化蓖麻油直接生成並獲得目的產物γ-癸內酯，蓖麻油轉化生成γ-癸內酯的轉化率高，菌種發酵性能穩定，是一株極具研究開發價值的γ-癸內酯生產菌株。其為液體發酵生產γ-癸內酯探索了新的方向與途徑，為將來進行發酵生產打下基礎。
本發明採用生物發酵的方法，以可溶性澱粉、蔗糖、豆粕粉等為原料生產γ-癸內酯具有生產方法簡單，條件溫和，原料來源豐富，生產成本低等特點，發酵生產的γ-癸內酯產率最高可達6.5g/l以上，具有較高的應用價值，極具工業化應用前景。
具體實施方式
實施例1產γ-癸內酯的滴孔菌菌株分離純化
菌種系採自於野外的擔子菌子實體。將新鮮的子實體以無菌手術刀切開，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種於pda平板，30℃培養。待菌絲墊直徑達2-3釐米時，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種於新的pda平板，經反覆多次轉接，直至分離得到純菌種。將目的菌株再經搖瓶發酵復篩和進一步分離篩選，得到一株性能穩定的γ-癸內酯產生菌，該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9。
上述菌株滴孔菌a-9已於2017年5月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101，其保藏編號為cgmccn0.13895。
上述液體種子培養基組成(g/l)：鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。
上述斜面培養基組成為(g/l)：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda。
上述發酵培養基的組成(g/l)：可溶性澱粉10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，蓖麻油100g，吐溫-200.05％(體積比)，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l，ph5，滅菌117℃，30min。
實施例2滴孔菌a-9cgmccn0.13895菌株18srdna及its序列測序
將實施例1分離純化得到的產γ-癸內酯菌株即cgmccno.1869菌株委託博尚生物公司進行18srdna測序。
實驗方法是：挑取斜面培養物，提取基因組作為模板，分別以通用引物ns1，ns8擴增18srrna基因，片段大小約為1.8kb，以通用引物its1，its4擴增its序列，片段大小約為750bp。
取5μl進行瓊脂糖凝膠電泳，使用takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0(codeno.dv805a)切膠回收目的片斷，對上述回收產物進行dna測序。
測序結果：
cgmccn0.13895菌株18srdna序列長度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；cgmccn0.13895菌株its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。所用引物如表1所示。
表1所用引物列表
實施例3滴孔菌a-9cgmccn0.13895在搖瓶培養製備γ-癸內酯中的應用
應用方法涉及的步驟順序如下：
(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；
(2)斜面培養活化：將菌種接種於斜面培養基，30℃條件下，靜止培養100小時，備用；
(3)種子培養：將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環於90～100ml(500ml三角瓶)液體種子培養基中，置旋轉轉速為160轉/分鐘、旋轉半徑為40mm的搖床上，30℃培養80小時，得種子液；
(4)搖瓶發酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種於裝有90～100ml(500ml三角瓶)發酵培養基的搖瓶中，30～35℃，轉速為150～180轉/分鐘，搖瓶發酵150小時，即獲得含γ-癸內酯的發酵產物；
上述斜面培養基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda；
上述液體種子培養基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；
上述發酵培養基的組成為：可溶性澱粉20g/l，豆粕粉30g/l，蓖麻油100g，吐溫-20體積比0.05％，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l，去離子水1l；ph5，滅菌117℃，30min。
(5)產物檢測：取樣時取1ml培養物於5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml於1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測；
經檢測發酵液中γ-癸內酯的含量為3.6g/l。
實施例4滴孔菌a-9cgmccn0.13895在發酵罐培養製備γ-癸內酯中的應用
應用方法涉及的步驟順序如下：
(1)菌種選擇：選用滴孔菌a-9(piptoporussp.)cgmccn0.13895；
(2)斜面培養活化：將菌種接種於斜面培養基，35℃條件下，靜止培養102小時，備用；
(3)種子培養：將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環於90～100ml(500ml三角瓶)液體種子培養基中，置旋轉轉速為180轉/分鐘、旋轉半徑為40mm的搖床上，30～35℃培養80小時，得種子液；
(4)發酵培養：
5l發酵罐發酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種於罐裝有3.5l發酵培養基的5l發酵罐中，30℃進行通風攪拌培養，其中攪拌轉速為250r/min，通氣量以發酵液體8l/min，罐內壓力0.08mpa；發酵液初始ph值為5.0～5.5，發酵過程中定時取樣測定發酵液中γ-癸內酯的濃度，發酵時間為144小時，結束髮酵，即獲得含γ-癸內酯的發酵產物；
上述斜面培養基組成為：馬鈴薯220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然，固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda；
上述液體種子培養基組成：馬鈴薯220g，葡萄糖20g，蛋白腖2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮後切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；
上述發酵培養基的組成為：可溶性澱粉40g/l，豆粕粉40g/l，蓖麻油100g，吐溫-20體積比0.05％，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l，ph5，滅菌117℃，30min。
(5)產物檢測：取樣時取1ml培養物於5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml於1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測；
經檢測發酵液中γ-癸內酯的含量為6.8g/l。
上述實施例所述γ-癸內酯按下述方法測定：
氣相色譜檢測：標準樣品製備：取6.33μlγ-癸內酯標準樣品加入到3ml色譜純乙酸丁酯中，即得到濃度為2g/l的γ-癸內酯標準樣品，以此樣品稀釋得到濃度分別為1g/l，0.5g/l，0.25g/l，0.1g/l的標準樣品。
gc分析條件：
進樣口spl1：溫度250℃，壓力：23mpa，控制方式線速度，線速度10.3cm/min，總流量12.5ml/min，柱流量0.5ml/min，吹掃流量2ml/min，分流比20:1，進樣體積1μl。
柱溫：起始溫度100℃，以8℃/min升至250℃，250℃保持20min。
檢測器：氫火焰離子檢測器fid，檢測器溫度275℃，氫氣流量40ml/min，空氣流量400ml/min，尾吹流量3ml/min。
載氣：高純氮氣
取樣時取1ml培養物於5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml於1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測。
序列表
山東大學
一株產γ-癸內酯的滴孔菌及其應用
2017-06-14
2
1
1679
rdna
滴孔菌(piptoporussp.)a-9
滴孔菌菌株cgmccn0.13895的18srdna序列
（1）…（1679）
1
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2
727
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滴孔菌(piptoporussp.)a-9
滴孔菌菌株cgmccn0.13895的its序列
（1）…（727）
2
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