高產甘油的酵母工程菌的製作方法

2023-04-30 12:04:16 1

專利名稱：高產甘油的酵母工程菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及發酵和生物技術領域，更具體地涉及一種高產甘油的酵母工程菌及其製法和用途。
背景技術：
甘油作為一種基礎化工原料，廣泛應用於食品、軍工、日化醫藥等行業的上千個產品中。國內歷來由油脂皂化中的副產物中提取。其產量早已不能滿足社會發展需要，2001年國內甘油產量4萬噸，進口4萬噸；隨著生活水平的提高，甘油缺口將進一步擴大。
生產甘油主要有合成法和油脂皂化產物提取法以及發酵法。隨著工業生產的不斷發展和人民生活水平的提高，國內外市場對甘油需求量日益加大，皂化法等傳統甘油生產方法生產的甘油不論從產量還是質量上均不能滿足整個甘油市場，而化學合成由於丙稀價格受到國際市場的影響，往往使甘油價格與丙烯價格呈倒掛之勢。
利用傳統育種的微生物例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，假絲酵母(Candida glycerolgenesis)等發酵生產甘油雖然具有較高的甘油產率，但甘油產率還難以令人滿意，而且殘糖等雜質高。
粉狀畢赤酵母隸屬於真菌門，子囊菌亞門，酵母菌科，畢赤酵母屬，細胞短橢圓形，多邊芽殖，形成子囊孢子，可以在石油，農副產品如玉米粉或工業廢料中分離獲得，粉狀畢赤酵母具有耐受高滲等特性，可以在70％的葡萄糖中生長。然而，粉狀畢赤酵母甘油產率還難以令人滿意。
因此，本領域迫切需要開發新的低耗的高產甘油的工程菌。

發明內容
本發明的目的就是提供一種低耗的高產甘油的工程菌。
在本發明的第一方面，提供了一種產甘油的酵母工程菌，在該酵母的基因組中整合有鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶基因的表達盒，所述的表達盒依次含有啟動子序列，鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶的編碼序列、終止密碼子。
在另一優選例中，所述的鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有3-磷酸甘油脫氫酶功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，3-磷酸甘油脫氫酶具有SEQ ID NO2胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的酵母可在葡萄糖重量百分比濃度為60-85％的培養基中生長。
在另一優選例中，所述的酵母是畢赤酵母、假絲酵母、甲醇酵母或釀酒酵母。
在另一優選例中，所述的酵母是粉狀畢赤酵母。
在另一優選例中，所述的酵母是粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏號為CGMCC No.1059。
在本發明的第二方面，提供了一種生產甘油的方法，它包括步驟在適合生長的情況下，於28-30℃培養本發明所述的酵母工程菌，從而使工程菌產生甘油；從培養基中分離出甘油。
在另一優選例中，所述的酵母是粉狀畢赤酵母。
更佳地，所述的酵母是粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏號為CGMCC No.1059。
具體實施例方式
鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬，主要生長於高鹽度水體中。細胞形態通常為卵圓形，當外界滲透壓發生變化時，其形態可變為球形至紡錘形。它具有兩條等長的鞭毛和一個杯狀葉綠體，在葉綠體的外緣可積累大量的β-胡蘿蔔素小滴，是細胞呈橙紅色。細胞無細胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。本發明人通過多年對鹽生杜氏藻的研究，首次發現和分離了鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶，並將該甘油脫氫酶導入耐高滲酵母，獲得了耐高滲且高產甘油的酵母工程菌。在此基礎上完成了本發明。
3-磷酸甘油脫氫酶3-磷酸甘油脫氫酶在申請人的2003年11月26日提交的200310108875.5號專利申請中有詳細描述。為了方便起見，仍將相關內容列出。
在本發明中，術語「3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)」，「3-磷酸甘油脫氫酶多肽」或「GPD」可互換使用，都指具有鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的3-磷酸甘油脫氫酶。
3-磷酸甘油脫氫酶催化的反應如下
本發明還包括鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶」指具有鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶的活性片段和活性衍生物。
在本發明中，術語「鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶」還包括了「鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶保守性變異多肽」。這些保守性變異多肽是指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明的鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
載體和工程菌本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或3-磷酸甘油脫氫酶編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，尤其是酵母細胞。
本發明中，鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。較佳地，宿主細胞是酵母細胞，更佳地是畢赤酵母，最佳地是粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)。
一類特別優選的酵母是耐高滲的酵母，即可以在葡萄糖濃度為50％以上(如50-95％)，較佳地60％以上(如60-90％)，更佳地70％以上(如70-85％)的培養基中生長的酵母。代表性的耐高滲酵母包括假絲酵母屬(Candida)的酵母、部分甲醇酵母和粉狀畢赤酵母。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。
甘油生產和分離本發明的產甘油的酵母工程菌可在常規的發酵條件下發酵生產甘油，可以選用常規的培養基和發酵條件。例如溫度為30±3℃，pH為8.2±1，時間為100±50h。合適的培養基包括各種用於酵母發酵的培養基，例如葡萄糖濃度33±5％，玉米漿0.2±0.1％，尿素0.1±0.05％的培養基。
在本發明中對於甘油的分離步驟，沒有任何特別限制，可以採用本領域常規的方法和工藝。
本發明的主要優點在於本發明高產甘油菌株具有高產、優質、低耗等特點，為甘油生產提供了廣闊的前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶基因的克隆1.鹽生杜氏藻的採集(Collection)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)購自武漢水生生物研究所藻種庫。
2.Poly A+RNA的分離(Poly A+RNA isolation)用Trizol試劑(Gibco，NY，USA)提取鹽生杜氏藻的總RNA。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的試劑盒操作說明書抽取鹽生杜氏藻的mRNA。
3.鹽生杜氏藻cDNA文庫的構建(Cloning of Full-length cDNA)使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的試劑盒說明書，以λTriplEX2為載體，構建鹽生杜氏藻的cDNA噬菌體文庫。
4.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)通過對大量不同物種(包括衣藻、酵母、大腸桿菌等)的3-磷酸甘油脫氫酶進行比較，確定了部分胺基酸保守序列。據此設計簡併引物，採用RACE方法(Gibco試劑盒，NY，USA)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)使用簡併引物，以Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增以寡核苷酸5′GTN GGN TCN GGN GCI TGG G 3′(SEQ ID NO3)為正向引物；寡核苷酸5′CNG CDA TRT TNG CIC CCA T 3′(SEQ ID NO4)為反向引物，以Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃5分鐘，隨後94C30秒、55℃30秒、72℃1分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得的片段長度約為0.45kb，回收片段連接到購買的T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，採用終止螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序，測得一個457bp序列。
將該序列及其編碼蛋白質序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR資料庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與千屈菜的3-磷酸甘油脫氫酶基因有較高的同源性，證實了簡併引物的正確。
(2).RACE根據以上序列分析設計5』RACE引物5』TAC GGG ACA CCA TCT GGC TAA TGA G 3』(SEQ ID NO5)；3』RACE引物5』TGC ACA GCC GTG CGC ATG GT3』(SEQ ID NO6)；使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照操作手冊進行，得到鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶基因的5』和3』端序列。
(3).PCR擴增得到3-磷酸甘油脫氫酶基因編碼區(過程同(1))。
在拼接得到全長(包括完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物以寡核苷酸5』CTT GGC AGC AGA ACA GTG AGG3』(SEQ ID NO7)為正向引物；寡核苷酸5』TGT GGT TGC TTA GTA GTA GTC GTT C 3』(SEQ ID NO8)為反向引物，以用常規方法抽提的鹽生杜氏藻總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，然後按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序。結果驗證了鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶蛋白的全長編碼序列的正確性。
鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶基因全長序列如SEQ ID NO1所示，其中讀框位置是1-2103位。
atgcttctcc agaaaggaaa cattggcaag gggatcgccc agcctgtgca gcgccgagga 60gtgccctcag ccttgcgcca cgccccgctt gcgaacaagg tcgccacccc agcggtcgct 120ccccaaggcc tcttgaggcc tatcctgagt gaaaggggca gcccagcgtt gctgaagcgc 180caacgggcgc tggatgtcgt gttgcgcgct gcggagaccg agcaggaggc ggagaatgcc 240ggcacggtgg tgcccgggga tgggtgggag agcttccccc cgcccccgta cgagccctct 300gagcaggtcc tcgacctgtg gcagcaggcg gatgccgtgt gtttcgatgt ggaccgcacc 360gtgacaactg acgcctcagt tggcctgctg gccaagttca tgggcatcga ggatgaggca 420cagtccctga cggagcaggc caacaggggc gagatcaacc tcaccaaggc ctttgaggat 480cgcctggcca aactgaactt cacccccaca gacattgacc gattccttga ggagcaccct 540gctcacaccc gcctggttcc gggtgtggag aacctcattg cagccctgaa ggctcgtgga 600gtggaggtgt tcctcatctc tggcggcttc agggagatgg ccctgcccat tgcttcccac 660ctcaagatcc ctgcaaagaa cgtgttctgc aacaccatgt cctggcagct ggacgaccat 720ggtgagcccg tccgcctgca gggcctggac atgacccgcg ccgcagagag ccacttcaaa 780tcgcgcgcta ttgagcgcat taggaggaag tacccctaca acaacatcat catggttgga 840gatggcttca gtgacctgga ggccatgcag ggctcccccg atggagcaga tgccttcatc 900tgcttcggtg gcgtcatgca acgacctgcc gtggccagcc aggccgactg gtttgtgcgc 960tcatacgatg agctgatggc caagctgaag cgctacaagg tgaccatggt gggctccggg1020gcctgggcct gcacagccgt gcgcatggtg gcccagagca cagcagaggc cgcccagctg1080ccaggctccg tgttcgagaa ggaggtgacc atgtgggtgc acgaggagaa gcactccggc1140cgcaacctga tcgagtacat caacgagaac catgagaacc ccatctactt gcctggcatt1200gacctgggcg agaacgtcaa ggccacctcc gatttgatcg aggcggtccg tggcgctgat1260gccctcatct tctgcgcacc ccatcaattc atgcatggca tttgcaagca gctggctgct1320gcgcgcgtcg tcggccgcgg cgtgaaggcc atcagcttga ccaagggcat gcgtgtgcgt1380gctgagggcc cgcagctcat tagccagatg gtgtcccgta tcctgggcat cgactgctca1440gtgctcatgg gtgctaacat tgctggcgac attgccaagg aggagctgtc tgaggctgtg1500attgcctatg ccaaccgcga gtctggcagc ctgtggcagc agctgttcca gcgcccctac1560ttcgccatta acctgcttgc ggatgtgccg ggcgctgaga tgtgcggtac cctgaagaac1620atcgtggctg tgggcgcagg cattggtgac ggcctgggcg taggccccaa cagtaaagcc1680tccatcctgc gacaaggcct gagtgagatg aggaagttct gcaagttcat ctccccctca1740gtgcgcgatg acaccttctt cgagtcctgc ggtgtagctg atttgattgc cagcagctat1800ggcggccgca acaggcgcgt ggctgaggcc tgggcccaga agaggatcgc tggtgatgac1860caggtcacgt tcgagaagct tgagaaggag atgctgaacg gccagaagct gcagggtgtg1920ctaacaagcg acgaggtcca agaaatcctg cacgcacgtg gctgggagct ggaattcccc1980ttgttcacca ccatcaacag aatcatccat ggcgaggtcc caccaaccat gatcttgagg2040taccgcgtgg cctgctccat gcccagcatg cctccagctc gccgtgtagt gaacgactac2100tactaa 2106(SEQ ID NO1)
鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶基因編碼一個由701個胺基酸構成3-磷酸甘油脫氫酶，其序列如SEQ ID NO2所示。
1 MLLQKGNIGK GIAQPVQRRG VPSALRHAPL ANKVATPAVA PQGLLRPILS51 ERGSPALLKR QRALDVVLRA AETEQEAENA GTVVPGDGWE SFPPPPYEPS101 EQVLDLWQQA DAVCFDVDRT VTTDASVGLL AKFMGIEDEA QSLTEQANRG151 EINLTKAFED RLAKLNFTPT DIDRFLEEHP AHTRLVPGVE NLIAALKARG201 VEVFLISGGF REMALPIASH LKIPAKNVFC NTMSWQLDDH GEPVRLQGLD251 MTRAAESHFK SRAIERIRRK YPYNNIIMVG DGFSDLEAMQ GSPDGADAFI301 CFGGVMQRPA VASQADWFVR SYDELMAKLK RYKVTMVGSG AWACTAVRMV351 AQSTAEAAQL PGSVFEKEVT MWVHEEKHSG RNLIEYINEN HENPIYLPGI401 DLGENVKATS DLIEAVRGAD ALIFCAPHQF MHGICKQLAA ARVVGRGVKA451 ISLTKGMRVR AEGPQLISQM VSRILGIDCS VLMGANIAGD IAKEELSEAV501 IAYANRESGS LWQQLFQRPY FAINLLADVP GAEMCGTLKN IVAVGAGIGD551 GLGVGPNSKA SILRQGLSEM RKFCKFISPS VRDDTFFESC GVADLIASSY601 GGRNRRVAEA WAQKRIAGDD QVTFEKLEKE MLNGQKLQGV LTSDEVQEIL651 HARGWELEFP LFTTINRIIH GEVPPTMILR YRVACSMPSM PPARRVVNDY701 Y(SEQ ID NO2)實施例2粉狀畢赤酵母菌種的分離從樂山犍為糖廠的糖蜜中通過高滲培養基作為選擇培養基(60％葡萄糖的YPD培養基)，分離得到了耐高滲酵母，經過微生物鑑定確定為粉狀畢赤酵母，可在70％以上濃度的葡萄糖培養基中生長而且具有產甘油的能力。
實施例3粉狀畢赤基因工程菌株Kaiya-0917構建(1)粉狀畢赤酵母菌感受態製備a.用無菌牙籤挑取YEPD平板中粉狀畢赤酵母(實施例1)單菌落於2mL液體YEPD培養基中，28℃，200rpm振蕩培養過夜。
b.次日轉入200mLYEPD培養基中28℃，200rpm振蕩培養直至OD600＝1.0～1.3之間。
c.將細胞轉移至50mL離心管中4000rpm，4℃離心10min，棄取上清。
d.將等體積的去離子水加入離心管中，重懸細胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
e.將一半體積的去離子水加入離心管中，重懸細胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
f.將一半體積的1M山梨醇加入離心管中，重懸細胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
g.將500μL的1M山梨醇加入離心管。
(2)3-磷酸甘油脫氫酶基因表達載體的構建a.整合位點選用URA3基因。通過NCBI上目前已知的畢赤酵母，釀酒酵母的URA3基因設計引物，並加上Bgl II酶切位點。
正向引物5』agatctAACTCGGACCTTTCATCTGT3』(SEQ ID NO9)反向引物5』agatctGGAAGAGGAGGGTATTTTGG3』(SEQ ID NO10)b.通過常規PCR技術獲得從粉狀畢赤酵母總DNA中擴增出753bp片段。
c.將片段按常規的TA克隆法克隆至pMD-T-18(TaKaRa公司)載體中，獲得載體pMD-URA。
d.通過Bgl II限制內切酶酶切pMD-URA質粒，獲得具有粘性末端URA3整合位點片段。
e.對表達載體pGAPZb載體(購自Invitrogen公司)進行Bgl II酶切，獲得大片段。
f.將步驟d中帶有粘性末端的URA3整合位點片段與步驟e的載體大片段連接，然後轉化TOP10菌種(購自Invitrogen公司)獲得克隆子。
g.抽提步驟f獲得的克隆子中的中間載體，對中間載體進行EcoR I和XhoI雙酶切。
h.將鹽藻GPD PCR擴增產物用引物5』-GCAAgaattcGCGAGCAGGAGGCGGAGAATG-3』(SEQ ID NO11)和5』-TTCTctcgagTAGCAGCATGATGGGTGTGGT-3』(SEQ ID NO12)通過常規的RT-PCR獲得進行EcoR I和Xho I雙酶切。
i.連接中間載體和GPD基因構建成含GPD基因整合型表達載體。
j.轉化TOP10菌種獲得克隆子，質粒命名為pURA-GPD。
k.使用Van91 I限制酶切酶酶切pURA-GPD載體，形成線形DNA分子，用於轉化。
(3)電擊轉化粉狀畢赤酵母將如上製備的100μL感受態酵母細胞與100ng線形化質粒DNA混勻，加入至0.1cm電擊杯中冰浴20min，放置於BioRed電穿孔儀中按25μF，1500V電擊。
然後迅速加入1mL 1M山梨醇，混勻後將部分細胞塗布於選擇平板上(含200mg/L的zeocinYPD培養基)30℃培養3～6天。從平板上獲得轉化菌種。
通過PCR方法(引物同上)對轉化有pURA-GPD載體的酵母克隆子進行檢測，擴增出鹽藻GPD序列的克隆為陽性克隆。結果獲得了轉入鹽藻GPD基因的粉狀畢赤酵母，命名為粉狀畢赤酵母Kaiya-0917。
該粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917菌種於2003年11月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國，北京)，保藏號(即登記入冊編號)為CGMCC No.1059。
實施例4粉狀畢赤基因工程菌株Kaiya-0917的分子檢測(1)對基因工程菌種Kaiya-0917的Northern檢測a.使用Trizol試劑按照使用說明書提取基因工程菌種的總RNAb.對總RNA進行變性電泳c.通過真空轉膜的方法將變性電泳的RNA轉移至尼龍膜。在紫外交聯儀固定RNAd.以鹽藻GPD基因作為探針，按照羅氏試劑公司的地高辛非放射雜交試劑盒操作步驟進行雜交並檢測。
結果在尼龍膜上具有一條明顯的雜交條帶並證明是表達鹽藻GPD基因RNA。這表明，粉狀畢赤基因工程菌株Kaiya-0917中轉入了3-磷酸甘油脫氫酶基因。
實施例5粉狀畢赤基因工程菌種Kaiya-0917的傳代培養通過對篩選到的粉狀畢赤酵母基因工程改造菌種在沒有選擇壓力條件下傳代培養，以每傳十代作為檢測點，在每個檢測點時使用高濃度的zeocinTM(購自Invitrogen公司)(200mg/l)檢測一次，剔除不能生長的菌種，經傳50代後獲得遺傳穩定性好的菌種。
實施例6基因工程菌種Kaiya-0917甘油發酵實驗將菌種(CGMCC No.1059)接入2ml的完全培養基中30℃培養過夜。次日將菌懸液轉入裝有40ml發酵培養基500ml三角瓶中，在230rpm搖瓶轉速下，搖瓶發酵100小時。中途用鹼液調節發酵液pH值8.2左右。
發酵結束後發酵液中甘油濃度可達到16％以上(未轉入鹽藻GPD基因的對照粉狀畢赤酵母約為7％)，甘油全糖轉化率52-55％，遠高於現有技術中30％的轉化率。發酵周期短於現有技術(至少120小時)。
發酵獲得甘油殘糖含量低於1％，低於傳統甘油發酵工藝的傳統殘糖量(通常遠大於1％)，因此便於甘油提制工藝。
實施例7製備轉入鹽藻GPD基因的產甘油的假絲酵母工程菌重複實施例3的過程，不同點在於，(a)宿主細胞用假絲酵母替換粉狀畢赤酵母；(b)整合位點用假絲酵母的URA3替換粉狀畢赤酵母的URA3基因。
結果，獲得了轉入鹽藻GPD基因的產甘油的假絲酵母工程菌。該工程菌的甘油產量比未轉入鹽藻GPD基因的假絲酵母高約60％。
菌種保藏本發明的粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917菌種於2003年11月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國，北京)，保藏號(即登記入冊編號)為CGMCC No.1059。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110四川川大光耀生物工程有限公司120高產甘油的酵母工程菌13003763116012170PatentIn version 3.121012112106212DNA213鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)4001atgcttctcc agaaaggaaa cattggcaag gggatcgccc agcctgtgca gcgccgagga 60gtgccctcag ccttgcgcca cgccccgctt gcgaacaagg tcgccacccc agcggtcgct120ccccaaggcc tcttgaggcc tatcctgagt gaaaggggca gcccagcgtt gctgaagcgc180caacgggcgc tggatgtcgt gttgcgcgct gcggagaccg agcaggaggc ggagaatgcc240ggcacggtgg tgcccgggga tgggtgggag agcttccccc cgcccccgta cgagccctct300gagcaggtcc tcgacctgtg gcagcaggcg gatgccgtgt gtttcgatgt ggaccgcacc360gtgacaactg acgcctcagt tggcctgctg gccaagttca tgggcatcga ggatgaggca420cagtccctga cggagcaggc caacaggggc gagatcaacc tcaccaaggc ctttgaggat480cgcctggcca aactgaactt cacccccaca gacattgacc gattccttga ggagcaccct540gctcacaccc gcctggttcc gggtgtggag aacctcattg cagccctgaa ggctcgtgga600gtggaggtgt tcctcatctc tggcggcttc agggagatgg ccctgcccat tgcttcccac660ctcaagatcc ctgcaaagaa cgtgttctgc aacaccatgt cctggcagct ggacgaccat720ggtgagcccg tccgcctgca gggcctggac atgacccgcg ccgcagagag ccacttcaaa780tcgcgcgcta ttgagcgcat taggaggaag tacccctaca acaacatcat catggttgga840gatggcttca gtgacctgga ggccatgcag ggctcccccg atggagcaga tgccttcatc900tgcttcggtg gcgtcatgca acgacctgcc gtggccagcc aggccgactg gtttgtgcgc960
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1 5 10 15Gln Arg Arg Gly Val Pro Ser Ala Leu Arg His Ala Pro Leu Ala Asn20 25 30Lys Val Ala Thr Pro Ala Val Ala Pro Gln Gly Leu Leu Arg Pro Ile35 40 45Leu Ser Glu Arg Gly Ser Pro Ala Leu Leu Lys Arg Gln Arg Ala Leu50 55 60Asp Val Val Leu Arg Ala Ala Glu Thr Glu Gln Glu Ala Glu Asn Ala65 70 75 80Gly Thr Val Val Pro Gly Asp Gly Trp Glu Ser Phe Pro Pro Pro Pro85 90 95Tyr Glu Pro Ser Glu Gln Val Leu Asp Leu Trp Gln Gln Ala Asp Ala100 105 110Val Cys Phe Asp Val Asp Arg Thr Val Thr Thr Asp Ala Ser Val Gly115 120 125Leu Leu Ala Lys Phe Met Gly Ile Glu Asp Glu Ala Gln Ser Leu Thr130 135 140Glu Gln Ala Asn Arg Gly Glu Ile Asn Leu Thr Lys Ala Phe Glu Asp145 150 155 160Arg Leu Ala Lys Leu Asn Phe Thr Pro Thr Asp Ile Asp Arg Phe Leu165 170 175Glu Glu His Pro Ala His Thr Arg Leu Val Pro Gly Val Glu Asn Leu180 185 190Ile Ala Ala Leu Lys Ala Arg Gly Val Glu Val Phe Leu Ile Ser Gly195 200 205Gly Phe Arg Glu Met Ala Leu Pro Ile Ala Ser His Leu Lys Ile Pro210 215 220Ala Lys Asn Val Phe Cys Asn Thr Met Ser Trp Gln Leu Asp Asp His225 230 235 240Gly Glu Pro Val Arg Leu Gln Gly Leu Asp Met Thr Arg Ala Ala Glu245 250 255Ser His Phe Lys Ser Arg Ala Ile Glu Arg Ile Arg Arg Lys Tyr Pro260 265 270
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Val Pro Gly Ala Glu Met Cys Gly Thr Leu Lys Asn Ile Val Ala Val530 535 540Gly Ala Gly Ile Gly Asp Gly Leu Gly Val Gly Pro Asn Ser Lys Ala545 550 555 560Ser Ile Leu Arg Gln Gly Leu Ser Glu Met Arg Lys Phe Cys Lys Phe565 570 575Ile Ser Pro Ser Val Arg Asp Asp Thr Phe Phe Glu Ser Cys Gly Val580 585 590Ala Asp Leu Ile Ala Ser Ser Tyr Gly Gly Arg Asn Arg Arg Val Ala595 600 605Glu Ala Trp Ala Gln Lys Arg Ile Ala Gly Asp Asp Gln Val Thr Phe610 615 620Glu Lys Leu Glu Lys Glu Met Leu Asn Gly Gln Lys Leu Gln Gly Val625 630 635 640Leu Thr Ser Asp Glu Val Gln Glu Ile Leu His Ala Arg Gly Trp Glu645 650 655Leu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Thr Ile Asn Arg Ile lle His Gly Glu660 665 670Val Pro Pro Thr Met Ile Leu Arg Tyr Arg Val Ala Cys Ser Met Pro675 680 685Ser Met Pro Pro Ala Arg Arg Val Val Asn Asp Tyr Tyr690 695 700210321119212DNA213人工序列220
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221misc_feature223引物40012ttctctcgag tagcagcatg atgggtgtgg t3權利要求
1.一種產甘油的酵母工程菌，其特徵在於，在酵母的基因組中整合有鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶基因的表達盒，所述的表達盒依次含有啟動子序列，鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶的編碼序列、終止密碼子。
2.如權利要求1所述的酵母工程菌，其特徵在於，所述的鹽生杜氏藻的3-磷酸甘油脫氫酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有3-磷酸甘油脫氫酶功能的由(a)衍生的多肽。
3.如權利要求1所述的酵母工程菌，其特徵在於，3-磷酸甘油脫氫酶具有SEQID NO2胺基酸序列。
4.如權利要求1所述的酵母工程菌，其特徵在於，所述的酵母可在葡萄糖重量百分比濃度為60-85％的培養基中生長。
5.如權利要求1所述的酵母工程菌，其特徵在於，所述的酵母是畢赤酵母、假絲酵母、甲醇酵母或釀酒酵母。
6.如權利要求1所述的酵母工程菌，其特徵在於，所述的酵母是粉狀畢赤酵母。
7.如權利要求1所述的酵母工程菌，其特徵在於，所述的酵母是粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏號為CGMCC No.1059。
8.一種生產甘油的方法，其特徵在於，包括步驟在適合生長的情況下，於28-30℃培養權利要求1所述的酵母工程菌，從而使工程菌產生甘油；從培養基中分離出甘油。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的酵母是粉狀畢赤酵母。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的酵母是粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏號為CGMCC No.1059。
全文摘要
本發明提供了一種高產甘油的酵母工程菌及其製法和用途。在本發明的酵母工程菌中導入了鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)3－磷酸甘油脫氫酶基因，從而可以高產、優質和低耗地生產優質甘油。
文檔編號C12P1/02GK1632102SQ20031012265
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者王小行, 李鋼, 楊滔, 蔣彥, 楊會強, 曾昌耀 申請人:四川川大光耀生物工程有限公司