微生物發酵生產低溫澱粉酶的方法

2023-05-10 13:41:46 1

專利名稱：微生物發酵生產低溫澱粉酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫澱 粉酶微生物發酵生產方法。該發明生產的低溫澱粉酶主要應用於食品加工、中草藥提取、造 紙、紡織、印染、洗滌、環境保護以及其它澱粉酶應用行業。可以提高原料的利用率、轉化率 和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量。
背景技術：
澱粉酶是催化澱粉水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一組酶的總稱，廣 泛存在於動物、植物和微生物中(錢海豐等，西北農業學報，200 。澱粉酶作為生物製劑， 已經廣泛應用於食品加工、中草藥提取、造紙、紡織、印染、洗滌、環境保護以及其它澱粉酶 應用行業。國內外目前使用的澱粉酶主要為中溫和高溫型澱粉酶。有關低溫澱粉酶的研 究是起步階段，主要研究菌種選育、發酵條件優化、酶學性質以及相關基因克隆等(張剛 等，海洋科學，2002 ；傅力等，農產品加工，2007 ；王淑軍等，中國釀造，2008 ；劉志培等，環境 科學，2009)；而低溫澱粉酶產業化、規模化生產及應用還未見報導。低溫澱粉酶與高溫、中 溫澱粉酶相比具有很大的應用優勢，因為低溫澱粉酶在低溫條件下具有高酶活力及高催化 效率；可減少加工工藝，縮短加工過程的時間並省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節能方面 有相當大的優勢；經過溫和的熱處理可使低溫酶的活力喪失；低溫或適溫處理有助於提高 產品品質和質量(孫謐等，海洋水產研究，200 ，低溫澱粉酶上述特性有助於其推廣和應 用。低溫澱粉酶的應用將對傳統的農業、食品、醫藥、輕工、能源和環保等領域產生深遠的影 響。利用微生物發酵生產的低溫澱粉酶，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加於生料發酵、 食品加工和多孔澱粉生產等領域中，在7 20°C處理0. 5 1.證，可以提高原料的轉化率 15. 4% 8%，降低了生產成本，改善並提高產品質量，從根本上擺脫中溫、高溫酶的加 熱、冷卻設備和工藝。低溫澱粉酶具有非常巨大的開發潛力和應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產低溫澱粉酶的方法，該方法主要是微生 物經過低溫馴化後，在14 20°C液體發酵生產低溫澱粉酶的方法，這種生產方法獲得的低 溫澱粉酶粗酶液活性可以達到199. 8U/mL，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度 的酶製劑。當該酶製劑活性為1000U/mL或1000U/g，0. 1%。 0. 5%。的添加量應用於生料發 酵、食品加工和多孔澱粉生產等領域中，在6 18°C處理0. 5 1.證，可以提高原料的轉化 率15. 4% 8%。該酶製劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免中溫、 高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發明所述的一種微生物發酵生產低溫澱粉酶的方法具體包括以下步驟(1)將產生澱粉酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化後的澱粉酶產生菌在14 20°C逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的2 8%接種量接入產酶培養基 中，在14 20°C培養48 144h時，即微生物發酵生產低溫澱粉酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。本發明中使用的菌種來源於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。澱粉酶產生菌(例如， CGMCC菌種編號1. 2323τ或1. 447或1. 504等)，菌株先活化，再經過逐級低溫馴化，發酵生 產低溫澱粉酶時按本發明方法進行培養。低溫馴化後的菌株在4°C環境中可保存2個月，用 25 40%甘油製成的菌懸液在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(1)培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基澱粉10. 0 20. 0g，蛋白腖10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。③液體種子培養基澱粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產酶培養基澱粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)將產生澱粉酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的澱粉酶產生菌在14 16°C培養48 72h，按5% 的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積2 4%的接種量接入10L的產酶培養 基中，在14 16°C培養96 144h時，即微生物發酵生產低溫澱粉酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的低溫澱粉酶製劑。實施例二
(1)培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 6，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基澱粉10. 0 20. 0g，蛋白腖10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。③液體種子培養基澱粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產酶培養基澱粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)將產生澱粉酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的澱粉酶產生菌在16 18°C培養48 72h，按5% 的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積4 6%的接種量接入50L的產酶培養 基中，在16 18°C培養72 96h時，即微生物發酵生產低溫澱粉酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的低溫澱粉酶製劑。實施例三(1)培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 6，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基澱粉10. 0 20. 0g，蛋白腖10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。③液體種子培養基澱粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產酶培養基澱粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)將產生澱粉酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；
(4)按常規方法將低溫馴化後的澱粉酶產生菌在18 20°C培養48 72h，按5% 的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積6 8%的接種量接入100L的產酶培養 基中，在18 20°C培養48 72h時，即微生物發酵生產低溫澱粉酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的澱粉酶製劑。實施例四按實施例一、二和三方法生產的低溫澱粉酶製劑，平均酶活性為1000U/mL，將活性 為1000U/mL或1000U/g的低溫澱粉酶製劑，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加於生料發 酵、食品加工和多孔澱粉生產等領域中，在7 20°C處理0. 5 1.證，可以提高原料的利用 率、轉化率和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量。低溫澱粉酶應用部分實驗結果 見下表。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫澱粉酶的方法，其包括以下步驟(1)將產生澱粉酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將篩選出的澱粉酶產生菌在14 20°C逐級擴大培養，製備成液體一級 種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的2 8%接種量接入產酶培養基中， 在14 20°C培養48 144h時，即微生物發酵生產低溫澱粉酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備 成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、產酶培養 基分別為(1)菌種低溫馴化培養基澱粉10.0 20. 0g，蛋白腖10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)液體種子培養基澱粉5.0 8. 0g，牛肉膏2. 0 4. 0g, NaCl 5. 0 8. 0g, K2SO4 0. 8 1. 2g, CaCl2 0. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣火菌30min。(3)產酶培養基澱粉12. 0 15. 0g，牛肉膏 3. 0 6. 0g, NaCl 14. 0 20. 0g, K2SO4 2. 0 4. 0g, CaCl2 0. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫澱粉酶的方法是將產生澱粉酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化後的澱粉酶產生菌在14～20℃逐級擴大培養，按發酵液體積的2～8％接種量接入液體發酵培養基中，在14～20℃培養48～144h時，即微生物發酵生產低溫澱粉酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，將粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
文檔編號C12N9/24GK102093990SQ201010162660
公開日2011年6月15日 申請日期2010年4月9日 優先權日2009年12月11日
發明者張慶芳, 王鑫, 遲乃玉 申請人:大連大學