一種肺結核相關的尿液生物標誌蛋白及其應用的製作方法

2023-05-10 02:37:28 1

本發明屬於生化免疫分析
技術領域：
，具體涉及一種肺結核相關尿液生物標誌蛋白及其應用。
背景技術：
：結核病是由結核桿菌複合群引起的一種人畜共患病，具有較高的感染率和死亡數，被列為繼hiv之後全世界引起死亡的第二大傳染病。未能控制結核病的蔓延在很大程度是因為未能充分檢測(從而有效治療)感染病例。因此，世界衛生組織的全球遏制結核病計劃的一大重點是發展簡單，低成本和有效的新型診斷方法，以改善現有的檢測情況。在資源有限的情況下，主動診斷結核病。主要依靠臨床評估，並結合顯微鏡鏡檢痰塗片；從臨床樣品中分離培養結核分枝桿菌一直是結核病診斷金標準，然而，這一標準昂貴、耗時、檢出率低，且需要較嚴格的生物安全設施。因此，尋找結核病新型診斷標識是研究結核病防治的重要領域。目前由於缺乏可靠和經過驗證的mtb生物標記物阻礙了結核病診斷方法的發展。因此理想的結核實驗室診斷方法應具備以下幾點：(1)靈敏性和特異性高；(2)成本低；(3)能夠早期發現及治療預後監測；(4)檢測譜廣，包括可以檢測出塗片鏡檢陰性或耐藥病例；(5)取樣簡單，最好能無損傷取樣；(6)檢測方便，有利於對結核進行野外及家庭醫療服務。正常情況下，尿液中蛋白質極少，因此，尿液中蛋白質種類和數量變化有與疾病發生、發展及預後有關；同時，尿液能夠無創地大量獲得,並且相對於其它生物液體而言比較穩定,因此尿蛋白質組學正在成為臨床蛋白質組學研究中的一項重要內容，為它在科學研究和臨床上的應用打下良好的基礎。在本發明中,二維電泳和免疫印跡分析表明,肺結核和健康人尿液中rbp4蛋白有顯著差異表達,這表明這些蛋白質可以作為肺結核尿液的潛在生物標識物。rbp4蛋白功能意義重大,因為這種物質可能參與了巨噬細胞激活；rbp4也被認為是作為脂肪因子用於抵抗胰島素,這可能在細菌感染過程中調節病理生理過程。且有報導顯示rbp4參與在免疫應答中起重要作用，然而本領域仍不知道其對肺結核病免疫的具體影響情況，還沒有其在肺結核患者尿液中的研究和開發。技術實現要素：本發明目的在於克服現有技術的缺陷，即利用尿蛋白的疾病特異性，提供一種檢測肺結核有關尿液生物標誌蛋白，該標誌蛋白可用於肺結核患者尿蛋白生物標識物，建立肺結核患者尿蛋白視黃醇結合蛋白(retinol-bindingprotein4，rbp4，序列見seqidno：1)表達，為肺結核及時診斷和治療提供支持。本發明首次發現尿蛋白尤其是視黃醇結合蛋白作為一個重要的生物學指標，在結核臨床診斷，鑑別診斷，有效觀察中具有標誌蛋白的作用，為以後結核患者尿蛋白的研究提供了理論依據，並為從分子水平診斷結核提供新的思想，具有重大的理論意義和潛在的使用價值。本發明通過以下技術方案實現：一種肺結核尿蛋白的檢測方法，包括以下步驟：利用tca/丙酮法提取肺結核患者和健康人對照尿液中的總蛋白，並用蛋白質定量試劑盒(bio-rad,usa)進行定量。採用二維電泳[1]，madel-tof-ms和免疫沉澱方法[1]對肺結核患者和健康人對照已提取的尿蛋白進行分離鑑定，分析表達差異蛋白，鑑定可用於肺結核患者診斷的尿液標誌蛋白質。本發明首次發現一種尿蛋白視黃醇結合蛋白(retinol-bindingprotein4,rbp4，p02753-human)作為一個重要的尿液生物學檢測指標，在肺結核病的診斷，鑑別診斷，有效觀察中的作用，為今後肺結核病尿蛋白的研究提供了依據，並從尿液蛋白分子水平診斷肺結核病提供新方向，具有重要的理論價值和潛在實用意義。本發明製備的肺結核病尿蛋白生物標誌蛋白可在製備肺結核病尿液檢測試劑盒中應用。附圖說明序列表seqidno：1是本發明分離的尿蛋白視黃醇結合蛋白rbp4的蛋白質序列。圖1：尿蛋白在肺結核患者和健康對照者中的差異表達。圖2：肺結核患者和健康對照者尿蛋白的聚類分析。圖3：免疫沉澱驗證rbp4在肺結核患者和健康對照者中的差異表達。具體實施方式實施例1對rbp4蛋白在肺結核病人中篩查實施例(1)尿液標準的搜集與製備尿液樣本來自於武漢市醫療救治中心，根據臨床診斷、x影像、痰菌培養等各種手段， 確定為活動性肺肺結核病，且排除掉愛滋病、泌尿道疾病的新收治的病人。先後收集了76人，每次每人收集30-50ml晨尿中段尿液。同時收集健康對照尿液樣本。(2)尿液樣本處理和蛋白提取方法的優化進行了樣本處理條件的優化，確定的處理程序是：尿液樣本加入蛋白酶抑制劑(購自羅氏公司)，離心去除細胞碎片和雜質，3kda濾膜超濾濃縮，用tca-丙酮法[2]沉澱蛋白，透析除鹽得到提純蛋白，達到二維電泳蛋白上樣標準。(3)尿蛋白二維電泳對膠條ph範圍、上樣緩衝液，膠條平衡液、等點聚焦程序，sds-page濃度和電壓進行了條件優化，最後確定利用ph3-10非線性、ph4-7線性膠條進行二維電泳；上樣緩衝液的製備:8m尿素,2m硫脲,0.5％(w/v)丙磺酸內鹽，0.52％(w/v)兩性電解質(ph310),60mm二硫蘇糖醇,40mm的三羥甲基氨基甲烷和0.01％溴酚藍；膠條平衡液為母液加2％(w/v)二硫蘇糖醇和2.5％(w/v)碘乙醯氨,各平衡15min；選取10％sds-page；sds-page電壓50v、30min，200v、6h；等點聚焦程序如表1。表1尿蛋白二維電泳程序程序電壓時間水化50v16hs1250v3hs21000v6hs310000v3hs410000v60000vhs5500v8h肺結核患者和對照組人群尿蛋白分別做二維電泳，採用pdquest8.0(bio-rad)軟體分析差異蛋白對其進行madel-tof-ms分析，獲得19個蛋白序列，進行了生物信息學分析和鑑定，獲得1個具有潛在標識意義的宿主蛋白並對這個差異尿蛋白(retinol-bindingprotein4,rbp4，其序列見seqidno：1；p02753-human)(4)利用免疫沉澱技術進行驗證收集25個肺結核患者(5人一組，共5組)和25個健康人(5人一組，共5組)的尿液，均勻混合濃縮處理,進行westernblot分析，實驗驗證rbp4蛋白在肺結核病人尿液中的 差異表達，並利用imagej軟體進行統計學分析。結果見圖3。5.試驗結果1)研究對象的一般特徵，結果見表2。表2病例-對照人群特徵分布2)rbp4蛋白在肺結核患者和對照組中的表達水平及其對肺肺結核病的診斷價值：如圖1：本發明共對29例肺結核病患者和7例健康對照者中用二維電泳和madel-tof-ms驗證這種尿蛋白。採用pdquest8.0(bio-rad)軟體分析差異蛋白對其進行madel-tof-ms分析，獲得19個蛋白序列，進一步進行了生物信息學分析和免疫沉澱技術鑑定，本發明獲得rbp4具有潛在標識意義的宿主蛋白，同時對rbp4蛋白進行了差異分析。結果顯示這rbp4尿蛋白的表達水平在兩組之間均存在顯著差異。在imagej灰度分析免疫沉澱驗證中，rbp4尿蛋白在肺結核病患者中的表達高於健康對照者3.82倍。將依託本發明的標識蛋白獲得的檢測結果進一步說明本尿蛋白的指標對肺結核病的篩查具有一定的診斷價值，例如本發明的蛋白可以用來製備檢測肺結核病的診斷試劑盒中作為抗原蛋白的應用。實施例2本發明的rbp4蛋白在的夾心elisa在製備檢測肺結核病的診斷試劑盒中的應用1.rbp4蛋白的克隆表達根據本發明公開的seqidno：1所示的序列，克隆rbp4基因，並在大腸桿菌中表達，獲得靶抗原蛋白；進一步利用親合層析(按常規方法)提取重組蛋白，獲得純化的重組靶抗原rrbp4(或稱重組蛋白rrbp4)；2.重組蛋白rrbp4的單克隆抗體和多克隆抗體製備按常規方法(參見文獻3,4)製備抗體，包括：將純化rrbp4免疫家兔，獲得兔抗rbp4抗體；同時免疫小鼠，獲得鼠抗rbp4單克隆抗體(單克隆抗體和多克隆抗體的製備方法參考：朱立平等，《免疫學常用實驗方法》，人民軍醫出版社，2000版中報導的方法以及薛慶善，《體外培養的原理與技術》，科學出版社，2001年版中報導的方法)；3.建立檢測rbp4的夾心elisa將鼠抗rrbp4的單克隆抗體包被elisa，用5％脫脂奶封閉，含有rbp4的尿液或其它體液為待測樣本，兔抗rrbp4為檢測抗體，hrp-羊抗兔(商業化試劑)為二抗，tmb/h2o2為底物，hf終止反應，用酶標儀在波長630nm處檢測光密度值(od630)。用上述純化的rrbp4作標準曲線，以健康陰性人尿蛋白平均值±2～3sd作為閾值，建立尿液rbp4檢測夾心elisa，進一步組裝成試劑盒。試劑盒組份如下：(1)酶聯板一塊(包被有鼠抗rrbp4多克隆抗體)(2)rrbp4陽性標準品(凍幹品)(3)樣品稀釋液(常規配方)和洗滌液(常規配方)(4)兔抗rrbp4多克隆抗體(5)hrp-羊抗兔二抗(6)顯色液(常規配方)和終止液(常規配方)參考文獻：1.rembertpieper,christinel.gatlin,etal(2004)characterizationofthehumanurinaryproteome:amethodforhigh-resolutiondisplayofurinaryproteinsontwo-dimensionalelectrophoresisgelswithayieldofnearly1400distinctproteinspots.proteomics,4:1159–1174.2.chih-minglu1,yu-jenwuetal(2011)identificationoflow-abundanceproteinsviafractionationoftheurineproteomewithweakanionexchangechromatography.proteomescience,9:17.3.朱立平等，《免疫學常用實驗方法》，人民軍醫出版社，2000版.4.薛慶善，《體外培養的原理與技術》，科學出版社，2001年版。當前第1頁12