GLP-1(7-37)多肽類似物的製作方法

2023-05-09 20:08:06

本發明涉及二型糖尿病的治療。更具體而言，本發明涉及GLP-1(7-37)多肽類似物及所述多肽類似物的脂肪酸修飾物，這些修飾物的製備方法，及含這些修飾物在降血糖藥物中的用途。

背景技術：

糖尿病是一種由遺傳和環境等多種因素引起的糖代謝紊亂疾病，現已成為繼腫瘤、心腦血管疾病之後威脅人類健康和生命安全的第三位重大疾病。糖尿病本身不一定造成危害，但長期血糖增高，大血管、微血管受損並危及心、腦、腎、周圍神經、眼睛、足等，據世界衛生組織統計，糖尿病併發症高達100多種，是目前已知併發症最多的一種疾病。因糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10％是腎病變所致。因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍。為此治療糖尿病進而預防其併發症是至關重要的社會問題。

糖尿病由於患病機理不同可分為幾種類型。其中絕大部分屬於二型糖尿病(約90％)，主要是因體重過重和缺乏身體活動所致。II型糖尿病患者多存在胰島素抵抗和胰島素分泌不足兩方面異常，在發病的中晚期往往出現胰島β細胞凋亡。目前，臨床使用的口服降糖藥的作用機理多為增強胰島素敏感性，或促進胰島素分泌以穩定血糖，均無法解決β細胞凋亡這一難題。而GLP-1及其類似物藥物由於具有減緩β細胞凋亡，增進其再生，促使胰島β細胞分化並增殖的作用，使其成為治療II型糖尿病的研究重點。

GLP-1是已發現的促胰島素分泌作用最強的腸肽類激素，它通過與GLP-1受體(GLP-1R)結合發揮作用。GLP-1結合GLP-1R後，激活細胞膜內環腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。胰島成熟β細胞的GLP-1受體偶聯Gs，活化腺苷醯環化酶，產生cAMP，後者與葡萄糖協同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉錄和胰島素原生物合成，可降低胰高血糖素濃度並抑制胰高血糖素分泌，增強細胞對胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐後血糖濃度；通過激活蛋白激酶、磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)、MAPK通道，調節凋亡前蛋白及誘導抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-xL的表達，以減緩β細胞凋亡，增進其再生，促使胰島β細胞分化並增殖。

GLP-l誘導多種生物學效應，例如剌激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃運動或腸運動及誘導重量減輕。GLP-l的顯著特徵是剌激胰島素分泌而無低血糖相關的危險。GLP-l(1-37a.a)活性很低，並且GLP-l(7-37a.a)和GLP-l(7-36)這兩種天然存在的截短肽在體內被迅速清除，並且具有極短的體內半衰期，這限制了GLP-l治療的有效性。 已知內源性的二肽基酶4(DPP4)通過切割GLP-l肽N末端組氨酸和丙氨酸殘基，而使循環的GLP-l肽失活。因此生產一種生理作用與GLP-1類似但不能被很快降解的GLP-1類似物成為研究的熱點。

目前市場上獲批的GLP-1藥物主要有從蜥蜴唾液中分離出的Exenatide-4，以及採用脂肪酸，抗體Fc段或血清白蛋白修飾的人源GLP-1類似物。在這些產品中以諾和諾德公司的脂肪酸修飾的利拉魯肽在降血紅蛋白糖基化及降體重方面最有效且副作用較少。但其不足方面是體內半衰期只有13小時，需要每天給藥。且根據最新的結構信息分析，GLP-1脂肪酸修飾後雖然大大提高了其體內半衰期，但由於脂肪酸阻礙了其與受體結合，導致其生物活性降低，計量是其他產品的幾十至上百倍。這大大增加了其服藥成本，增加了藥品副作用風險。因此開發出類似或好於利拉魯肽藥效,但半衰期大大增加,生物學活性更高,劑量更低的藥物,具有巨大的市場需求和市場競爭力。

技術實現要素：

本發明涉及一種新的GLP-1(7-37)多肽類似物(下稱GLP-1M(7-37))，所述多肽類似物GLP-1M蛋白質的胺基酸序列與天然序列比較,其具有突變A8S和V33R。同時還可以有G16E和/或A24E突變。

本發明還涉及一種SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白質，以及編碼所述SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白質的多核苷酸序列基因，包含這些多核苷酸序列基因的載體、包括載體的宿主細胞，以及由這些多核苷酸序列基因翻譯表達的GLP-1M蛋白質，由該GLP-1M蛋白質作為主要成分的降糖藥物。

本發明第一方面提供一種經密碼子優化的編碼SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白質的多核苷酸序列基因。

本發明第二方面提供一種構建的表達載體，其包含本發明第一方面的經密碼子優化的編碼SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白質的多核苷酸序列基因。所述載體適合驅動異源DNA在細菌中翻譯表達HPV L1蛋白質。在一個實施方案中，所述表達載體優選pET24(+)。

本發明的第三方面提供一種構建的工程菌細胞，該細胞包含本發明第一方面的多核苷酸序列基因，或第二方面的表達載體。所述的工程菌宿主細胞是大腸桿菌，在一個實施方案中，所述宿主細胞優選BL21(DE3)細胞株。

本發明第四方面提供多種種由密碼子優化的SUMO-GLP-1M(7-37)多核苷酸序列基因表達的GLP-1M蛋白質的胺基酸序列。

本發明第五方面提供一種GLP-1M蛋白質經脂肪酸修飾後形成的GLP-1類似物。

本發明第六方面提供了一種藥用組合物，其包含本發明GLP-1M脂肪酸修飾物，所述組合 物中進一步包含可藥用的製劑配方。

在一個實施方案中，本發明還提供了一種包含本發明所述GLP-1M或GLP-1M脂肪酸修飾物的藥物製劑，所述藥物製劑還包含製藥上可接受的載體或賦形劑，一個具體的實例可以是如包含GLP-1M脂肪酸修飾物，用1.4mg/ml磷酸氫二鈉，5.5mg/ml苯酚，180mM乙醇丙二醇混合物(摩爾比1:4),pH＝7.9配製最終成品，-80度或4度保存。

另一方面，本發明提供一種獲得HPV L1五聚體的方法，其包括在表達系統中表達經密碼子優化的HPV L1蛋白質，然後將含有該蛋白質的裂解上清進行純化處理。具體方法包括：

A.將設計合成的表達質粒轉化到BL21(DE3)中構建工程菌細胞,在工程菌細胞中表達SUMO-GLP-1M融合蛋白質，離心收集菌體。

B.破碎細胞，連續流離心加深層過濾法獲取上清。

C.採用親和方法捕獲目的融合蛋白。

D.加入SUMO蛋白質酶切除SUMO標籤，得到初步純化的GLP-1M多肽。

E.採用疏水層析純化法進一步純化目的多肽。

F.採用等電點沉澱法獲得目的多肽，用NaOH溶液調節pH11.0～12.5使溶液澄清、沉澱全部溶解，按照多肽與脂肪酸最佳摩爾比1:1.5-1:5加入脂肪酸，在15度條件下反應15-120分鐘。加入NaOH至終濃度10-50mM,4-15度反應1小時獲得修飾後GLP-1M。

G.使用疏水層析法及反向純化法純化目的修飾多肽。

H.採用等電點沉澱法獲得目的多肽

I.用1.4mg/ml磷酸氫二鈉，5.5mg/ml苯酚，180mM乙醇丙二醇混合物(摩爾比1:4),pH＝7.9配製最終成品，-80度或4度保存。

本發明所述的製備GLP-1M方法,其中所述GLP-1M蛋白質與天然蛋白比具有突變A8S和V33R。同時還可以有G16E和/或A24E突變。

本發明所述的製備GLP-1M方法,其中所述GLP-1M蛋白質為經過大腸桿菌表達系統DNA密碼子優化的GLP-1M基因。

本發明所述的製備GLP-1M方法,其中所述原核宿主細胞選自但不限於XA90，GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。優選BL21(DE3)。

本發明所述的製備GLP-1M方法,其中所述表達條件是：20～37℃溫度條件下，誘導表達3～20小時。在一個具體實施例中優選在30℃溫度條件下,誘導表達10小時。

另一方面，本發明還提供了GLP-1M的組合物在治療二型糖尿病中的應用。

根據本發明，本發明的藥物可採用患者可接受的形式，包括但不限於注射或鼻腔給藥，優選注射劑。

有益效果：

由於採用了胺基酸突變和全新脂肪酸修飾工藝，GLP-1M類似物的體內半衰期在老鼠中比利拉魯肽增加了6-8倍。相同劑量下的老鼠實驗顯示，GLP-1M類似物藥效比利拉魯肽藥效時間更長。該類似物開發成功後必大大方便了患者服藥。

全新設計的多肽具有更高的生物學活性。未修飾的新GLP-1比天然GLP-1(7-37)具有更好的體外生物學活性。修飾後的GLP-1M比利拉魯肽體內、體外活性更高。由於新GLP-1類似物與利拉魯肽生產成本類似，該類似物開發成功後必大大降低患者服藥成本。

說明書附圖

圖1為電泳檢測SUMO-GLP-1M蛋白表達圖譜。

圖2為GLP-1M(A8S/V33R)修飾後反向純度檢測圖。

圖3為GLP-1M(A8S/V33R/G16E/A24E)修飾後反向純度檢測圖。

圖4為藥物對不同糖濃度刺激下胰島素分泌水平影響圖。

圖5為人GLP-1R基因轉染293細胞經不同濃度受試物與利拉魯肽刺激後cAMP變化圖。

圖6-8為不同藥物對糖耐量在不同時間的試驗圖，圖6為第一天血糖值組間比較折線圖，圖7為第二天血糖值組間比較折線圖，圖8.第三天血糖值組間比較折線圖。

圖9為利拉魯肽和受試物皮下注射給藥後血藥濃度-時間曲線

具體實施例

實施例l：密碼子優化的GLP-1M基因的設計，合成與表達質粒構建

根據設計的蛋白序列使用軟體進行其多核苷酸序列的密碼子優化設計，優化後在其多核苷酸序列的5端加入promoter與rbs序列之間的必要序列，rbs序列，rbs與啟動表達密碼子ATG的間隔序列，ATG和六個組氨酸的密碼子等序列。將上述序列委託上海捷瑞公司合成，並將合成基因在BamH1/SalI之間插入表達載體pET24(+)中完成表達質粒構建。涉及序列如下

蛋白序列GLP-1M(A8S/V33R)

H SEGTFTSDVS SYLEGQAAKE FIAWLRRGRG

表達SUMO-GLP-1M(A8S/V33R)融合蛋白合成多核苷酸序列

ATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGCATCACCATCATCACCACATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATCCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGACACTCGGAAGGTACCTTCACCTCTGACGTTTCTTCTTACCTGGAAGGTCAGGCGGCCAAAGAATTCATCGCTTGGCTGCGTCGTGGTCGTGGTTAATAATAA

蛋白序列GLP-1M(A8S/V33R/G16E/A24E)

H SEGTFTSDVS SYLEEQAAKE FIEWLRRGRG

表達SUMO-GLP-1M(A8S/V33R/G16E/A24E)融合蛋白合成多核苷酸序列

ATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGCATCACCATCATCACCACATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATCCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGACACTCGGAAGGTACCTTCACCTCTGACGTTTCTTCTTACCTGGAAGAACAGGCGGCCAAAGAATTCATCGAATGGCTGCGTCGTGGTCGTGGTTAATAATAA

實施例2：SUMO-GLP-1M(A8S/V33R)與SUMO-GLP-1M(A8S/V33R/G16E/A24E)蛋白表達

將測序結果正確的重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)(E.coli)宿主細胞，並作為表達重組蛋白質的工程菌進行SUMO-GLP-1M蛋白的表達。工程菌培養基為2×YT培養基(10g/L胰化蛋白腖；5g/L酵母粉；10g/L NaCl)。挑取含重組質粒的菌體單斑於10ml 2×YT培養基中，230轉/分鐘(rpm)，37℃振蕩培養過夜。轉接5ml過夜菌於500ml2×YT液體培養基中，37℃震蕩培養至重組工程菌生長至OD600nm≈0.4～1時，加入終濃度0.2mM的IPTG誘導，在30℃的條件下進行16h重組蛋白質的表達。結果見圖1

實施例3：多肽純化、脂肪酸修飾及修飾後純化

細胞收集及破碎：對發酵培養物進行離心，棄上清，收穫菌體沉澱，稱重；使用bufferA(pH 8.0，50mM PB，500mM NaCl)洗滌沉澱，然後將其重懸於buffer A中進行超聲波破碎，隨後通過高速離心機對破菌液進行離心(16000rpm，30min，4℃)，收集上清液。

親和層析及酶切：親和柱中裝入Ni親和層析介質10ml，以buffer A平衡層析柱，然後上樣，完畢後以Buffer L洗至無蛋白質流出，親和完畢。以含300mM咪唑Buffer A洗脫收集SUMO-GLP-1M融合蛋白質。按質量比1:100加入SUMO蛋白酶4度過夜酶切融合蛋白。

疏水純化及等電點沉澱：使用Buffer B(pH 8.0，50mM PB,0.3M硫酸銨)平衡疏水層析柱。將酶切後樣品加入終濃度0.3M硫酸銨後上樣，以BufferC(20mM NaH2PO4,0.7M NaCl)淋洗層析柱。用20mM乙醇洗脫目的多肽。用HCl調節PH至4.5-5.0過夜沉澱目的多肽。

脂肪酸修飾：離心獲得沉澱後多肽。用移液槍逐滴滴入0.5M NaOH，調節pH11.0～12.5，調節pH以觀察溶液澄清、沉澱全部溶解作為終點。按照每毫升水溶液加入2μl三乙胺的比例加入三乙胺，按照每毫升水溶液加入1.5ml乙腈的體積比加入乙腈。將反應液移至15℃水浴中，轉子攪拌下用移液槍逐滴滴入1M醋酸，調節pH至10.5～11.0。按照多肽與脂肪酸最佳摩爾比1:3計算脂肪酸用量，用電子天平稱量脂肪酸粉固體直接倒入多肽溶液中控制水浴溫度攪拌反應半小時。反應結束後加入總體積25％的0.5M NaOH(至終濃度0.1M NaOH)，快速攪拌混勻。混合後反應液放入15℃水浴中靜置1小時，用移液槍滴入1M醋酸調節pH至 7.4～7.6終止反應。

反向純化：用40％乙腈平衡C18反向純化柱。將修飾後樣品用水稀釋2倍後上樣C18反向純化柱後用40％-80％乙腈線性梯度洗脫修飾後多肽。收集樣品用C18反向分析柱檢測，結果見圖2-3.

實施例4刺激胰島素分泌實驗

取出生3～4周的SD大鼠，75％乙醇消毒，無菌取出胰腺，清除胰外網膜，脂肪組織後，經4℃Hanks液漂洗2次，加入2～3倍體積的0.5mg/ml的V型膠原酶，混勻，37℃水浴震蕩消化6～8min。至消化渾濁，自然沉澱吸取上清，用4℃Hanks液終止消化，重複上面的消化步驟，直至消化完全，收集各次的消化液，1000rpm離心5min，棄上清，將細胞重懸於含10％胎牛血清的RPMI1640培養基的T75瓶中，37℃5％CO2-95％空氣的二氧化碳培養箱中培養。細胞培養至第3d，形成單層細胞，用無糖無血清的RPMI1640 37℃孵育1h，再分別換用低糖(2.8mM)高糖(16.8mM)含藥或不含藥溶液37℃孵育1h，收集上清，用ELISA檢測胰島素濃度。結果見圖4.

實施例5

構建了表達人胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)基因的293細胞株,將轉染後的HEK293/GLP-1R細胞按照每孔2×105個細胞/孔(1ml/孔)，接種於12孔板中，放入37℃，5％CO2培養箱中孵育6-8h，待細胞貼壁後，分別在每孔中加入終濃度0.1pM、1pM、10pM、100pM、1000pM和10000pM的利拉魯肽、GLP-1M(A8S/V33K/G16E/A24E)和GLP-1M(A8S/V33R)(1ml/孔)，繼續培養24h，利用試劑盒檢測cAMP含量。結果表明該重組細胞株經過受試物的刺激後,其細胞中的cAMP含量明顯升高，受試物GLP-1M(A8S/V33K/G16E/A24E)的EC50值約是利拉魯肽的1/4,受試物GLP-1M(A8S/V33R)的EC50值約是利拉魯肽的1/3(利拉魯肽的EC50值81.8pM，GLP-1M(A8S/V33K/G16E/A24E)的EC50值21.6pM，GLP-1M(A8S/V33R)的EC50值27.7pM)。

實施例6.糖耐量實驗

選4周齡ICR雄性小鼠40隻，隨機分為4組，實驗組分別灌胃0.1mg/kg的利拉魯肽和0.05mg/kg的2個不同受試物，半小時後同空白組一起灌服25％的葡萄糖水5g/kg。灌胃後2h、6h、12h、24h、48h、72h檢測尾靜脈血糖含量，第二天和第三天同一時間點灌服葡萄糖並檢測血糖值。結果顯示，第一天利拉魯肽組和兩個受試物血糖值均明顯低於空白組，第二天利拉魯肽組血糖值已基本等於空白組而受試組仍顯著低於空白組，第三天利拉魯肽無降血糖活性，兩個受試組血糖值有所升高但依舊低於空白對照組組。結果見圖6-8。

實施例7.SD鼠藥代動力學研究

選雄性SD大鼠30隻，隨機分成3組，分別單次皮下注射0.1mg/kg的利拉魯肽和0.05mg/kg的2個不同受試物【GLP-1M(A8S/V33K/G16E/A24E)/GLP-1M(A8S/V33R)】，在給藥前和給藥後不同時間點採血，分離血清，用GLP-1試劑盒檢測血清中利拉魯肽和受試物的含量。結果表明，兩個受試物的生物半衰期較利拉魯肽明顯延長，GLP-1M(A8S/V33R)達到26h,GLP-1M(A8S/V33K/G16E/A24E)達到28h(利拉魯肽生物期半衰期4h)。GLP-1M(A8S/V33R)/利拉魯肽的相對生物利用度是2163％，GLP-1M(A8S/V33K/G16E/A24E)/利拉魯肽的相對生物利用度是1833％。結果見圖9。