一種吸水鏈黴菌的誘變方法
2023-05-10 09:46:06
一種吸水鏈黴菌的誘變方法
【專利摘要】本發明公開一種吸水鏈黴菌的誘變方法，將吸水鏈黴菌新鮮斜面用甘油與吐溫80洗下，過濾，將過濾後的單孢子原液加水，加入滅菌的LiCl水溶液，在搖床作用6小時後立即取出，置於紫外燈下照射；紫外光光照射處理後，孢子液於4℃避光放置，轉入可見光下，稀釋塗布於LiCl的分離培養基平皿上，25℃培養；將在分離培養基平皿上的單菌落接種在葡萄糖天門冬素培養基上培養；再經過種子培養基培養、液體發酵培養基發酵。本發明利用紫外光處理、光復活和暗修復等方法中菌體效價與發酵上清液效價呈中等程度以上的正相關性，提高菌株的變異機率。在這種情況下可以用測定發酵上清液效價取代測定菌體效價來進行初篩工作，以排除大量低產型菌落。
【專利說明】一種吸水鏈黴菌的誘變方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物領域，具體涉及吸水鏈黴菌的誘變方法。
【背景技術】
[0002]雷帕黴素(Rapamycin，RPM, RAPA)，又名西羅莫司(Sirolimus)，是在1975年由加拿大Ayerst研究所從吸水鏈黴菌(Strepomyces hygroscopicus)中分離出來的三烯大環內酯類抗生素，它作為一種新型的高效免疫抑制劑引起了廣泛的關注，同時它又是一種有效的抗真菌劑並具有抗腫瘤的作用。進行大規模發酵和工業化生產，菌種選育最重要的手段之一。
【發明內容】
[0003]鑑於此，本發明目的在於提供一種選育吸水鏈黴菌的方法。
[0004]為解決以上技術問題，本發明提供的技術方案是，提供一種吸水鏈黴菌的誘變方法，步驟如下:
[0005]I)將吸水鏈黴菌新鮮斜面用20%甘油與0.1%吐溫80洗下，過濾，將過濾後的單孢子原液加水至10ml，按0.85%終濃度加入滅菌的LiCl水溶液，在28°C搖床作用6小時後立即取出，置于波長253.7nm、功率30W的紫外燈下30cm處開蓋振搖照射；紫外光光照射處理後，孢子液於4°C避光放置24h，轉入可見光下，稀釋塗布於0.5 % LiCl的分離培養基平皿上，於25°C培養20天；
[0006]2)將在分離培養基平皿上長好的單菌落接種在葡萄糖天門冬素培養基斜面上，於25°C培養15天後進行液體發酵；
[0007]3)於250ml三角瓶內裝50ml種子培養基，由斜面按種後於28°C振搖培養48小時；
[0008]4)於500ml三角瓶內裝50_100ml液體發酵培養基，由種子以5%接種量轉種後於25°C振搖培養96小時，結束髮酵。
[0009]進一步地，所述分離培養基組分及重量百分比為酵母膏0.1 %、牛肉膏0.1 %，水解乳蛋白0.2%、葡萄糖1.0%，瓊脂1.2%。
[0010]進一步地，所述葡萄糖天門冬素培養基組分及重量百分比為:天門冬素0.05%，K2HPO40.05%，葡萄糖 1.0%，瓊脂 1.2%0
[0011 ] 進一步地，所述種子培養基組分及重量百分比為:黃豆餅粉2.0%，葡萄糖2.5%，澱粉 1.0%, (NH4)2S040.3%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，CaCO30.2%。
[0012]進一步地，所述液體發酵培養基組分及重量百分比為:黃豆餅粉3.0%，葡萄糖2.5%, (NH4)2S040.5%，ΚΗ2Ρ040.3%，CaCO30.3%，液化澱粉 2.0%,消沫劑:0.02%，豆油:0.5%, pH 8.0。
[0013]與現有技術相比，上述技術方案中的一個技術方案具有如下優點:
[0014]本發明利用紫外光處理、光復活和暗修復等方法中菌體效價與發酵上清液效價呈中等程度以上的正相關性，提高菌株的變異機率。在這種情況下可以用測定發酵上清液效價取代測定菌體效價來進行初篩工作，以排除大量低產型菌落。
【具體實施方式】
[0015]將吸水鏈黴菌新鮮斜面用20%甘油與0.1%吐溫80洗下，過濾，將過濾後的單孢子原液加水至10ml，按0.85%終濃度加入滅菌的LiCl水溶液，在28°C搖床作用6小時後立即取出，置于波長253.7nm、功率30W的紫外燈下30cm處開蓋振搖照射；紫外光光照射處理後，孢子液於4°C避光放置24h，轉入可見光下，稀釋塗布於0.5% LiCl的分離培養基平皿上，於25°C培養20天。分離培養基組分及重量百分比為酵母膏0.1%、牛肉膏0.1%，水解乳蛋白0.2%、葡萄糖1.0%，瓊脂1.2%。
[0016]將在分離培養基平皿上長好的單菌落接種在葡萄糖天門冬素培養基斜面上，於25°C培養15天後進行液體發酵。葡萄糖天門冬素培養基組分及重量百分比為:天門冬素0.05%, K2HPO40.05%，葡萄糖 1.0%，瓊脂 1.2% 0
[0017]於250ml三角瓶內裝50ml種子培養基，由斜面按種後於28 °C振搖培養48小時；種子培養基組分及重量百分比為:黃豆餅粉2.0%，葡萄糖2.5%，澱粉1.0%，(NH4) 2S040.3 %，KH2PO40.05 %，MgSO40.05 %，CaCO30.2 %。
[0018]於500ml三角瓶內裝50_100ml液體發酵培養基，由種子以5 %接種量轉種後於25°C振搖培養96小時，結束髮酵。液體發酵培養基組分及重量百分比為:黃豆餅粉3.0%，葡萄糖 2.5%，(NH4)2SO40.5%, KH2P04 0.3 %, CaCO3 0.3 %，液化澱粉 2.0 %，消沫劑:0.02%，豆油:0.5%, pH 8.0。
[0019]菌液分析:
[0020]雷帕黴素的TLC分析:發酵液離心後菌絲用三倍體積的95%乙醇浸泡2— 3小時，在矽膠板上點樣，用丙酮:正已烷2:3展開，溶媒揮發後在含白色念珠菌檢定平板上鋪板顯跡。用雷帕黴素標準品作為對照。
[0021]波拉黴素(po1ramycin)的TLC分析:發酵液離心後菌絲加95 %乙醇至原體積，浸泡2— 3小時，在矽膠板上點樣。用異丁醇:水4:1展開，溶媒揮發後在含枯草桿菌檢定平板上鋪板顯跡。用波拉黴素粗品作為對照。
[0022]HPLC 分析:用島津 Lc 一 6A, Shirnadzu shim-pack ODS 柱,檢測波長為 277nm,流動相80%甲醇,流速lml/min。
[0023]還原糖的測定:蒽酮比色定糖法。
[0024]氨基氮的測定:甲醛法。
[0025]發酵液總蛋白含量的測定=Folin-酚法。
[0026]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性檢測:於不同時間分別取發酵液10ml，離心，棄上清，將菌體用0.9 % NaCl溶液洗兩次後，加入檸檬酸-Na2HPO4緩衝液5ml，混勻，冰浴中超聲波破碎8分鐘(10HZ，100W)，取出，4°C 12000rpm離心20min，上清即為粗酶液(稀釋後即可由Folin-酚法測定其總蛋白濃度)。將不同溶液按以下比例加入:0.58mlH20，0.1OmlNADP-Na2 溶液，0.1OmlTris-HCI 緩衝液，0.1OmlMgCl2 溶液，0.1Oml G_6-P_Na2溶液，0.02ml粗酶液。加好後混勻，移入石英比色杯中，記下339nm的光吸收值。室溫(250C )反應,2.3min後開始讀數。每隔一分鐘讀一次,連續讀3_5min,取平均值,據b =8095 X ΛΑ/At(U/L)計算酶活力。由酶活力除以相應粗酶液的總蛋白濃度即知其相對活力。
[0027]菌絲乾重的測定:於不同時間取定量發酵液，離心，棄上清，用無菌水洗兩次，置80 一 100°C烤乾至恆重。
[0028]本發明利用紫外光處理、光復活和暗修復等方法中菌體效價與發酵上清液效價呈中等程度以上的正相關性，提高菌株的變異機率。在這種情況下可以用測定發酵上清液效價取代測定菌體效價來進行初篩工作，以排除大量低產型菌落。
[0029]以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護範圍應當以權利要求所限定的範圍為準。對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和範圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種吸水鏈黴菌的誘變方法，其特徵在於，步驟如下: 1)將吸水鏈黴菌新鮮斜面用20%甘油與0.1%吐溫80洗下，過濾，將過濾後的單孢子原液加水至10ml，按0.85%終濃度加入滅菌的LiCl水溶液，在28°C搖床作用6小時後立即取出，置于波長253.7nm、功率30W的紫外燈下30cm處開蓋振搖照射；紫外光光照射處理後，孢子液於4°C避光放置24h，轉入可見光下，稀釋塗布於0.5% LiCl的分離培養基平皿上，於25°C培養20天； 2)將在分離培養基平皿上長好的單菌落接種在葡萄糖天門冬素培養基斜面上，於25°C培養15天後進行液體發酵； 3)於250ml三角瓶內裝50ml種子培養基，由斜面按種後於28°C振搖培養48小時； 4)於500ml三角瓶內裝50-100ml液體發酵培養基，由種子以5%接種量轉種後於25°C振搖培養96小時，結束髮酵。
2.根據權利要求1所述的利用吸水鏈黴菌生產雷帕黴素的方法，其特徵在於，所述分離培養基組分及重量百分比為酵母膏0.1 %、牛肉膏0.1 %，水解乳蛋白0.2 %、葡萄糖1.0%，瓊脂 1.2%。
3.根據權利要求1所述的利用吸水鏈黴菌生產雷帕黴素的方法，其特徵在於，所述葡萄糖天門冬素培養基組分及重量百分比為:天門冬素0.05%,K2HP040.05%，葡萄糖1.0%，瓊脂1.2%。
4.根據權利要求1所述的利用吸水鏈黴菌生產雷帕黴素的方法，其特徵在於，所述種子培養基組分及重量百分比為:黃豆餅粉2.0%，葡萄糖2.5%，澱粉1.0%，(NH4) 2S040.3 %，ΚΗ2Ρ040.05 %，MgS040.05 %，CaC030.2 %。
5.根據權利要求1所述的利用吸水鏈黴菌生產雷帕黴素的方法，其特徵在於，所述液體發酵培養基組分及重量百分比為:黃豆餅粉3.0 %，葡萄糖2.5 %，(NH4) 2S040.5 %，KH2P040.3%, CaC030.3%，液化澱粉 2.0%，消沫劑:0.02%，豆油:0.5%, pH 8.0。
【文檔編號】C12P17/18GK104404028SQ201410708193
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】金京勳 申請人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司