白血病bcr/abl融合基因mRNA的特異性抑制劑的製作方法
2023-05-10 05:29:26 5
專利名稱：白血病bcr/abl融合基因mRNA的特異性抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種白血病基因靶向治療劑，特別涉及一種甾體衍生物的咖 啡酸鹽類。
背景技術：
慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是人類發現最早的 白血病之一，發病率約為人群的每十萬分之二，其年發病率呈上升的趨勢。 對CML的研究和治療，分為幾個標誌性階段1960年，Nowell和Hungerford 發現了Ph染色體。1972年，Rowley發現Ph染色體是由於9號和22號染色體之間 的abl與bcr基因相互易位造成的。1982年，Klein等人證實了融合基因bcr/abl的 存在，幾乎在95X以上的CML病例中，均存在bcr/abl融合基因。1990年，Daley 等人證實，將bcr/abl融合基因導入小鼠體內可誘發類似CML的疾病，從而將 bcr/abl融合基因鎖定為CML的致病基因。1996年，Druker等人發現了酪氨酸激 酶抑制劑(TKI) Imatinib的抗白血病活性。2000年後，Imatinib在治療CML 中得到了廣泛的臨床應用。根據機理研究，Imatinib主要是與BCR/ABL融合 蛋白結合，從而抑制了該蛋白過度活化的酪氨酸激酶活性，誘導白血病細胞 調亡。堪稱第一個基因耙向治療藥物。隨著該藥的應用，暴露出來的主要問 題是抗藥性的產生，其主要原因是由於BCR/ABL蛋白的點突變，通常位於酪 氨酸激酶的活性區域，使Imatinib不能有效地與激酶部位結合而抑制其活性， 導致約70%左右的白血病復發率。目前，為了克服這一缺點，紛紛開發出了 第二代和第三代酪氨酸激酶抑制劑，但都是針對BCR/ABL蛋白結合部位的， 尚未見有真正意義上的bcr/abl融合基因靶向抑制劑，即直接抑制bcr/abl mRNA 融合基因的表達，繼而抑制BCR/ABL蛋白的表達。儘管文獻報導siRNA可抑 制bcr/ablmRNA融合基因的表達，但作為藥物，其在體內的穩定性尤為重要， 而siRNA由於其穩定性差而限制了其作為藥物的被開發。所以，尋找bcr/abl 融合基因的特異性的抑制劑，對CML的治療具有十分重要的應用價值。
發明內容
4本發明的目的在於提供一種bcr/abl融合基因抑制劑及其製備方法。 本發明的另一目的在於提供該化合物的藥物製劑，這種製劑是以本發明 的bcr/abl融合基因抑制劑作為藥物活性成分，包含一種或多種藥學上可接受的 賦形劑、稀釋劑等載體成份的組合物。
經過反覆篩選，發明人得到一種下列化學結構式的甾體小分子化合物的 咖啡酸鹽，即2卩-(4'-甲基-l'-哌嗪基)-3a-羥基-5a-甾體-17-酮咖啡酸鹽，該 化合物能直接抑制bcr/abl融合基因mRNA的合成，繼而抑制BCR/ABL蛋白的 表達，從而有望作為bcr/abl融合基因靶向治療劑而用於Ph陽性(Ph+)慢性粒 細胞白血病(CML)以及Ph陽性(Ph+)急性淋巴細胞白血病(ALL)的治療。
o
本發明bcr/abl融合基因抑制劑的製備方法為採用表雄酮(I )為起始原 料，經過烯化、環化、開環和成鹽四步化學反應而得到目的化合物(V)，目 的化合物經元素分析、IR、 ^111和]^8或1^/]\^確證其化學結構為2(3- (4，-甲
基-r-哌嗪基)-301-羥基-501-甾體-17-酮咖啡酸鹽。其合成路線如下由表雄酮(I )合成(II)時，將對甲苯磺醯氯在無水吡啶中反應，混 合物不分離而直接回流一步製得HI),不用毒性較大的2、 4、 6-三甲吡啶， 產率尚可。在環化反應中，產物(III)的酸性較大，應儘可能地用水洗至中 性，以免影響下一步鹼開環反應。在開環反應中，水的存在可對反應起促進 作用，採用甲基哌嗪水的比例為100: 40時，可使反應時間縮短為50小時左 右。在成鹽反應中，由於哌嗪基團上氮原子的鹼性，較容易與咖啡酸形成有 機酸鹽，產物穩定性較好，在水中有一定的溶解度。
本發明所指的包含2P- (4'-甲基-l'-哌嗪基)-301-羥基-501-甾體-17-酮咖啡 酸鹽的製劑，是以現有製劑領域的常規藥物製劑技術得到的各種藥學上可接 受的製劑，包括各種固體口服劑，液體口服劑，注射劑等。其中固體劑包括 片劑，膠囊劑，顆粒劑，緩釋片及緩釋微丸等等。液體劑型包括注射劑、輸 液劑、粉針劑等等。
使用本發明的藥物製劑，以本發明的化合物的有效成分計，推薦成人劑 量為3mg/次，每日2 3次。通過藥物臨床志願者實驗表明，該劑量是安全有效 的。當然，實際的服用量可根據患者的病情、年齡、體重以及其他因素來進行調整。
本發明甾體化合物的咖啡酸鹽能在bcr/abl融合基因的轉錄或翻譯水平抑 制bcr/abl原癌基因，從而抑制BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶的活性。該化合物鹽 的作用機制是通過有效抑制bcr/abl融合基因的mRNA合成，進而抑制 BCR/ABL蛋白的表達，從而抑制蛋白酪氨酸激酶的活性，最終抑制白血病細 胞的生長。
與現有的抗白血病藥物酪氨酸激酶抑制劑Imatinib類藥物相比，由於本發 明的化合物鹽抑制bcr/abl融合基因表達的藥理作用發生在mRNA水平，與 Imatinib的蛋白結合部位無關，因此能徹底克服目前Imatinib類藥物的抗藥性。 本發明的化合物鹽有望成為真正意義上的bcr/abl融合基因耙向治療劑而被開 發，從而為CML和Ph陽性(Ph+)慢性粒細胞白血病以及Ph陽性(Ph+)急性 淋巴細胞白血病的治療提供一種全新化學實體。
本發明藥物的原料可從市場上購得，合成方法簡單可行。
圖h不同濃度本發明的化合物鹽處理K562細胞第5天的MTT結果。 圖2:不同濃度本發明的化合物鹽處理Meg-01細胞第5天的MTT結果。 圖3:不同濃度本發明的化合物鹽處理CML細胞第5天的MTT結果。 圖4:不同濃度本發明的化合物鹽處理K562/R細胞第5天的MTT結果。 圖5: 1(^mol/L濃度本發明的化合物鹽處理不同白血病細胞第3天的bcr/abl mRNA表達結果。
圖6: 10^mol/L濃度本發明的化合物鹽處理不同白血病細胞第5天的 BCR/ABL蛋白表達結果。
圖7: 1 (^mol/L濃度本發明的化合物鹽處理不同白血病細胞第5天的PTK 活性結果。
具體實施例方式
以下的實施例均為對該發明作進一步的解釋，並不以任何方式對該發明 的範圍加以限制。
實施例l製備本發明的2e-(4'-甲基-l，-哌嗪基)-3"羥基-5(1-甾體 -17-酮咖啡酸鹽(V)
(1)由表雄酮(I )為原料製備5a-甾體-2-烯-17-酮(II)表雄酮(I ) 4g (14mmol)溶於無水吡啶20ml中，加入對甲苯磺醯氯 4.6g(24mmo1)，攪拌反應3h後回流4h，回收吡啶後得半固體物。加入水溶液析 出固體，濾集後重結晶得白色結晶，收率60%左右，mp.l04-105°C， IR (KBr) cm" 3010 (OCH)， 1735 (OO)， 1650 (C=C)。
(2) 2a， 3a-環氧-5a-甾體-17-酮(III)的製備 將8。/。過氧乙酸17ml、水14ml和醋酸鈉1.7g混合，滴加II的氯仿溶液(1.7g
溶於13ml氯仿中)。攪拌反應17h，分離有機層，洗至中性，濃縮後的固體， 重結晶後得白色結晶，收率約70%， mp.l25-127°C， IR(KBr)cm" 1735(C=0)， 810 (C-O畫C)。
(3) 2卩-(4，-甲基-1'-哌嗪基)-301-羥基-501-甾體-17-酮(IV)的製備 將III l.Og (3.5mmo1)在N-甲基哌嗪5ml和水2ml中回流50h，回收N-甲
基哌嗪，加水溶液析出固體，濾集，重結晶後收率約40%， mp.l70-171。C， 元素分析C24H4(AN2，計算值。/。C 74.18， H 10.38， N7.21，實測值。/。C 74.21， H 10.56， N6.96。 IR (KBr) cm" 3350 (OH)， 1725 (C=0)。'畫R (CDC13) 5ppm0.82 (s,3H,C18-CH3)， 0.84 (s，3H，C19-CH3)， 2.26 (s，3H，N-CH3) ， 3.30 (s，lH,C3a-OH， D20交換後消失)，3.85 (m,lH,C鄧-H)。
(4) 2P- (4，-甲基-1，-哌嗪基)-3(!-羥基-501-甾體-17-酮咖啡酸鹽(V)的
製備
將等摩爾量的IV和咖啡酸溶於70。/。的乙醇，析出白色結晶，重結晶後收率 約為50%， mp.228-229°C ， LCZMS檢領!l為單峰，MS m/z 3 89(M+1 ), 371 (M-OH)， 181 (鹽基M+1)， 163 (鹽基M-OH)。
實施例2本發明化合物鹽類口服片劑的製備
每片含本發明的化合物鹽3mg，片劑組成如下
成份 mg/片
化合物V 3.0
微晶纖維素 120.0
澱粉 80.0
硬脂酸鎂 6.0
將以上成份混勻(除硬脂酸鎂外)，過120目篩，加入溫熱蒸餾水攪拌， 然後制粒，乾燥，加入硬脂酸鎂混勻，壓片即得。 實施例3本發明化合物鹽口服膠囊劑的製備每囊含本發明的化合物鹽3mg，膠囊組成如下:
將以上成份混勻，過ioo目篩，加入溫熱蒸餾水攪拌制軟材，過篩制粒，
乾燥後填充入膠囊即得。
實施例4本發明化合物鹽注射劑的製備 每安瓿lml溶液含發明的化合物鹽lmg，注射劑組成如下
將原料溶於注射用水，無菌過濾，分裝於安瓿中，使藥物含量為lmg/m1/ 安瓿，滅菌即得。由於該化合物已成鹽，溶液pH值接近中性，可供肌肉注射 或加入輸液劑中靜脈滴注。
藥效學實施例
本發明化合物鹽類抗白血病的生物學活性及藥效學結果通過下述實驗表
明
(一)、抑制白血病細胞增殖的效果
1、方法取指數生長期的白血病細胞系K562、 Meg-01和K562/R，以及
一例來自臨床慢粒白血病患者的外周血經淋巴細胞分離液分離的臨床原代慢 粒白血病細胞(CML)。 K562為紅系來源的人類慢粒白血病細胞系，Meg-Ol 為巨核系來源的人類慢粒白血病細胞系，K562/R為抗Imatinib的白血病細胞 株。以常規細胞濃度加入培養體系，處理組分別加入10'Smol/L、 10'7mol/L、 l(T6mol/L、 1(TSmol/L和l(^mol/L濃度的本發明的化合物鹽，對照組(未處理 組)加入等量的無水乙醇，接種於96孔板中，每組平行種3孔，於37。C， 5%C02 溼熱培養5天後離心去上清。每孔加入5mg/ml濃度的MTT lO(il及PBS 100^1， 繼續培養4h後離心去上清，加入200plDMSO，於570nm測定吸光值，取3次重 復實驗的均數。
PEG3000
注射用水
成份 化合物V
9計算白血病細胞生長抑制率，按公式 抑制率(1%)=[對照組-處理組]/對照組>< 100%
以該化合物不同濃度對生長抑制率作圖得劑量抑制曲線，經線性回歸求 得該化合物鹽類的ICso值。
2、不同濃度的本發明化合物對白血病細胞的抑制結果見表l。
表l 10-8~10-4濃度本發明化合物對白血病細胞的抑制率
抑制率2p- (4，-甲基-r-哌嗪基)-301-羥基-501-(mol/L)甾體-17-酮咖啡酸鹽濃度白血病細胞l(T810-710-610-510-4
K56226.83%45.16%60.45%84.320/0卯.87%
Meg-Ol63.86%70.63%75.10%80.20%87.74%
CML44.09%52.02%68.22%88.35%93.55%
K562/R18.61%36.94%61.47%75.75%92.48%
附圖1~4表明MTT檢測的抑制結果，其IC5o值分別為 K562(IQo"l.75x 10-6mol/L， Meg-01 (IC50)=2.72x 10-9mol/L， CML(IC50)=4.30xl(r7 mol/L， K562/R(IC50)=3.65xl(r6 mol/L。 實驗結果表明本發明的化合物鹽類對K562， Meg-01和K562/R抗藥株以
及原代慢粒白血病細胞均有較好的抑制活性(P〈0.01)。 (二)、抑制白血病細胞融合基因bcr/ablmRNA表達的效果
1、方法收集經本發明化合物鹽(10-6mol/L)處理3天的白血病細胞106
個，用Trizol提取細胞總RNA，經電泳檢測可見28s、 18s及5s條帶，260nm/280nm
比值在1.8-2.0之間。RT反應步驟如下 配製退火混合物
RNA 2pg 0.5|ig/nl Oligo (dT) 18 1 |il
加無RNA酶的H20至總體積10 pl 混合液在7(TC水浴3分鐘，降到37'C放置10分鐘。 RT反應液
10xRT緩衝液 2^1 2.5 mM dNTP混合液 4 nlRNA酶抑制劑 1 pi
MMLV反轉錄酶 1 pi
混合後37T:恆溫1分鐘。
力口10pl的RT反應液到10nl退火混合物中，37i:水浴60分鐘，加熱到95匸 維持5min。得RT終溶液即為cDNA溶液，置冰浴待用。
幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反 應體系。
體系配置如下
dNTP (2.5mMeach)2.5 pl
10 x PCR緩衝液2.5 pl
MgCl2溶液1.5 pl
Taq聚合酶1.0 units
Sybergreen I終濃度0.25x
lOpM的PCR特異引物F1 pi
10pM的PCR特異引物R1 pi
cDNAorDNA1 |il
加水至總體積為25 pi
輕彈管底將溶液混合，5000 rpm短暫離心。配置PCR反應溶液置於RealtimePCR儀上進行PCR反應。
2、結果實時定量PCR時各樣品加樣量均為ljil，由於受RNA濃度定量誤 差和RNA逆轉錄效率誤差等的影響，每個樣品的lpl體積的cDNA其含量並不 完全相同，為校正此差異，使用管家基因beta-actin (不同樣品間表達量基本 恆定)作為內參，以樣品待測基因得值除以此樣品內參得值，最終得到的比 值為樣品的待測基因相對含量。附圖5所示為l(^mol/L濃度本發明的化合物鹽 處理不同白血病細胞第3天的bcr/abl mRNA表達結果。表2為待測基因以內參 校正列表(bcr/ablmRNA)，處理組與對照組比較，P值均小於O.Ol。 表2 處理組與對照組bcr/abl mRNA的RT-PCR結果比較
對照組(X10—2)處理組(X10-2)
K5624.36±0.152.04±0.11
Meg-Ol5.97±0.912.88±0.33
11CML 4.79±0.34 2.25±0.36
K562/R 6.81±0.88_3.72±0.15_
(三)、抑制白血病細胞融合基因BCR/ABL蛋白表達的效果
方法收集經本發明化合物鹽(l(T6mol/L)處理5天的白血病細胞，用預 冷的PBS清洗細胞2次，離心傾去PBS。配置含抑制劑的蛋白質抽提試劑(lml 抽提試劑中加入5Hl蛋白酶抑制劑混合液，5HlPMSF和5pl磷酸酶混合液)。細 胞瓶中加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑(1(^個細胞中加入lml抽提試 劑；5xle個細胞中加入0.5ml抽提試劑)，輕輕搖動5分鐘。轉移細胞懸浮液到 離心管中，冰浴下搖動15分鐘進行裂解。裂解液於預冷的離心機中12,000 xg 離心15分鐘。棄去沉澱，上清液立刻轉移入新的離心管中保存待用。測量562 nm附近(540-590nm皆可以使用)的吸收值。測得的每個標準孔和待測樣品 孔的吸收值分別減去空白孔平均光吸收值，以校正過的BSA標準蛋白562 rnn 測量值對其濃度(^g/ml)做圖繪製標準曲線。使用標準曲線定量待測樣品蛋
白濃度。
樣品準備
上樣染液(Laemmli上樣染液) 3x儲存液
1MTris-ClpH6.8 2.4 ml
20% SDS 3ml
甘油(100%) 3ml
(3巰基乙醇 1.6 ml
溴酚藍 0.006 g
總體積 10ml (儲存於4。C)
準備lx上樣緩衝液的樣品液如6 pl蛋白樣品加入3 )ll 3x上樣染液儲存 液。每孔配製含50嗎總蛋白樣的樣品液。上樣前煮沸3分鐘。加入電泳緩衝液， 上樣。凝膠電泳前，拔去梳子，每孔均用lx電泳緩衝液清洗。上、下層電泳 槽中加入lx電泳緩衝液，上層槽中緩衝液液面需超過上樣孔頂端l 2cm。 BioRad電泳槽中需加入500 ml的lx電泳緩衝液(50 ml的10x儲存液+ 450 ml dH20)。將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣，標準 加進第一個孔中。
電泳使用BioRad電泳裝置，樣品首先在80V恆定電壓下電泳至染料接近分離膠頂端。然後120V恆定電壓電泳至溴酚藍剛出膠底部。凝膠電泳於4X:。準 備好Bio-Rad蛋白轉移裝置夾板，凝膠用lx轉移緩衝液稍微清洗。吸水紙，濾
紙(比凝膠稍微大一些)用lx轉移緩衝液預溼，如下順序裝配於轉移裝置上 吸水紙-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-吸水紙，於200 mA恆流條件下，4。C轉移 2h。
lx轉移緩衝液
Tris鹼 15.14g 甘氨酸 72.07g 甲醇 1L 加水至總體積為 5L
膜在5% BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。封閉過的 膜加入一級抗體C-Abl4。C過夜，抗原抗體結合。TBST洗膜3次，每次5分鐘。 加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體，及HRP標記的抗生物素抗體以結合 分子量標準，室溫孵育膜l小時。TBST洗膜3次，每次5分鐘。將膜置於反應 液中室溫孵育3分鐘。KCTM化學發光試劑盒中兩種試劑等比例混合為反應液。
去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光。圖片掃描保存 為電腦文件，並用ImageJ分析軟體將圖片上每個特異條帶灰度值數位化。結果 如圖6所示。在BCR/ABL蛋白的表達中，處理組與對照組比較，P值均小於O.Ol， 具體見表3。
表3處理組與對照組BCR/ABL蛋白表達的結果比較
_對照組 處理組
K562 1.84±0.03 0.54±0.01 Meg-Ol 1.39±0.04 0.61±0.04 CML 2.89±0.32 0.84±0.01 K562/R 2.07±0.14 0.48±0.05 四、抑制白血病細胞融合基因BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性的效果
1、方法將本發明化合物鹽l(^mol/L濃度處理的白血病細胞裂解後，加 入c-ABL抗體，加入蛋白A吸附免疫複合物。經SDS-PAGE電泳分離後，將蛋 白條帶轉移至膜上，分別用抗p-Tyr和actin的抗體進行雜交，再加入連有HRP 的二抗體，然後以DAB顯色並掃描進行半定量測定。以磷酸化酪氨酸底物的相對量來代表BCR/ABL酪氨酸激酶的活性強度。
2、結果處理組與對照組蛋白酪氨酸激酶的活性(PTK活性)測定結果 如附圖7所示，見表4。在蛋白酪氨酸激酶的活性測定中，處理組與對照組比 較，P值均小於0.01。
表4處理組與對照組蛋白酪氨酸激酶的活性(PTK活性)測定結果
_對照組 處理組
K562 1.22±0.04 0.33±0.01 Meg-Ol 1,56±0.03 0,45±0,04 CML 1.82±0.05 0.77±0.01 K562/R 1.66±0.05 0.29±0.0權利要求
1. 一種化合物，其特徵在於該化合物是由2β-(4』-甲基-1』-哌嗪基)-3α-羥基-5α-甾體-17-酮和咖啡酸反應成鹽得到的，具有下列化學結構式
2. 權利要求1所述化合物的製備方法，其特徵在於將等摩爾的2(3- (4'-甲基-l，-哌嗪基)-3(1-羥基-501-甾體-17-酮和等摩爾的咖啡酸溶於乙醇， 析出白色結晶，即得本發明的化合物。
3. 如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 以表雄酮(I )為原料，溶於無水吡啶中，加入對甲苯磺醯氯，攪 拌反應，回收吡啶後得半固體物；加水析出固體，濾集後重結晶得 白色結晶(II);(2) 將8%過氧乙酸、水、和醋酸鈉混合，滴加的(II)氯仿溶液，攪拌 反應後，分離有機層，洗至中性，濃縮後的固體重結晶後得白色結晶(m);(3) 將結晶(III)在N-甲基哌嗪和水中回流，回收N-甲基哌嗪，加水析 出固體，濾集後重結晶得產物(IV);(4) 將等摩爾量的(IV)和咖啡酸溶於70%的乙醇，析出白色結晶，即 得本發明的化合物。
4. 如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中N-甲基哌嗪和水的摩爾比為10: 4。
5. 權利要求1所述化合物在抑制白血病bcr/abl融合基因mRNA表達中的 應用。
6. 權利要求1所述化合物在製備治療Ph陽性(Ph+)慢性粒細胞白血病以 及Ph陽性(Ph+)急性淋巴細胞白血病藥物中的應用。
7. 權利要求1所述化合物的藥學可接受形式的製劑。
8. 權利要求7所述的藥物製劑在抑制白血病bcr/abl融合基因mRNA表達 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種白血病bcr/abl融合基因靶向小分子抑制劑，該化合物是由2β-(4』-甲基-1』-哌嗪基)-3α-羥基-5α-甾體-17-酮和咖啡酸反應成鹽得到。該化合物鹽通過有效抑制bcr/abl融合基因的mRNA合成，進而抑制BCR/ABL蛋白的表達，從而抑制蛋白酪氨酸激酶的活性，最終抑制白血病細胞的生長。本發明的化合物鹽有望成為真正意義上的bcr/abl融合基因靶向治療劑而被開發，從而為CML和Ph陽性(Ph+)慢性粒細胞白血病以及Ph陽性(Ph+)急性淋巴細胞白血病的治療提供一種全新化學實體。
文檔編號C07J43/00GK101456890SQ20081014398
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者群 何, 君 張, 甄煥英, 俊 董 申請人:中南大學