一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒的製作方法

2023-04-28 20:01:46 1

專利名稱：一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種試劑盒，具體來說，特別是涉及一種鈣離子篩選試劑盒。
背景技術：
Ca2+作為細胞內的第二信使，在細胞的生命活動中起著重要作用，不僅直接激活具有重要生理意義的細胞內的機械活動，如肌肉收縮等，同時也作為細胞內第二信便介導第一信使(如激素等細胞外信號)對細胞內的反應，其影響幾乎涉及到細胞所有的生理和生化過程，如物質代謝、肌肉收縮、胞吞、胞飲、神經遞質釋放、染色體移動、DNA合成、細胞分裂以及細胞凋亡等，而且某些疾病的發生和發展都會引起細胞內游離鈣濃度(簡寫為[Ca2+])和分布的大幅度變化，甚至因此導致細胞死亡。隨著科技和社會的進步，人們對鈣代謝、鈣通道、鈣受體及其調控作用，鈣的轉運和利用以及鈣與某些疾病發生和發展關係的認識越 來越深入，研究細胞內Ca2+的含量及其時空分布的精確測定方法和技術已是當今化學、生物學、基礎和臨床醫學等學科的一個十分重要的前沿熱點研究課題。從20世紀50年代起，人們就開始研究測定細胞內Ca2+的方法和技術，先後建立和發展了多種方法，如Ca2+激活生物發光蛋白法、有機顯色劑法、核磁共振法、放射示蹤法、微電極法和螢光探針法等，這些方法各有其優缺點，實際應用時通常要根據各種方法的特點，按照所進行實驗的具體要求和目的而選擇不同的測定方法，其中螢光探針法是目前最常用的一種方法。通常細胞內游離鈣的濃度[Ca2+]僅為l(T7mol/L，而細胞外Ca2+濃度高達l(T3mol/L，而且隨著細胞的活動，胞質游離鈣的濃度還會發生較大變化，正是由於其分布的不均一性及其時空變化構成了細胞內Ca2+信號的基礎，Ca2+作為胞內第二信使對細胞代謝和功能進行調節正是通過胞內游離Ca2+含量及分布的變化，以及由此而引發的與蛋白質或酶的特異性結合而實現的。如此大的濃度梯度受細胞膜對鈣的通透性和傳輸性質控制。細胞膜、細胞核、內質網和線粒體上都具有主動的鈣轉運機制，當胞內鈣離子濃度上升時，這些轉運系統可以將鈣運出胞漿；當胞內鈣離子濃度下降時，又能將存貯在「鈣庫」中的「存貯Ca2+」釋放入胞質中成為游離鈣，從而保持細胞內游離鈣濃度Ca2+的穩定。測定細胞內游離鈣Ca2+測定在技術上的要求(I)對活細胞無損傷或生理條件下研究細胞鈣，不幹擾細胞內正常的生理、生化過程;(2)靈敏度高，檢出限應達10_7mol/L ;(3)選擇性好，由於細胞內其它一些無機離子如Mg2+，Na+，K+等的濃度均在10-3mol/L水平，故要求測定方法特異性和選擇性要強；(4)響應速度快，為了測定鈣濃度的變化，要求測定方法對Ca2+濃度變化的響應快於細胞內Ca2+信號引起的相關生理和生化反應；(5)時空解析度高，能實時、原位地提供胞內各亞細胞區域鈣信號聚散漲落的彼此獨立又相互關聯的信息。信號轉導是活細胞所執行的重要生物功能之一。細胞外的信號通常是通過各種各樣的化學刺激來傳遞到細胞內部的。活細胞的表面有多種多樣的受體，而信號正是通過這些受體的活化來傳遞到細胞內部，然後信號轉變為另外一種形式的信息以引起相應的細胞應答。第二信使在細胞內的信號轉導中起到非常重要的作用，它主要是通過離子濃度的變化來傳遞信息的。因此能夠監控細胞內的離子濃度對研究第二信使以及胞內信號轉導的研究具有極為重要的意義。鈣離子是人體內最重要的離子之一，是人體內重要的元素，廣泛分布於人體的細胞和體液中。隨著人們對鈣代謝、鈣通道、鈣受體及其調控，鈣的轉運和利用及其某些疾病發生和發展關係的認識愈來愈深入，細胞內Ca2+的研究已成為化學、生物學、基礎和臨床等學科重要的前沿熱點研究課題。細胞內自由鈣離子濃度([Ca2+])及其變化在細胞功能中起著十分重要的作用，精確測定活性細胞內鈣離子的濃度及其流入已成為生物學及醫學基礎研究的重要內容之一。目前大約30%的FDA批准的藥物是基於鈣離子通道的，尤其是心血管方面的藥物；農藥中也有相當部分是基於鈣離子通道的，例如最近杜邦公司剛剛上市的新農藥氯蟲醯胺，就是能選擇性的封閉害蟲的鈣離子通道，讓昆蟲缺鈣而死亡，但是對魚類和動物無任何影響，是2008年剛剛批准上市的綠色農藥。鈣螢光指示劑法是目前應用廣泛的測定活性細胞內鈣離子濃度的重要方法。近年來這方面的研究進展很快，並且開拓了有機試劑研究的新領域。目前來說，細胞Ca2+定主要是通過螢光探針標記，然後螢光顯微成像分析來實現的，探針的性能至關重要。探針若不能夠區分標記特定亞細胞區域，螢光顯微鏡也就根本無法獲取得到有關區域的Ca2+信息。而目前廣泛採用的以Fura2和Fluo3為代表的小分子Ca2+螢光探針均與細胞融合性不好，有一定毒性，均不具有亞細胞區域靶向定位性，或與Ca2+結合後無螢光峰的位移，難以採用雙波長比率法進行測定；或對於細胞內胞漿、胞核鈣無特異性。這對於細胞Ca2+信號研究，不僅得不到確切的信息，甚至會導致錯誤的結論。因此，研發靈敏度更高、選擇性更強、毒性更低的Ca2+探針十分必要和迫切，並且該利用該Ca2+探針研發快速分析鈣離子濃度的檢測試劑盒。

實用新型內容針對上述問題，本實用新型提供一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，該試劑盒用於測定鈣離子濃度，並且測定的靈敏度高、選擇性強，還對生物體的細胞毒性低。本實用新型通過以下技術手段實現一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，包括盒體；盒體內設有三個試劑瓶，其中一個裝有螢光探針標記物乾粉，一個裝有溶解溶劑，另一個裝有稀釋液。本實用新型還可做以下改進所述盒體為硬質盒體，盒體內還設有緩衝泡沫塑料，緩衝泡沫塑料上設有用於固定安放各配件的凹槽。還設有一次性吸管和空試劑瓶。所述裝有螢光探針標記物乾粉的試劑瓶為密閉的安瓿瓶，盒體內還設有開啟安瓿瓶的砂輪。所述空試劑瓶上設有體積刻度。所述裝有螢光探針標記物乾粉的安瓿瓶規格為lmL，所述裝有溶解溶劑的試劑瓶規格為5mL，所述裝有稀釋液的試劑瓶規格為IOOmL,所述一次性吸管為3根，所述空試劑瓶為6個，每個空試劑瓶上的刻度均為1-lOmL。所述溶解溶劑為二甲基亞碸溶液(DMSO)。所述稀釋液為Hank』 s平衡鹽溶液(HBSS溶液)。與現有技術相比，本實用新型具有的有益效果為I)利用本實用新型的試劑盒測定細胞內鈣離子濃度，具有非常好的螢光性能，其對細胞的毒害性小，螢光解析度比傳統測定方法提高100倍，背景更低。2)利用本實用新型的試劑盒測定細胞內鈣離子濃度，負載容易，只需與細胞簡單孵化即可進入細胞，無損傷且避免了微注射等繁雜手續。3)利用本實用新型的試劑盒測定細胞內鈣離子濃度，可在近中性的生理條件下與Ca2+高選擇性定量配位，響應其變化，據此可以實現在生理條件下對活細胞內游離Ca2+的測 量。4)利用本實用新型的試劑盒測定細胞內鈣離子濃度，顯色後採用螢光顯微成像技術，可提供細胞內Ca2+分布的二維或三維圖像，並可實時顯示，空間解析度優於其它所有方法。5)利用本實用新型的試劑盒測定細胞內鈣離子濃度，反應速度快，反應速度時間< 5ms，反應時間慢則無法反應活細胞的實時生理過程，而鈣微電極的響應時間需要幾秒，NMR法需要幾分鐘。6)利用本實用新型的試劑盒測定細胞內鈣離子濃度，該方法能與其它多種先進技術聯合應用，如圖像分析技術、流式細胞儀技術等，有利於對照觀察亞細胞結構。

圖I為本實用新型的試劑盒組成示意圖；圖中1.盒體；2.安瓿瓶；3.砂輪；4. 一次性吸管；5.空試劑瓶；6.緩衝泡沫塑料；7.裝有稀釋液的試劑瓶；8.裝有溶解溶劑的試劑瓶。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本實用新型做進一步說明，但並不對本實用新型造成任何限制。實施例I試劑盒組成如圖I所示，一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，包括盒體I ;盒體I內設有三個試劑瓶，其中一個裝有螢光探針標記物乾粉，一個裝有二甲基亞碸溶劑，另一個裝有Hank』 s平衡鹽溶液。所述盒體I為硬質盒體，盒體I內還設有緩衝泡沫塑料6，緩衝泡沫塑料6上設有用於固定安放各配件的凹槽。還設有3根一次性吸管4和6個刻度為I-IOmL空試劑瓶5。所述裝有螢光探針標記物乾粉的試劑瓶為密閉的安瓿瓶2，盒體內還設有開啟安瓿瓶的砂輪3。所述裝有螢光探針標記物乾粉的安瓿瓶2規格為lmL，所述裝有二甲基亞碸溶劑的試劑瓶8規格為5mL，所述裝有Hank』 s平衡鹽溶液的試劑瓶7規格為100mL。[0039]上述試劑盒的保存條件為溫度< _20°C，密封、乾燥和避光。實驗原理 螢光探針標記物，如Fluo-IOAM，是一種可以穿透細胞膜的螢光染料。Fluo IOAM通過引入乙醯甲酯基團增強整個分子的親脂性，使其能夠穿透活細胞膜，進入細胞後被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-ΙΟ，從而被滯留在細胞內，Fluo-IO若以游離配體形式存在時幾乎是非螢光性的，當它與細胞內鈣離子結合後可以產生非常強的螢光。可以使用雷射共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化，從而研究藥物的毒性和生物活性。操作步驟各試劑在使用前平衡至室溫。I、母液配製用砂輪3將安瓿瓶2打開，然後用一次性吸管4吸取DMSO溶液至安瓿瓶2中溶解、轉移螢光探針標記物至一個空試劑瓶5中，然後用DMSO定容至預訂刻度線，配製成lmmol/L的母液。_20°C避光密封保存。使用前根據實驗需要稀釋成合適的濃度。2、取出培養好的細胞，除去培養基，用稀釋液(HBSS溶液)洗滌細胞3次，儘量除去殘留的培養基。3、把適量螢光探針標記物母液轉移至剩下的空試劑瓶5中，用稀釋液(HBSS溶液)定容至預訂刻度，配製成1-5 μ mol/L工作液，渦旋混勻配成工作液；螢光探針標記物工作液需要即配即用，勿反覆凍存。也可根據實驗需求，自行調整最佳工作濃度。4、加入螢光探針標記物工作液，溶液量以覆蓋細胞為準，37 °C細胞培養箱孵育15-60min，建議先孵育30min，觀察螢光效果如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果螢光強度太弱，適當延長時間，其中，最佳孵育時間應根據實驗要求自行調整。5、除去螢光探針標記物工作液，用HBSS溶液洗滌細胞3次，以充分去除殘留的螢光探針標記物工作液。然後加入HBSS溶液覆蓋細胞。6、37°C培養箱孵育約20_30min，以確保螢光探針標記物在細胞內的完全去酯化作用。7、用雷射共聚焦或螢光顯微鏡檢測細胞。條件為激發波長494nm，發射波長516nm。以上內容是結合具體的優選實施方式對本實用新型所作的進一步詳細說明，不能認定本實用新型的具體實施只局限於這些說明。對於本實用新型所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本實用新型構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本實用新型的保護範圍。
權利要求1.一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，包括盒體(I);其特徵在於盒體(I)內設有三個試劑瓶，其中一個裝有螢光探針標記物乾粉，一個裝有溶解溶劑，另一個裝有稀釋液。
2.根據權利要求I所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於所述盒體為硬質盒體，盒體內還設有緩衝泡沫塑料￠)，緩衝泡沫塑料(6)上設有用於固定安放各配件的凹槽。
3.根據權利要求I或2所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於還設有一次性吸管(4)和空試劑瓶(5)。
4.根據權利要求3所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於所述裝有螢光探針標記物乾粉的試劑瓶為密閉的安瓿瓶(2)，盒體內還設有開啟安瓿瓶的砂輪⑶。
5.根據權利要求4所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於所述空試劑瓶上設有體積刻度。
6.根據權利要求5所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於所述裝有螢光探針標記物乾粉的安瓿瓶規格為lmL，所述裝有溶解溶劑的試劑瓶(8)規格為5mL，所述裝有稀釋液的試劑瓶(7)規格為IOOmL,所述一次性吸管為3根，所述空試劑瓶為6個，每個空試劑瓶上的刻度均為1-lOmL。
7.根據權利要求I所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於所述溶解溶劑為二甲基亞碸溶液。
8.根據權利要求I所述的一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，其特徵在於所述稀釋液為Hank』 s平衡鹽溶液。
專利摘要本實用新型提供一種基於鈣離子通道的藥物篩選試劑盒，屬於試劑盒測定技術領域。包括盒體；盒體內設有三個試劑瓶，其中一個裝有螢光探針標記物乾粉，一個裝有溶解溶劑，另一個裝有稀釋液。將該試劑盒用於測定鈣離子濃度，並且測定的靈敏度高、選擇性強，還對生物體的細胞毒性低。適合用於測定細胞內鈣離子濃度，輔助作用原理是基於鈣離子通道藥物的篩選。
文檔編號C12M1/34GK202543210SQ2012201847
公開日2012年11月21日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者武婕, 魏軍 申請人:廣州威佳科技有限公司