按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列的製作方法

2023-04-28 19:39:26 1

專利名稱：：按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種基因序列。
背景技術：
：隨著經濟的高速發展，人民生活水平的不斷提高，高品質的生活越來越受到人們的關注，這其中最重要的一條就是健康。但是經濟的發展又伴隨著人們飲食結構的改變，工作、生活壓力的增大，運動的減少和居住生活環境的惡化等等對健康不利的因素，各種疾病特別是惡性疾病的發病率有逐年增高的趨勢，其中肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次於胃、食道而居第三位，在部份地區的農村中則佔第二位，僅次於胃癌，在我國每年死於肝癌約11萬人，佔全世界肝癌死亡人數的45%。為了預防和治療這些惡性疾病，全國每年花費大量的人力和物力，但收效甚微。據統計，全球現在有1500萬-2000萬人酗酒，其中10%-20%的人有不同程度的酒精性肝病。在我國，也有不少人嗜好飲酒。據報導，適量飲酒對大多數人的健康並沒有損害，少量飲用酒精性飲料，如葡萄酒，對身體還有一定的好處。但是，若長期過量飲酒，特別是飲用高度酒，會使肝細胞反覆發生脂肪變性、壞死和再生，最終導致肝硬化、肝癌。另外，根據報導乙醛脫氫酶的補充可以減少心肌缺血/再灌注損傷，減少心肌細胞由於缺氧而引起的凋亡等。許多文獻已經表明乙醛脫氫酶的存在對心肌細胞都有良好的保護作用。基於以上原因，社會迫切的需要一種行之有效的解酒、保肝的保健品出現。今年來出現一些含乙醛脫氫酶的解酒藥的報導，但是乙醛脫氫酶至今獲得途徑的狹窄，成為該類保健品的瓶頸。
發明內容本發明的目的在於提供一種按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列，該基因序列在畢赤酵母中可表達。為實現上述目的，本發明的技術方案是按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列，其特徵在於按照畢赤酵母偏好性設計的DNA分子，該分子編碼具有與人乙醛脫氫酶2基因geneID217編碼的蛋白在胺基酸水平相同的核苷酸序列。本發明按照畢赤酵母偏好性，通過重疊延伸法合成了ALDH2序列；該序列編碼的蛋白具有與野生型人ALDH2在胺基酸水平上具有相同功能。所述的野生型人ALDH2為geneID217編碼的胺基酸序列的多肽。所述的按畢赤酵母偏愛密碼子設計的人乙醛脫氫酶2基因序列是指在人J丄Z)//2基因(geneID217)基礎上[由Genebank上人XLD/ODNA(geneID217)序列]，刪除UTR和信號肽並加上內切酶五coRI和內切酶I酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法將編碼Ala的密碼子GCG替換為GCU，將編碼Arg的密碼子CGC和CGG替換為AGA、AGG、CGU禾口CGA;共修改了28個鹼基得到目的序列ALDH2;具體序列如下-CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCMCCAGCAGCCCGAGGTCT60TCTGCAACCAGATTTTCATAAACMTGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC120CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG180ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGMCAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG300ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAMTGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC480CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGMTTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCMCTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG660TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG720TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG780GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT960TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTMGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG1200AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGMGTTCMGACCATAGAGGAGGTTGTTG1260GGAGAGCCMCAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACMAGGATTTGGACA1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA1500AGAACTCAGCGGCCGA1516設計的畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列按下列方法在畢赤酵母中表達用現有的重疊延伸法合成產人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2)，用現有的常規方法將產人乙醛脫氫酶2連接在質粒pUC57上，得到質粒pUC57-ALDH2。並按常規化學轉化法轉化該質粒至大腸桿菌DH5a，得到大腸桿菌DH5a(pUC57-ALDH2)。用酚氯仿或DNA提取試劑盒從含有質粒pUC57-ALDH2的大腸桿菌DH5a(pUC57-ALDH2)中提取質粒pUC57-ALDH2;準備質粒pPIC9K和pUC57-ALDH2，分別用內切酶&oRI和內切酶A^I雙酶切，並電泳回收酶切後的質粒pPIC9K和產人乙醛脫氫酶2序列。用T4連接酶連接酶切後的質粒pPIC9K和產人乙醛脫氫酶2序列，並按常規化學轉化法轉化該質粒至大腸桿菌DH5a，得到大腸桿菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)。用酚氯仿或DNA提取試劑盒從含有質粒pPIC9K-ALDH2的大腸桿菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)中提取質粒pPIC9K-ALDH2。用內切酶SacI線性化。得到的線性化pPIC9K-ALDH2電轉導至巴斯德畢赤酵母(屍/cWapflWonJ)GS115。並篩選得到酶活較高的巴斯德畢赤酵母(屍/c/2/a;aWo/^)GS115-07ALDH2菌株。本發明的有益效果是該基因序列在畢赤酵母中可表達人乙醛脫氫酶2。所得到的一株巴斯德畢赤酵母(P/c/z/apaWo^)GS115-07ALDH2菌株可應用於解酒、保肝；具有解酒、保肝的效果。圖1是質粒pUC57-ALDH2和質粒pPIC9K酶切回收片段圖。泳道1、泳道2是質粒pUC57-ALDH2酶切回收圖，泳道3是質粒pPIC9K酶切回收圖。圖2是大腸桿菌DH5a感受態細胞轉化質粒pPIC9K-ALDH2菌液PCR圖。具體實施例方式一、質粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證1.目的序列設計與合成按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列，其特徵在於按照畢赤酵母偏好性設計的DNA分子，該分子編碼具有與人乙醛脫氫酶2基因geneID217編碼的蛋白在胺基酸水平相同的核苷酸序列。所述的按畢赤酵母偏愛密碼子設計的人乙醛脫氫酶2基因序列是指在人^丄￡>//2基因(geneID217)基礎上[由Genebank上人^LD//2DNA(genelD217)序列]，刪除UTR和信號肽並加上內切酶五coRl和內切酶iVwI酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法將編碼Ala的密碼子GCG替換為GCU，將編碼Arg的密碼子CGC和CGG替換為AGA、AGG、CGU禾口CGA;共修改了28個鹼基得到目的序列ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT60TCTGCMCCAGATTTTCATAMCAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC120CCACCGTCMTCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG180ATGTGGACMGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG300ACAGMCCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCMATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC480CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGMGGTAGCTGAGCAGACAC600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG660TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG720TGGACMAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG780GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGMCCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT960TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG1200AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG1260GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA1500AGMCTCAGCGGCCGA1516按上述目的序列ALDH2，用現有的重疊延伸法合成產人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2)，用現有的常規方法將產人乙醛脫氫酶2(ALDH2)連接在質粒pUC57上，得到質粒pUC57-ALDH2;使用上海生工的高效製備感受態細胞試劑盒製備大腸桿菌DH5ot感受態細胞；將lOpL質粒pUC57-ALDH2與50pL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加人500pL的LB培養基，37。C振蕩培養lh;取100pL培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37'C培養過夜，得到的含有質粒pUC57-ALDH2的陽性轉化子，保存備用；2.質粒構建用酚氯仿或DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司Hl-l-3)從含有質粒pUC57-ALDH2的陽性轉化子中提取質粒pUC57-ALDH2;準備質粒pPIC9K，並用內切酶￡coRI和內切酶iVo/I雙酶切；①按下述原料配比選取質粒pUC57-ALDH2、WashSolution、內切酶五coRl、內切酶iVwI、小牛血清白蛋白和蒸餾水，在37T:酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產人乙醛脫氫酶2序列(如圖l，酶切驗證回收的產人乙醛脫氫酶2序列為目的序列ALDH2);②按下述原料配比a.酶切質粒pUC57-ALDH2緩衝液WashSolution10nL，3nL，L，內切酶五coRl(20U4iL)內切酶iVwI(5U/(xL)小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)蒸餾水7質粒pPIC9K緩衝液WashSolution內切酶五coRl(20U&L)內切酶iVwI(5U/^L)小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)蒸餾水10(iL，3pL，3nL，l(VL，選取質粒pPIC9K、緩衝液WashSolution、內切酶五coRl、內切酶iVwI、小牛血清白蛋白和蒸餾水，在37'C酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切後的質粒pPIC9K(如圖1);b.連接按產人乙醛脫氫酶2序列和酶切後的質粒pPIC9K的摩爾比2:1混合，得到混合DNA，用T4連接酶連接；按下述原料配比T4連接酶lpL，T4連接酶緩衝液2pL，混合DNA7pL，選取T4連接酶、T4連接酶緩衝液和混合DNA，在4'C連接過夜，得到連接產物(pPIC9K陽ALDH2);連接產物(pPIC9K-ALDH2)轉化大腸桿菌DH5a:將10pL上述連接產物(pPIC9K-ALDH2)與50pL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500pL的LB培養基，37。C振蕩培養lh;取100pL培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37。C培養過夜，得到大腸桿菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)。挑取大腸桿菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)，接種到lmL含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基中，37°C150r/min振蕩培養過夜，離心，離心條件10000g離心lmin，棄上清，挑取少量菌體懸浮於20nL蒸餾水中，沸煮10min，離心，離心條件10000g離心lmin，取4jxL上清作模板，進行菌液PCR;PCR引物為5'AOX1(5，—gactggttccaattgacaagc-3，)和3'AOX1(5，-gcaaatggcattctgacatcctct-3');PCR體系(20pL):模板化L，上遊引物(2mmol/L)2pL，下遊引物(2mmol/L)2pL，10Xbuffer2pL，MgCl2(25腿ol/L)l單，dNTPs(2mmol/L)2pL，3.驗證:Taq酶(5U/pL)0.5pL，蒸餾水6pL;混合後在PCR條件反應95。C3min,94。Clmin—「55。CL5min|25次72°Clmin~172。C8min,PCR產物瓊脂糖電泳檢測(錯誤！未找到引用源。)；菌液PCR陽性的進一步測序驗證，大腸桿菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)中ALDH2序列為前述的目的序列ALDH2。按畢赤酵母偏好性設計人ALDH2的核酸序列與人ALDH2cDNA序列(麗一000690)比較Identity=98.13%(1472/1500)G即4.06%(16/1516)二、菌株的構建和篩選1.質粒的線性化與電轉導質粒的線性化從大腸桿菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)中提取質粒pPIC9K-ALDH2;採用內切酶&cI(2U4iL)5^L、小牛血清白蛋白(lmg/ml)3^L、緩衝液10XBufferG3pL、超純水9nL和質粒pPIC9K隱ALDH210pL，在37。C孵育過夜；再用酚氯仿異戊醇=25:24:1，抽提線性化產物，然後用乙醇沉澱線性化產物，最後用1020^LTE緩衝液溶解，得到線性化質粒溶液；巴斯德畢赤酵母(屍/cWfl)GS115的電轉導首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母(屍/c/^戶"加n's)GS115的一級種子液，接種到含50mlYPD培養基的300mL搖瓶中，使巴斯德畢赤酵母(P!'c/n'apa加n's)GS115菌體濃度生長至OD600=1.3-1.5，後收集菌體，用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次，最後用O.lmL、4"C的1M山梨醇來懸浮細胞；然後取90pL山梨醇懸浮細胞與10pL線性化質粒溶液混合，轉入4'C的lmm電轉杯中，在電轉儀1200V、5ms的條件進行電轉，電轉導樣品塗布到MD培養基上，3(TC培養2-3d，得到巴斯德畢赤酵母(屍/c//a;^Ww^)GS115-07ALDH2菌株；2.菌株的篩選從巴斯德畢赤酵母(屍/c/H'a/aWw^)GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落，進行誘導表達，首先採用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株；然後，再對陽性菌株進行再一次的誘導表達，檢測方法改變為檢測其上清液中的酶活，選取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株巴斯德畢赤酵母(Pz'cWa/aWw^)GS115-07ALDH2菌株(即一株重組畢赤酵母菌株)。三、一株巴斯德畢赤酵母(戶/cWa;aWw^)GS115-07ALDH2菌株的鑑定1、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(屍/c/n'";"Woni)GS115-07ALDH2菌株(即一株重組畢赤酵母菌株)的形態特徵與生理生化特性見表l。表1檢測結果檢測項目結果檢測項目結果細胞形狀球形-卵海藻糖+圓形纖維二糖-分裂方式芽殖澱粉-利用糖發酵D-木糖+葡萄唐+L-阿拉伯糖-蔗糖-D-核糖-半乳糖-鼠李糖+麥芽糖-檸檬酸+乳糖-2-酮葡萄糖+海藻糖+糊精+/陽棉子糖-e-甲基-D-葡糖苷+利用碳水化合物杏甘+半乳糖-熊果甘+葡萄糖+D-樹膠醛糖+蔗糖-L-樹膠醛糖+半乳糖-吐溫80+麥芽糖-乳糖-表l中符號說明"+":90%以上的菌株為陽性，"-"90%以上的菌株為陰性表1說明該菌株的形態特徵與生理生化特性與巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/apwtor^)GS115(為華中農業大學生命科學技術學院贈送)一致。2、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(屍/cWfl/arfor^)GS115-07ALDH2菌株的全細胞脂肪酸組份的鑑定，見表2。檢測結果Volume:DATAFile:E091124.00ASampCtr:3Idnumber:1932Type:SampBottle:2Method:YEAST6Created:1/12/200910:24:34AMSampleID:GS115表2—株巴斯德畢赤酵母(P/cW"pa對oA)GS115-07ALDH2菌株的全細胞脂肪酸組份及其含量RTResponAr/HRFacECLPeakNameCommentlComment21.81941E+80.03—_6.994SOLVENTPEAK—<minrt2.11128800.03—■7.519—<minrt10tableseeoriginaldocumentpage11ECLDeviation:0.003eferenceECLShift:0.002NumberReferencePeaks:1TotalResponse:130182TotalN謹d:130182PercentNamed:100.00%Totalamount:114616表2說明該菌株的全細胞脂肪酸組份與巴斯德畢赤酵母(P/c/z/a/7"對w^)GS115(為華中農業大學生命科學技術學院贈送)相似。3、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(戶/c/n'a)GS115-07ALDH2菌株的18SrRNA基因序列如下TGAGCCATTCGCAGTTTCACCGTATAATGCTA該菌株的18SrRNA基因序列與巴斯德畢赤酵母(戶/c^"/^tor^)GS115的18SrRNA基因序列完全相同。以上三方面檢測結果說明，檢測菌株為巴斯德畢赤酵母(屍/c/n'fl戶aWw^)GS115。命名為一株巴斯德畢赤酵母(屍/cWa/^Ww^)GS115-07ALDH2菌株(即為一株重組畢赤酵母菌株)，己於2009年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCCN0:M208266。四、一株巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/a;^WoW;y)GS115-07ALDH2菌株應用將一株巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/a戸WW7、)GS115-07ALDH2菌株在BMGY培養基中培養24h，再收集菌體轉入到BMMY培養基中誘導表達60h，離心(6000轉/分)5分鐘，取上清液加入質量濃度為250g/L的聚乙二醇PEG8000沉澱上清液中的人乙醛脫氫酶2，然後加入和上清液等體積的蒸餾水，溶解人乙醛脫氫酶2，得到含人乙醛脫氫酶2的酶液，最後採用殼聚糖來進行固定，固定具體過程如下①取3.00g殼聚糖(脫乙醯度>90%)，加入蒸餾水100mL，磁力攪拌10min，充分混勻；再加入lmL冰醋酸，磁力攪拌2h，得到殼聚糖膠液；②在磁力攪拌的情況下，向上述50mL殼聚糖膠液中，加入10mL含人乙醛脫氫酶2的酶液(濃度為100mg/mL),攪拌均勻後，再加入質量濃度為20mg/mL的焦磷酸鈉溶液50mL，攪拌10min，靜置固定化3h;得到初始固定化酶，用蒸餾水將多餘的焦磷酸鈉洗掉，得到固定化酶樣品；③將上述固定化酶樣品用冷凍乾燥機乾燥，在-50。C下乾燥48h至乾燥完全，得到固定化酶(產品)。所述的BMGY培養基1%(質量含量)酵母膏，2%蛋白腖，1.34%酵母氮源鹼YNB(含硫酸銨，不含胺基酸)，4X1(T5%生物素，1%甘油，100mmol/L磷酸鉀緩衝液(pH為6.0);餘量為蒸餾水。所述的BMMY培養基1%酵母膏，2%蛋白腖，1.34%酵母氮源鹼YNB(含硫酸銨，不含胺基酸)，4X1(T5%生物素，0.5%甲醇，100mmol/L磷酸鉀緩衝液(pH為6.0)，餘量為蒸餾水。12五、畢赤酵母基因表達產物乙醛脫氫酶的動物學檢驗將人乙醛脫氫酶2進行固定化處理，得到的樣品來檢驗解救小鼠急性酒精中毒的能力。1、人乙醛脫氫酶2固定化處理動物的胃液pH值很低，而ALDH2極易分解，故用殼聚糖進行固定化處理後再進行小鼠灌胃實驗。具體過程如下①取3.00g殼聚糖(脫乙醯度>90%)，加入蒸餾水100mL，磁力攪拌10min，充分混勻；再加入lmL冰醋酸，磁力攪拌2h，得到殼聚糖膠液；②在磁力攪拌的情況下，向上述50mL殼聚糖膠液中，加入10mL含人乙醛脫氫酶2的酶液(100mg/mL)，攪拌均勻後，再加入質量濃度為20mg/mL的焦磷酸鈉溶液50mL，攪拌10min，靜置固定化3h;之後得到初始固定化酶，用蒸餾水將多餘的焦磷酸鈉洗掉，得到固定化酶樣品；③將上述固定化酶樣品用冷凍乾燥機乾燥，在-50。C下乾燥48h至乾燥完全，固定化所得酶製劑置4°C保存。小數灌胃前取4g酶製劑加入到10mL1%CMC中製成懸濁液備用[因為固定化酶(產品)是固態，不方便餵養小鼠，所以將固定化酶(產品)做成懸濁液為方便餵養，所以後面所涉及到餵食的固定化酶(產品)都為這種懸濁液，取名為"固定化酶懸濁液"〗。2、醉酒劑量實驗30隻小鼠隨機分為3組，每組10隻。實驗前禁食12h，不禁水。實驗時各組小鼠分別按14mL/kg、16mL/kg、18mL/kg的劑量灌胃56。二鍋頭，觀察12h。記錄小鼠醉酒時間與醒酒時間以及醉酒率和死亡率。小鼠醉酒的判斷標準是小鼠取背向位放入盒子中。若小鼠背向下的姿勢可保持30s以上，則認為翻正反射消失，即為醉酒。劑量實驗結果如表3;表3不同給酒劑量小鼠急性酒精中毒實驗結果tableseeoriginaldocumentpage133、醉酒預防實驗將40隻小鼠(雌雄各半)預養3d，分成模型組、服用固定化酶懸濁液組。每組10隻，各組小鼠實驗前禁食12h，不禁水。模型組每隻按20mL/kg的灌胃量灌注濃度為P/。的CMC，其餘三組每組每隻按20mL/kg的灌胃量灌注相應的固定化酶懸濁液。30min後各組小鼠均按16mL/kg灌胃56。二鍋頭，記錄給白酒時刻、各組醉酒動物翻正反射消失時刻、翻正反射恢復時刻，進一步計算睡眠時間(小鼠翻正反射消失至翻正反射恢復的時間)，醉酒時間=翻正反射消失時刻一給酒時刻，醒酒時間亦即睡眠時間。4、醉酒治療實驗小鼠數目，分組及實驗方法同前面醉酒預防實驗，將灌酒和灌酶液的先後次序對調，改為灌酒30min後再餵固定化酶懸濁液。記錄給酒後，小鼠的醉酒時間和醒酒時間。結果如表；表4小鼠的醉酒時間和醒酒時間預防實驗治療實驗實驗組別醉酒時間醒酒時間醒酒時間(min)PPP(min)(min)模型組固定化酶懸濁液組34.3±3.2946.1±3.98253.20±52.38<0.05190.30±15.42<0.05241.0±42.46187.卯±17.99<0.05由結果由表4可知，治療實驗和預防實驗結果基本是一致的。餵了固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]的小鼠的醒酒時間，與對照組相比，均有不同程度的縮短。此外，在灌酒之前用固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]灌胃可以延緩小鼠的醉酒。說明固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]有顯著的解酒效果。所選用醉酒時間是表示小鼠從喝酒到已經醉酒的時間，如果這個時間段越長，說明吃了本發明的固定化酶懸濁液後，小鼠可以有效的延長他們的醉倒。5、小鼠體內轉氨酶的檢測小鼠30隻，隨機分為空白組、模型組、服用固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]組共3組。每組10隻，各組小鼠先禁食12h，不禁水。空白組不餵任何物質，模型組每隻按20ml/kg的灌胃量灌注濃度為1%的CMC，其餘三個實驗組每組每隻按20mL/kg的灌胃量灌注相應的酶液。30min後除空白組外其餘各組小鼠均按16mL/kg灌胃56。二鍋頭。300min後所有組的小鼠均斷頭取血，並解剖取小鼠肝臟。用千分之一天平準確稱取小鼠肝臟，按重量體積比加99倍生理鹽水製成1%勻漿，3500r/min離心IO分鐘，取上清待測。按照試劑盒說明書測定谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶。自斷頭取血後獲得的血液樣品製備血清，按照試劑盒說明書進行谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶的測定。結果如表5。表5血液和肝臟中轉氨酶活力測定結果_ALT/GPT(U/mg蛋白)AST/GOT(U/mg蛋白)實驗組別-_血液P肝臟P血液P肝臟P空白組950±68470±78830±98364±282206±1模型組<0.051200±156<0.051923±165<0.05988±170<0.0535固定化酶1203±8<0.05606±78<0.05932±70<0.05420±72<0.05懸濁液組9_轉氨酶檢測結果可以看出固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]組顯著低於模型組(模型組是每隻按20mL/kg的灌胃量灌注濃度為1%的CMC，因為本發明的酶是懸濁在1%的CMC裡，需要檢測防醉酒到底是1%的CMC在起作用，還是本發明的酶在起作用，所以設這一個模型組來證明不是P/。的CMC在起作用)，且不同程度地高於空白組。三個實驗組之間有明顯差別，結果表明固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]對小鼠的肝臟起到了明顯的保護作用。權利要求1.按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列，其特徵在於按照畢赤酵母偏好性設計的DNA分子，該分子編碼具有與人乙醛脫氫酶2基因geneID217編碼的蛋白在胺基酸水平相同的核苷酸序列。2.根據權利要求1所述的按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列，其特徵在於所述的按畢赤酵母偏愛密碼子設計的人乙醛脫氫酶2基因序列是指在人J丄Z^T2基因(geneID217)基礎上，刪除UTR和信號肽並加上內切酶￡coRI和內切酶M)fI酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法將編碼Ala的密碼子GCG替換為GCU，將編碼Arg的密碼子CGC和CGG替換為AGA、AGG、CGU和CGA;共修改了28個鹼基得到目的序列ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT60TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC120CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG180ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG300ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACMGGCATGAAC■CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGMACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG660TCMCATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG720TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTMTCCAGGTTGCTGCTG780GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT960TTGTGGAGCGMGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGMGATCCTCGGCTACATCA1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTMGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG12Q0AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG1260GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA1500AGAACTCAGCGGCCGA1516。全文摘要本發明涉及一種基因序列。按畢赤酵母偏愛密碼子設計人乙醛脫氫酶2序列，其特徵在於按照畢赤酵母偏好性設計的DNA分子，該分子編碼具有與人乙醛脫氫酶2基因geneID217編碼的蛋白在胺基酸水平相同的核苷酸序列。所述的按畢赤酵母偏愛密碼子設計的人乙醛脫氫酶2基因序列是指在人ALDH2基因(geneID217)基礎上，刪除UTR和信號肽並加上內切酶EcoRI和內切酶NotI酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法將編碼Ala的密碼子GCG替換為GCU，將編碼Arg的密碼子CGC和CGG替換為AGA、AGG、CGU和CGA；共修改了28個鹼基得到目的序列ALDH2。該基因序列在畢赤酵母中可實現高效表達，可應用於解酒、保肝；具有解酒、保肝的效果。文檔編號C12N15/53GK101649323SQ20091006271公開日2010年2月17日申請日期2009年6月16日優先權日2009年6月16日發明者吳元欣,池汝安,錦趙,趙玉鳳,凡鄧,雷明科,錕黃申請人:武漢工程大學