一種快速測定靈芝產品中多糖肽的方法
2023-04-28 05:37:06 4
一種快速測定靈芝產品中多糖肽的方法
【專利摘要】本發明提供了一種簡便快速測定靈芝產品中多糖肽的方法，是採用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）為檢測手段，以靈芝活性多糖肽為對照品，對靈芝產品中多糖肽的含量進行快速檢測。本發明樣品的前處理僅需簡單的提取操作，方便快捷；最終樣品經色譜高效分離後，通過蒸發光散射檢測器對產品中的多糖肽進行定量分析，其測定結果準確度高、穩定性好、優於目前常用的分光光度法，為靈芝產品的品質鑑定與質量控制提供了一種十分有效的分析方法。
【專利說明】一種快速測定靈芝產品中多糖肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥材分析領域，具體涉及採用HPLC-ELSD法快速測定靈芝產品中多糖肽的方法。
【背景技術】
[0002]靈芝是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，為滋補強壯、扶正固本的珍品，已有悠久的藥用歷史。現代科學技術的應用使靈芝的研究更加深入，更進一步證明靈芝及其有效成分具有廣泛的藥理作用，可防治慢性支氣管炎、神經衰弱、高血脂症、冠心病、肝炎、白細胞減少、腫瘤等疾病。靈芝多糖肽作為靈芝的有效成分之一，是從靈芝子實體中經水提取-柱層分離得到的多種糖肽，其中包含有GL-PPT2、GL-PPT3和GL-PPT4三種多糖肽。現代研究表明，靈芝多糖肽具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、安神、降血糖、消除放化療副反應、除胃熱、保肝解毒等功效。目前對於多糖肽的檢測僅有陳穎等人報導的FoLin-酚法(陳穎，王賽貞，林樹錢.用FoLin-酚法測定靈芝產品中多糖肽含量[J].海峽藥學，2007，19 (7): 37-39.)，具體操作為在ImL樣品中加入鹼性銅試液1.0 mL,室溫放置IOmin,加入4mL FoLin-酹試液，55°C水浴5min,冷卻至室溫,在750nm測定吸光值,但此法試劑配製繁瑣，檢測結果不夠穩定。
[0003]蒸發光散射檢測器的工作原理是恆定流速的高效液相洗脫液進入檢測器後，先被高壓氣流霧化，霧化形成的小液滴進入蒸發室(漂移管)，流動相及低沸點的組分被蒸發，剩下高沸點組分的小液滴進入散色池，光束穿過散色池被散射，散射光被光電管接收形成電信號，電信號通過放大電路、模數轉換電路、計算機成為色譜工作站的數位訊號——色譜圖，即獲得待測組分的液相色譜。因此可以根據目標物的色譜保留時間、色譜峰面積與標準物質保留時間、色譜峰面積的比較，對化合物進行定性、定量測定。本發明採用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器，對經過簡單提取後的靈芝產品中多糖肽的含量進行檢測，測定結果重現性好，穩定準確可靠。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種高靈敏、簡便快速測定靈芝產品中多糖肽的方法，是通過高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)對樣品進行定性、定量分析，本發明方法操作簡單、重複性好，為靈芝產品中的品質評價及質量控制提供了一種有效、可靠的方法。
[0005]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
一種快速測定靈芝產品中多糖肽的方法，是採用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器對靈芝產品中多糖肽的含量進行快速檢測。
[0006]具體檢測方法如下:
O高效液相色譜條件
液相條件:色譜柱為TSK4000PW (7.8 mmX30 cm);流動相為甲醇:水=20:80 ;流速為1 mL/min ;柱溫為35°C ;進樣量為10 μ L ;
2)蒸發光散射檢測器檢測條件
漂移管溫度為55 V ;噴霧器為加熱模式；氣體壓力為45 psi ；
3)標準曲線繪製
精密稱取乾燥的多糖肽對照品0.0500 g於10 mL容量瓶中，用水溶解並定容，得濃度為5.00 mg/mL的多糖肽對照品儲備液；臨用前，分別取100 μ L.200 μ L、300 μ L、400 μ L.500 「1^於5 11^容量瓶中，用水稀釋至刻度，得濃度分別為100.0、200.0、300.0、400.0,500.0 μ g/mL標準工作液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到濃度-峰面積標準曲線；
4)樣品處理
稱取靈芝產品1-2 g，加水40 mL後於60 1:水浴提取30 min，冷卻，定容至50 mL ;過濾，取濾液2 mL,加6 mL無水乙醇,混勻，於10000 rpm離心15 min,沉澱用流動相溶解,過
0.22 μ m有機濾膜後得樣品溶液備用；
5)樣品含量測定
吸取樣品溶液進行測定後，根據濃度-峰面積標準曲線得出的線性方程，將多糖肽的峰面積換算為樣品中多糖肽的濃度，從而計算出樣品中的多糖肽含量。
[0007]所述靈芝產品包括靈芝原料藥和靈芝保健品。
[0008]本發明的顯著優點在於:本發明樣品前處理的方法簡單快捷、省時省力；採用蒸發光散射檢測器進行檢測，能有效排除雜質幹擾，針對性強，有利於靈芝樣品中多糖肽成分的準確定性與定量；本發明方法操作簡便，重複性好，結果準確可靠，有利於靈芝樣品中保健成分的鑑定分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為靈芝多糖肽對照品色譜圖。
[0010]圖2為靈芝多糖肽對照品的標準曲線。
[0011]圖3為靈芝多糖肽對照品的精密度試驗重疊色譜圖。
[0012]圖4為靈芝樣品重現性試驗的重疊色譜圖。
[0013]圖5為靈芝樣品穩定性試驗的重疊色譜圖。
[0014]圖6為靈芝樣品加樣回收試驗的重疊色譜圖。
[0015]圖7為鄭州韓都靈芝樣品的蒸發光散射檢測色譜圖。
[0016]圖8為上海慶安靈芝樣品的蒸發光散射檢測色譜圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
1.檢測儀器與材料 1.1儀器
Waters 2515型高效液相色譜儀系統，Waters 2424型蒸發光散射檢測器，Empower色譜工作站及數據處理系統。
[0018]1.2.材料 多糖肽對照品(> 95%，國家菌草工程技術研究中心);鄭州韓都靈芝樣品和上海安慶靈芝樣品均為靈芝原料藥，購於本地藥店。
[0019]2.檢測方法
2.1樣品溶液的配製
稱取靈芝樣品I _2g，加水40 mL後於60 1:水浴提取30 min，冷卻，定容至50 mL ;過濾，取濾液2 mL,加6 mL無水乙醇,混勻。於10000 rpm離心15 min,沉澱用流動相溶解，
0.22 μ m有機濾膜過濾，得樣品溶液備用。
[0020]2.2標準溶液的配製
精密稱取乾燥的多糖肽對照品0.0500 g於10 mL容量瓶中，用水溶解並定容，得濃度為5.00 mg/mL的多糖肽溶液。
[0021]2.3高效液相色譜條件
液相條件:色譜柱為TSK4000PW (7.8 mmX30 cm);流動相為甲醇:水=20:80 ;流速為I mL/min ;柱溫為35°C ;進樣量為10 μ L。
[0022]2.4蒸發光散射檢測器檢測條件
漂移管溫度為55 V ;噴霧器為加熱模式；氣體壓力為45 psi。
[0023]2.5標準曲線繪製
臨用前，分別取100 μ L.200 μ L.300 μ L、400 μ L、500 μ L多糖肽溶液於5 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得濃度分別為100.0,200.0,300.0,400.0,500.0 μ g/mL多糖肽工作液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到濃度-峰面積標準曲線；
2.6樣品含量測定
吸取樣品溶液進行測定後，根據濃度-峰面積標準曲線得出的線性方程，將多糖肽的峰面積換算為樣品中多糖肽的濃度，從而計算出樣品中的多糖肽含量。
[0024]2.7精密度試驗
用相同濃度的對照品重複進樣5次，測定儀器的精密度。
[0025]2.8重現性試驗
用鄭州韓都靈芝樣品溶液重複進樣5次，測定方法的重現性。
[0026]2.9穩定性試驗
將鄭州韓都靈芝樣品溶液放置0、2、4、8小時後進行樣品穩定性考察。
[0027]2.10回收試驗
臨用前，分別取100 μ L、200 μ L、300 μ L多糖肽溶液於2 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得3個濃度分別為0.250,0.500,0.750 mg/mL標準工作液，將低、中、高3個濃度的標準工作液分別加入到已知濃度的鄭州韓都靈芝樣品溶液中進行測定，每個濃度平行測定2份。
[0028]3.檢測結果
3.1標準曲線的測定
多糖肽對照品色譜圖如圖1，多糖肽對照品的標準曲線如圖2，標準曲線的線性方程為y=l.21e+007x-l.05e+006 (R2=0.9952)，表明本方法線性良好。
[0029]3.2精密度試驗
多糖肽對照品的精密度試驗色譜圖如圖3。結果表明，峰面積的相對標準偏差(RSD)為2.7%。保留時間的標準偏差(RSD)為0.1%，表明儀器精密度良好。
[0030]3.3重現性試驗
靈芝樣品重現性試驗的重疊色譜圖如圖4。結果表明，峰面積的相對標準偏差(RSD)為
1.5%，保留時間的標準偏差(RSD)為0.1%，表明本發明方法的重現性良好。
[0031]3.4穩定性試驗
靈芝樣品穩定性試驗的重疊色譜圖如圖5。結果表明，樣品溶液在8小時內保留時間和峰面積無明顯的變化，樣品保留時間和峰面積的RSD分別為0.3%和3.4%，表明樣品溶液在8小時內穩定性良好。
[0032]3.5回收試驗
加樣回收試驗的重疊色譜圖如圖6，測定結果見表1。結果表明，本發明方法準確度較好，數據可信度高。
[0033]表1加標回收試驗結果
【權利要求】
1.一種快速測定靈芝產品中多糖肽的方法，其特徵在於:採用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器對靈芝產品中多糖肽的含量進行快速檢測。
2.根據權利要求1所述的快速測定靈芝產品中多糖肽的方法，其特徵在於:具體檢測方法如下: 1)高效液相色譜條件:液相條件:了31(4000?1色譜柱7.8mmX30 cm;流動相為甲醇:水=20:80 ;流速為I mL/min ;柱溫為35°C ;進樣量為10 μ L ; 2)蒸發光散射檢測器檢測條件:漂移管溫度為55°C;噴霧器為加熱模式；氣體壓力為45 psi ； 3)標準曲線繪製:精密稱取乾燥的多糖肽對照品0.0500 g於10 mL容量瓶中，用水溶解並定容，得濃度為5.00 mg/mL的多糖肽對照品儲備液；臨用前，分別取100 μ L、200 μ L、300 μ L,400 μ L,500 μ L於5 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得濃度分別為100.0,200.0、300.0,400.0,500.0 μ g/mL工作液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到濃度_峰面積標準曲線； 4)樣品處理:稱取靈芝產品1-2g，加水40 mL後於60°C水浴提取30 min，冷卻，定容至50 mL ;過濾,棄除初濾液,取濾液2 mL,加6 mL無水乙醇於10000 rpm離心15 min,沉澱用流動相溶解，通過0.22 μ m有機濾膜後得樣品溶液，備用； 5)樣品含量測定:吸取樣品溶液進行測定後，根據濃度-峰面積標準曲線得出的線性方程，將多糖肽的峰面積換算為樣品中多糖肽的濃度，從而計算出樣品中的多糖肽含量。
3.根據權利要求1所述的測定靈芝產品中多糖肽的方法，其特徵在於:所述靈芝產品包括靈芝原料藥和靈芝保健品。
【文檔編號】G01N30/02GK103884789SQ201410105731
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】林冬梅, 黃宏南, 王賽貞, 羅虹建, 林佔熺, 林樹錢 申請人:福建農林大學