鑑定轉基因玉米中植酸酶基因表達框構建的pcr方法

2023-04-25 10:19:26

專利名稱：鑑定轉基因玉米中植酸酶基因表達框構建的pcr方法
技術領域：
本發明涉及轉基因植物檢測領域，特別是涉及鑑定轉基因玉米中植酸酶基因表達框構建的PCR方法。 自從1996年轉基因作物大規模商業化種植以來，全球轉基因作物的種植面積迅猛增加。2009年全球種植轉基因作物種植的國家達到25個，種植面積總計達1. 34億公頃，是1996年種植面積的79倍。其中轉基因玉米全球種植面積達4100萬公頃，佔玉米種植面禾只的26% (James， Clive. 2009. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2009.ISAAA BriefNo. 41. ISAAA :Ithaca， NY.)。 我國於2009年8月批准了轉植酸酶基因玉米的生物安全證書(http:〃www. stee.agri. gov. cn/biosafety/spxx/P020091127591594596689. pdf)，同時我國還批准國外9個轉基因玉米品禾中進口用作力口工原料(http://www. stee. agri. gov. cn/biosafety/spxx/t20091022_819214. htm)。獲得生物安全證書的轉植酸酶基因玉米是由我國自主研發的，將黑麴黴中的植酸酶基因通過基因槍的方法轉入到玉米中，經過多代篩選培育而成的(Rumei
Chen， Guangxing Xue， et al. Transgenic maize plantsexpressing a fungal phytase
gene. Transgenic Res. 2008， 17 :633-643.)。轉入植酸酶可以降解玉米中大量含有的植酸磷，釋放可被動物利用的無機磷，減少飼料中磷酸氫鈣的添加量，降低飼養成本，減少動物糞、尿中磷的排洩，減輕環境汙染，具有很廣闊的應用前景。 目前我國已經研究和制定了多個轉基因玉米的檢測方法，並頒布為國家標準(如農業部869號公告-3-2007轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Btll及其衍生品種定性PCR方法)，但轉植酸酶基因玉米的特異性檢測方法尚未見報導。儘管Chen
等(Rumei Chen，Guangxing Xue，et al. Transgenic maize plants expressing a fungal
phytase gene. Transgenic Res. 2008， 17 :633-643.)報導了轉植酸酶基因玉米採用的啟動子、終止子和目的基因的名稱，但並沒有提供確切的可以直接查詢到的序列信息，也未提供啟動子、目的基因基因和終止子之間的具體連接方式。對轉基因檢測來說，這些詳細的信息對轉基因材料的身份確認是必不可少的。 PCR技術是轉基因作物檢測中應用最為廣泛的技術。在應用這種技術進行轉基因作物定性檢測時，根據其擴增的靶標區域和特異性將其分為四類一、篩選檢測，以轉基因通用的外源啟動子和終止子為靶標區域；二、基因特異性檢測，以特異的外源目的基因為靶標區域；三、構建特異性檢測，以轉基因元件之間的特異構建為靶標區域；四、轉化事件特異性檢測，以轉化事件特異性片段(外源插入片段與受體基因組連接區域)為靶標區域。這四類檢測方法對轉基因作物的品系檢測特異性是逐漸增加的。構建特異性檢測的特異性比篩選檢測和基因特異性檢測高，可以區分相同基因與不同啟動子和終止子構建方式，可以作為同一載體轉化的不同轉基因品系的通用檢測方法。
背景技術：

發明內容
針對上述領域中的空白，通過從轉植酸酶基因玉米中分離獲得的植酸酶基因表達
框序列，提出了鑑定植酸酶基因表達框構建的PCR方法，該PCR方法能利用普通的PCR儀
器、試劑快速準確鑑別出轉特定植酸酶基因表達框的轉基因玉米品系。 鑑定轉基因玉米中植酸酶基因表達框構建的PCR方法，其步驟如下 (1)採用引物對A/B和C/D分別對待測品種的基因組進行PCR擴增； (2)凝膠電泳檢測兩對引物的PCR擴增產物，都出現目標長度的檢測帶的品種為
轉有Seq IDNo. 1所示核苷酸序列的構建載體的轉基因品種， 引物對A/B的正向引物A根據Seq ID No. 1所示核苷酸序列l_649bp位置設計，
反向引物B根據Seq ID No. 1所示核苷酸序列650-2134bp位置設計； 引物對C/D的正向引物C根據Seq ID No. 1所示核苷酸序列650_2134bp位置設
計，反向引物D根據Seq ID No. 1所示核苷酸序列2135_2814bp位置設計。所述正向引物A為Phy-1F : 5 ' -CACCATCAGCAATGCACACC-3'，所述反向引物為BPhy-lR :5 '-CCGTATCGCAAGTGGACTGA-3'，擴增的片段為長度為
257bp。所述正向引物C為Phy-2F : 5 ' -CGTGTCTTGGTTAATGATCG-3'，所述反向引物D為Phy-2R : 5 ' -GGCAAATCACTCGGTGTATC-3'，擴增片段長度為
296bp。 本發明提供的檢測轉基因品種的方法，是在構建特異性的水平上檢測待測品種是否是具有特定載體的轉基因品種。本發明根據Chen等(R咖ei Chen， Guangxing Xue，et al. TrMisgenicnmize plants expressing a fungal phytase gene. TransgenicRes. 2008， 17 :633-643)關於轉基因植酸酶玉米轉化載體的構建信息得知植酸酶基因構建在一個玉米種子特異性啟動子(LEGlpromoter)和玉米種子特異性終止子(LEGlterminator)之間，但該文獻中沒有提供具體的序列信息。；在NCBI資料庫(http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)中檢索到植酸酶基因序列(登錄號AF537344);採用美國專利文獻(US patentNo. 7，211，712)中使用的啟動子和終止子序列與AF537344的序列來設計引物獲得轉化載體的首尾序列，通過序列電子拼接獲得構建載體的全長序列，根據全長序列設計兩對特異性引物，一對引物擴增構建載體的啟動子與植酸酶結合區域，另一對引物擴增植酸酶與終止子的結合區域，同時檢測出目標條帶的品種為具有Seq IDNo. l所示核苷酸序列的構建載體的轉基因品種。 本發明進一步提供了最優選的引物序列，用於PCR擴增，可作為鑑別具有Seq IDNo. 1所示的植酸酶基因表達框的品種的有效手段，具有快速、靈敏度高、特異性好、所需實驗條件不高等優點和實用價值。


圖1植酸酶基因表達框啟動子端片段擴增檢測電泳圖 其中M :Marker DL2000 ;1，2 :轉植酸酶基因玉米;3， 4 :空白對照 圖2植酸酶基因表達框終止子端片段擴增檢測電泳圖 其中M :Marker DL2000 ;1，2 :轉植酸酶基因玉米;3 :空白對照
4
圖3本發明的PCR方法(引物對Phy-1F/Phy-1R)鑑定植酸酶基因表達框 其中M :Marker DL2000 ;1，2 :轉植酸酶基因玉米；3-8 :6個玉米市場樣品；9， 10 :
空白對照 圖4本發明的PCR方法(引物對Phy-2F/Phy-2R)鑑定植酸酶基因表達框 其中M :Marker DL2000 ;1， 2 :轉植酸酶基因玉米；3_8 :6個玉米市場樣品；9 :空白
對照
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等的分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑製造廠商所建議的條件。
實施例1 轉基因玉米中的植酸酶基因表達框序列的克隆
1實驗材料
1. 1植物材料轉植酸酶基因玉米BVLA430101，(審批編號農基安證字(2009)第074號，中國農
業科學院生物技術研究所研發)，本實驗室有保存，可向公眾發放用於實驗研究。
1. 2酶與試劑 分子生物學試劑，如dNTPs、 Taq DNA聚合酶、DL2000Marker、 A/HindIII Marker等購自大連寶生物工程有限公司。 其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。 1. 3實驗儀器 PCR擴增儀Mastercycle gradient (Eppendorf co.) 核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠) DNA測序儀(A卯lied Biosystem377型全自動螢光序列分析儀) DNA電泳分析系統Kodak EDAS 290 (Kodak co.) 其它儀器包括離心機，恆溫加熱板，電子天平，培養箱等。 2實驗方法和過程 2. 1玉米基因組DNA提取與檢測 2. 1. 1玉米基因組DNA提取 取子葉期的幼嫩玉米葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊，進行玉米材料總DNA的提取。
2丄4DNA檢測 取5iU提取的DNA溶液，以O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質量。採用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。
2. 2植酸酶基因表達框啟動子端序列和終止子端序列的獲得 木艮據Chen等(Rumei Chen， Guangxing Xue， et al. Transgenic maize plantsexpressing a f皿galphytase gene. Transgenic Res. 2008， 17 :633-643)關於轉基因植酸 酶玉米轉化載體的構建信息，植酸酶基因構建在一個玉米種子特異性(LEGlpromoter)和 玉米種子特異性終止子(LEGlterminator)之間，但文獻中沒有提供具體的序列信息。根據 文獻中的信息，在NCBI資料庫(http:〃WWW.ncbi.nlm.nih. gov/)中檢索到植酸酶基因序 列(登錄號AF537344);經過對大量用於玉米的啟動子及終止子序列進行篩選，最終發現 根據美國專利(US patent No. 7， 211， 712)中公開的啟動子序列(Seq ID No. 2)和終止子 序列(Seq ID No. 3)設計的引物能夠與植酸酶基因序列(登錄號AF537344)的引物擴增 出特異條帶。 在Seq ID No. 2所示的序列中中設計正向引物pLEG-pl，在植酸酶基因 (AF537344)中設計反向引物Phy-R，見表1，引物組合擴增轉植酸酶基因玉米BVLA430101基 因組中的植酸酶基因表達框啟動子端序列。 在植酸酶基因(AF537344)中設計正向引物Phy-F，在Seq ID No. 3所示的序列中 設計反向引物tLEG-p2，序列見表l，引物組合擴增轉植酸酶基因玉米BVLA430101基因組中 的植酸酶基因表達框終止子端序列。 反應體系0. 25ii L rTaq(5U/ii L) ，5ii L 10 XPCR Buffer (Mg2+Plus) ， 4 ii L dNTP (各2. 5mM)，引物各2 y L (10 y M)，模板各2 y L (20ng/ y L)，加滅菌蒸餾水補足體積至 50ii L。 擴增程序94。C預變性4min ;94。C變性30sec， 55。C退火30sec， 72。C延伸2min， 35 個循環；72°C 10min。 表1用於植酸酶基因表達框PCR擴增的引物
引物序列
pLEG-pl5 '-GAACCGAGCGATCTCACGAG-3'
Phy-F5 '-GATGACCTGACTCCCTTTGG-3'
Phy-R5 '-GCTCAGACTGGCATTGCATC-3，
tLEG-p25 '-CTTCTGACATTGGCGTCAGG-3' 2. 3序列測定和分析 PCR擴增產物在0. 8 %的瓊脂糖膠上進行電泳，採用QIAquick Gel Extraction kit回收擴增片段，連接到pGEM-T easy (Promega， Madison， Wis.)，採用ABI PRISM 1300Genetic Analyzer進行序列測定。採用軟體vector NTI10. 3 (Invitrogen)對測定的 序列進行拼接和分析。
3實驗結果 3. 1轉基因玉米中植酸酶基因表達框的序列 採用兩對引物組合分別擴增轉植酸酶基因玉米BVLA430101，獲得了轉基因玉米植 酸酶基因表達框啟動子端和終止子端序列長度分別為1982bp和1709bp，見圖1和圖2。經拼接獲得了轉基因玉米植酸酶基因表達框的序列，其長度為2814bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。 3. 2轉基因玉米植酸酶基因表達框序列的分析通過序列分析得出，該序列的l-649bp位置為LEG promoter區域；650-784bp位置 為信號肽序列，785-2134bp為植酸酶基因序列，2135_2814bp為LEG terminator區域。序 列在NCBI檢索，未檢索到相似的閱讀框構建。
實施例2 本發明的PCR方法應用於鑑定玉米樣品中的植酸酶基因表達框
1實驗材料
1. 1植物材料 轉植酸酶基因玉米BVLA430101，(審批編號農基安證字(2009)第074號，中國農
業科學院生物技術研究所研發)，本實驗室有保存，可向公眾發放用於實驗研究。 6個玉米種子樣品(市場購買) 1. 2酶與試劑 見實施例1中1. 2酶與試劑。 1. 3實驗儀器 見實施例1中1. 3實驗儀器。 2實驗方法和過程 2. 1玉米基因組DNA提取與檢測 見實施例1中2. 1玉米基因組DNA提取與檢測。 2.2玉米樣品中的植酸酶基因表達框鑑定 根據測定的植酸酶基因表達框序列，在啟動子上和植酸酶基因上分別設計引物
Phy-1F和Phy-1R，擴增啟動子_植酸酶基因連接區域，建立植酸酶基因表達框構建特異性
檢測PCR。引物Phy-1F和Phy-1R序列見表2，預期擴增片段大小為257bp。 在植酸酶基因和終止子上分別設計引物Phy-2F和Phy-2R，擴增植酸酶基因-終止
子連接區域，建立植酸酶基因表達框構建特異性檢測PCR。引物Phy-2F和Phy-2R序列見表
2，預期擴增片段大小為296bp。 PCR反應體系為0. 25 ii L rTaq (5U/ ii L) ， 5 ii L 10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) ， 4 ii L dNTP (各2. 5mM)，引物各2 y L (10 y M)，模板各2 y L (20ng/ y L)，加滅菌蒸餾水補足體積至 50ii L。 擴增程序為94 。C預變性4min ;94 。C變性30sec， 52 。C退火30sec， 72 。C延伸 30sec，35個循環；72°C 10min。擴增結果表明，轉植酸酶基因玉米BVLA430101能獲得預期 的257bp和296bp片段，見圖3和圖4，而從市場購買的6個其它玉米樣品均未出現擴增片 段。 進一步分別克隆這兩個擴增片段，按實施例1中"2. 3序列測定和分析"進行測序
和分析。序列分析結果表明，擴增得到的257bp片段與SEQ ID NO. 1的574-830位完全一
致，擴增得到的296bp片段與SEQ ID N01的1997-2292位完全一致。 表明本發明的PCR方法適用於鑑別玉米樣品中的植酸酶基因表達框 表2鑑別植酸酶基因表達框的PCR引物
引物序列
Phy-1F5' -CACCATCAGCAATGCACACC-3'
Phy-IR5' -CCGTATCGCAAGTGGACTGA-3'
Phy-2F5' CGTGTCTTGGTTAATGATCG-3'
Phy-2R5' -GGCAAATCACTCGGTGTAT-3'
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權利要求
鑑定轉基因玉米中植酸酶基因表達框構建的PCR方法，其步驟如下(1)採用引物對A/B和C/D分別對待測品種的基因組進行PCR擴增；(2)凝膠電泳檢測兩對引物的PCR擴增產物，都出現目標長度的檢測帶的品種為轉有Seq IDNo.1所示核苷酸序列的構建載體的轉基因品種，引物對A/B的正向引物A根據Seq ID No.1所示核苷酸序列1-649bp位置設計，反向引物B根據Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設計；引物對C/D的正向引物C根據Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設計，反向引物D根據Seq ID No.1所示核苷酸序列2135-2814bp位置設計。
2. 根據權利要求1所述的PCR方法，所述正向引物A為Phy-1F : 5 ' -CACCATCAGCAATGCACACC-3'，所述反向引物為BPhy-1R : 5 ' -CCGTATCGCAAGTGGACTGA-3'，擴增的片段為長度為 257bp。
3. 根據權利要求1或2所述的PCR方法， 所述正向引物C為Phy-2F :5 '-CGTGTCTTGGTTAATGATCG-3'，所述反向引物D為Phy-2R :5 '-GGCAAATCACTCGGTGTATC-3'，擴增片段長度為296bp。
全文摘要
本發明「鑑定轉基因玉米中植酸酶基因表達框構建的PCR方法」，屬於轉基因植物檢測領域。包括如下步驟(1)採用引物對Phy-1F/Phy-1R和Phy-2F/Phy-2R分別對待測品種的基因組進行PCR擴增；(2)凝膠電泳檢測兩對引物的PCR擴增產物，都出現目標長度的檢測帶的品種為轉有Seq ID No.1所示核苷酸序列的構建載體的轉基因品種；所述正向引物Phy-1F根據Seq ID No.1所示核苷酸序列1-649bp位置設計，反向引物Phy-1R根據Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設計；所述正向引物Phy-2F根據Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設計，反向引物Phy-2R根據Seq ID No.1所示核苷酸序列2135-2814bp位置設計。
文檔編號C12Q1/68GK101792811SQ20101014383
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月7日 優先權日2010年4月7日
發明者孫爻, 彭於發, 謝家建 申請人:中國農業科學院植物保護研究所