一種血小板膜糖蛋白寡肽或其修飾物/衍生物以及它們的應用的製作方法

2023-04-25 12:52:06

專利名稱：一種血小板膜糖蛋白寡肽或其修飾物/衍生物以及它們的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的合成的可穿膜寡肽，其胺基酸序列及其抑制血小板功能的能力。 本發明屬於分子生物學和血液病學。
背景技術：
血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈血栓栓塞等，是當前嚴重危害 人類健康，導致死亡率較高的原因之一，預防和治療血栓形成，已成為當前臨床上重要的防 治方法。血小板在血栓形成過程中起著十分重要的作用。在正常血液循環過程中，血小板 處於靜止狀態，而在發生血管壁損傷處，特別在血管中高切應力環境下，血小板就會通過其 表面膜糖蛋白(GP)Ib-IX複合物中的Ib受體與血漿von Willebrand因子(vWF)結合併 粘附於受損血管處暴露的內皮下組織，進而引起粘附的血小板被內皮下組織或局部形成的 凝血酶所激活，發生釋放反應和花生四烯酸代謝。由前者分泌釋放的ADP或由後者形成的 血栓烷(TX)A2均可引起血小板聚集。血小板聚集是由血小板GPIIb/IIIa受體所調解，激 活的GPIIb/IIIa受體通過纖維蛋白原分子在相鄰的血小板之間形成橫橋，構成血小板聚 集的骨架，最終導至血栓形成。血小板釋放產物TXA2等還可進一步與血漿蛋白作用促進血 栓的形成。可見，血小板膜糖蛋白GPIb與vWF的結合是血小板血栓形成的起始關鍵過程。 而GPIba的膜外部分含有vWF的結合位點，最新研究表明，細胞內信號分子14-3-3蛋白與 GPIb a C末端的結合，是調控GPIb-IX與vWF結合併進而導致血小板活化以及形成血小板血 栓的關健。 有效抑制各階段血小板的作用，是預防或治療血栓形成性疾病的一個基本思路和 有效途徑。而目前國內外臨床上常用抗血小板藥物如阿斯匹林、噻氯匹啶等都是抑制血小 板與vWF結合黏附後功能的某一環節，這些藥物，在發揮抗栓作用的同時，由於此前粘附而 活化的血小板釋放出的生物活性物質，同樣會對出、凝血的生理平衡產生消極影響，而均存 在著較大的缺點如引起血小板減少，出血以及使用後栓塞的再形成。而以調節或抑制vWF 與血小板GPIba的結合為靶標，創製一種可調節或抑制血小板的始動活化途徑，從而調節 或抑制血小板聚集的新型抗血小板藥物，必將會對血栓性疾病的治療和預防產生意想不到 的效果。 現有研究表明，在調控血小板GPIb-IX與vWF結合過程中，細胞內信號分子14-3-3 蛋白與GPIb的結合起關鍵作用。在GPIb中，已知有3個14-3-3蛋白結合位點，分別為 GPIb a 609位點，GPIb a 587-590位點和GPIb P 166位點。這些位點對GPIb與vWF結合的 作用各不相同，但這些位點都是以磷酸化Ser為中心的結構域。在此領域的多年研究之中， 本室發現在GPIba 559位點為14-3-3蛋白的又一結合位點，故此本發明在現有研究基礎 上，本室研究創建了新的可穿膜寡肽。

發明內容
本發明目的就是研究構建新的寡肽序列，併合成可穿膜寡肽，對其抑制血小板粘 附、聚集的功能進行研究驗證，最終創製一種具有自主智慧財產權，可有效抑制血栓形成，並 對出、凝血功能不產生消極影響的新型藥物。 技術方案本發明應用抗體製備技術製備血小板GPIba 559Ser磷酸化抗體， ELESA檢測所製備抗體與血小板結合情況，從而設計合成新的可穿膜寡肽，瑞斯託黴素和 ADP誘導血小板聚集試驗對可穿膜寡肽功能進行研究。結果表明可穿膜寡肽可降低瑞斯託 黴素誘導的血小板聚集，而對ADP誘導的血小板聚集沒有影響。
本發明的優點在於 1.可穿膜寡肽只對血小板GPIba與vWF的結合功能有抑制作用，即對血栓形成的 起始有抑制作用，而對其他凝血功能無影響。 2.不同濃度的可穿膜寡肽，對瑞斯託黴素誘導的血小板聚集作用的抑制程度不 同，即對瑞斯託黴素誘導的血小板聚集作用具有調節功能，具有良好的藥物開發潛力。
3.可穿膜寡肽分子量較小，對人體免疫原性低，可直接用於人體。 4.可穿膜寡肽分子結構穩定，易於合成與純化，可大量生產，具有廣闊的產業化前
旦 豕。 而現有國內外臨床上使用的抗血小板藥物都是抑制血小板黏附後功能的一個環 節，其防栓作用相對較弱，且對出、凝血生理平衡產生消極影響，並受適用範圍、生產工藝、 智慧財產權等等諸多因素的限制。


圖1顯示製備抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體的免疫原即所合成的小分子寡 肽的胺基酸序列。 圖2顯示所製備的抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體的特異性及效價。 圖3顯示所製備的抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體檢測血小板GPIb a ELISA結果。 圖4顯示本發明構建的可穿膜寡肽的胺基酸序列。 圖5顯示可穿膜寡肽降低瑞斯託黴素誘導的血小板聚集功能。A為陰性對照，B為
可穿膜寡肽(100 i！ M)抑制瑞斯託黴素誘導血小板聚集功能，C， D為對照寡肽。 圖6顯示不同濃度可穿膜寡肽對瑞斯託黴素誘導的血小板聚集功能的影響。A為
陰性對照，B， C， D， E分別為不同濃度可穿膜寡肽(25 ii M， 50 ii M， 100 y M， 200 y M)抑制瑞斯
託黴素誘導血小板聚集功能。 圖7顯示在添加GP II b/IIIa拮抗劑RGDS的條件下可穿膜寡肽對瑞斯託黴素誘 導的血小板聚集功能的影響。A為陰性對照，B為陰性對照添加RGDS後瑞斯託黴素誘導的 血小板聚集功能，C為可穿膜寡肽(100i!M)抑制瑞斯託黴素誘導血小板聚集功能，D為可穿 膜寡肽(lOOi!M)添加RGDS後抑制瑞斯託黴素誘導血小板聚集功能。 圖8顯示可穿膜寡肽對ADP誘導的血小板聚集功能無影響。A為陰性對照，B為可 穿膜寡肽，C，D為對照寡肽。 圖9顯示可穿膜寡肽對流動腔裝置中血小板在vWF表面黏附功能的影響。
具體實施例方式
以下藉助非限制性實施例舉例詳細描述本發明。 實施例1 :抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體的製備，鑑定及對血小板GPIb a的 檢測。 1.材料與試劑合成寡肽，紐西蘭大白兔，福氏佐劑、MBS、KLH均購自Sigma公司。 羊抗兔IgG-HRP購自中山公司。ECL反應試劑購自普利萊公司，其餘均為國產分析純試劑。
2.方法 (1)血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體製備試驗合成寡肽通過MBS與KLH交聯， 作為免疫抗原，與福氏佐劑充分混勻乳化後，進行背部多點皮下免疫，三次免疫後，收集分 離免疫血清。合成寡肽序列如圖l所示。 (2)血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體效價及特異性檢測ELISA試驗合成寡肽 以10ug/ml濃度包被ELISA檢測板，每孔100 yl， 4。C孵育過夜後，每孔200 1%明膠封 閉，37t:孵育l小時，PBS洗滌3次。每孔加入100iU按四倍梯度稀釋的抗血清(對照為
免疫前兔血清)，37t:孵育i小時，洗滌3次後每孔加入ioOiU i : ioooo稀釋的羊抗兔
IgG-HRP， 37t:孵育1小時，洗滌3次後進行OPD顯色，室溫避光孵育10min， 50 yl 3M硫酸 中止反應後，測定樣品在A492的吸光值。由圖2可見，所製備抗體特異識別抗原，且抗體效 價較高。 (3)血小板GPIb a 559Ser磷酸化ELISA檢測試驗:同(2)方法，將血小板GPIb a
以1 P g/ml的濃度包被ELISA檢測板，檢測結果由圖3可見，血小板GPIb a與所製備抗體
特異結合，表明血小板GPIb a 559Ser存在磷酸化狀態。 實施例2 :可穿膜寡肽對血小板粘附、聚集功能影響的研究 1.材料與試劑 可穿膜寡肽(序列如圖4所示)，瑞斯託黴素、ADP、RGDS為Sigma產品；其餘均為
國產分析純試劑。
2.方法 (1)可穿膜寡肽抑制瑞斯託黴素誘導血小板聚集試驗健康人全血枸櫞酸鹽抗 凝，分離富含血小板血漿(PRP)，調整血小板濃度為3X 108/ml，取3 i！ 1可穿膜寡肽加入 300 iil PRP中，同時取3 iil寡肽溶劑匿SO作為對照(另兩種合成的寡肽同為對照)，22°C 孵育5分鐘後，37。C孵育5分鐘，加入瑞斯託黴素(終濃度為1.25mg/ml)誘導血小板聚集。 血小板聚集儀檢測聚集結果。結果表明，可穿膜寡肽可有效抑制瑞斯託黴素誘導血小板聚 集(見圖5)。 (2)不同濃度可穿膜寡肽抑制瑞斯託黴素誘導血小板聚集試驗同(1)方法，加入 不同濃度的可穿膜寡肽，檢測瑞斯託黴素誘導血小板聚集結果。由圖6可見，不同濃度可穿 膜寡肽對瑞斯託黴素誘導血小板聚集抑制程度不同。 (3)添加RGDS的條件下可穿膜寡肽對瑞斯託黴素誘導血小板聚集試驗同(1)方 法，加入RGDS和可穿膜寡肽後，檢測檢測瑞斯託黴素誘導血小板聚集結果。由圖7可見，在 RGDS拮抗GP Ilb/IIIa條件下，可穿膜寡肽對瑞斯託黴素誘導血小板聚集有抑制作用。
(4)可穿膜寡肽對ADP誘導血小板聚集試驗作用同(1)方法，加入ADP(終濃度
5為2yM)誘導血小板聚集，檢測聚集結果。由圖8可見，可穿膜寡肽對ADP誘導血小板聚集 無抑制作用。 實施例3 :可穿膜寡肽降低流動腔裝置中血小板與vWF包被表面的黏附。
1.材料與試劑 可穿膜寡肽，vWF(本室自備)，新鮮健康人全血。
2.方法 vWF(濃度為30 ii g/ml)包被玻璃細管(GC120-7. 5， Harvard Apparatus Inc.)， 溼盒中4t:孵育過夜，PBS衝洗3次之後5% BSA(PBS)室溫封閉2小時，PBS衝洗3次備 用。健康人全血ACD(2.5X檸檬酸三鈉，2.0X D-葡萄糖，1.5X檸檬酸)抗凝，分離富含血 小板血漿(PRP)。使用血小板洗滌液CGS(O. 12M NaCl，O. 0129M檸檬酸三鈉，0. 03M D-葡萄 糖，O. 1X牛血清白蛋，pH 6.5)洗滌後，Modified Tyrode' s Buffer(2.5mM H印ese， 150mM NaCl，2.5mM KC1， 12mMNaHC03， 5. 5mM D-葡萄糖，lmM CaC12， lmM MgC12， lmg/ml BSA， pH 7. 4)調整血小板濃度為3X 108/ml。在剪切率為250s—1條件下血小板流經玻璃細管，之後 相同剪切率條件PBS衝洗玻璃細管5分鐘，記錄黏附在vWF包被的玻璃細管表面的血小板 數目。由圖9可見，可穿膜寡肽對流動腔裝置中血小板與vWF包被表面的黏附有降低作用。SEQUENCE LISTING〈110〉北京航空航天大學〈120〉 一種血小板膜糖蛋白寡肽或其修飾物/衍生物以及它們的應用〈160>1〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>5〈212>PRT〈213>Artifical sequence〈220〉〈221>M0D_RES〈222〉 (3) (3)〈223〉PH0SPH0RYLATI0N〈400>1Arg Gly Ser Leu Pro1 權利要求
一種可穿膜寡肽，其特徵在於該寡肽的胺基酸序列為RGS(p)LP，其中(p)是指絲氨酸(S)磷酸化。
2. —種如權利要求1所述的寡肽的修飾物，其特徵在於，所述寡肽的修飾物是對寡肽 RGS(p)LP的N端進行修飾後得到的產物，所述修飾包括化學修飾和具有膜穿透作用的多肽 修飾。
3. 如權利要求2所述的寡肽的修飾物，其特徵在於，所述化學修飾為十四烷醯化修飾 和十六烷醯化修飾。
4. 如權利要求3所述的寡肽的修飾物，其特徵在於，所述化學修飾為十四烷醯化修飾。
5. 如權利要求2所述的寡肽的修飾物，其特徵在於，所述多肽修飾為HIV-TAT修飾。
6. —種如權利要求l所述的寡肽的衍生物。
7. 如權利要求1 6中任一項所述的寡肽或其修飾物/衍生物的應用，其特徵在於， 用於選擇性地阻斷血小板膜糖蛋白Ibalpha與ABP的結合併影響其所對應的膜糖蛋白 Ibalpha受體功能。
8. 如權利要求7所述的應用，其特徵在於，用於製備預防和/或治療與血小板膜糖蛋白 Ibalpha與ABP的結合所對應的膜糖蛋白Ibalpha受體活性相關的疾病的藥物。
9. 如權利要求8所述的應用，其特徵在於，用於與血小板膜糖蛋白Ibalpha與ABP的結 合所對應的膜糖蛋白Ibalpha受體活性相關的疾病包括動脈血栓性疾病。
10. 如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述動脈血栓性疾病包括心肌梗塞和腦梗塞。
全文摘要
本發明提供了一種能夠影響血小板功能的寡肽R-G-S(p)-L-P或其修飾物/衍生物，以及該寡肽R-G-S(p)-L-P或其修飾物/衍生物在預防和/或治療動脈血栓性疾病和/或其它與血小板GPIbalpha與ABP相互作用相關疾病方面的應用。以寡肽R-G-S(p)-L-P或其修飾物/衍生物處理後的血小板，可有效抑制血小板的粘附功能，包括抑制瑞斯託黴素誘導的血小板聚集功能，而不影響血小板聚集功能，包括ADP誘導血小板聚集功能等，因而能抑制血栓形成並能基本維持血小板功能狀態的完整性。可直接用於臨床抗血栓藥物的研發。
文檔編號A61P7/02GK101735307SQ200810226840
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月18日 優先權日2008年11月18日
發明者戴克勝 申請人:北京航空航天大學