一種多粘類芽孢桿菌及其菌劑和製備與應用的製作方法
2023-05-11 02:01:36
本發明涉及一種多粘類芽孢桿菌，具體涉及一種多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)以及利用該多粘類芽孢桿菌生產的微生物菌劑，以及所述多粘類芽孢桿菌與菌劑在防治農作物枯萎病和/或植物促生領域中的應用。
背景技術：
：農作物枯萎病是一種世界性土傳病害，主要由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)侵染引起。其中，以蔬菜瓜類枯萎病危害最為嚴重，且一旦發病，難以根除，隨著連作年份增加，枯萎病日趨嚴重。近年來，隨著我國設施農業的發展，設施蔬菜瓜類作物面積不斷增加，加之常年連作，土壤中病原菌積累量不斷增加，蔬菜瓜類枯萎病發生越來越普遍，危害越來越重。一般病株率10％～20％，嚴重地塊達50％～80％，甚至可造成絕產，已成為阻礙我國蔬菜瓜類生產發展的重要因素。目前，蔬菜瓜類枯萎病的防治措施主要是抗病品種的選育和化學防治。抗病品種選育和利用是農作物枯萎病防治最經濟有效的防治措施，但由於抗病品種選育周期長，且枯萎病病原的轉化型類型眾多、生理小種分化頻繁，生產上至今尚無高效穩定的抗病品種大面積推廣；化學防治是目前生產上最常用的防治手段，但是由於化學防治容易產生環境汙染、「3R」和「3致」等生產和食品安全問題，因此其應用在蔬菜瓜果生產上受到一定的限制。生物防治因其環境兼容性良好、防治效果良好已成為枯萎病防治的有效途徑，但是，目前有關生物防治的相關產品和技術在實際生產中的應用尚不成熟。苦瓜是重要的保健蔬菜之一，在我國廣泛種植，具有較高的經濟效益，一般畝收益可達6000～8000元，最高可達萬元以上。但是隨著種植面積的不斷增大，且普遍存在重茬連作現象，苦瓜枯萎病菌數量逐年積累，苦瓜枯萎病害發生和危害日趨嚴重，加之，由於化肥農藥的不合理施用，導致土壤微生態環境惡化、土壤中碳/氮比失調，農藥化肥殘留、病蟲抗藥性等一系列困擾苦瓜生產的問題，嚴重影響了苦瓜種植的經濟效益和社會效益。苦瓜枯萎病是典型的植物土傳病害，土壤微生態環境和氣候條件是影響苦瓜正常生長和枯萎病發生的重要生態因子，適宜的土壤微生態環境和氣候條件也是苦瓜優質高產和彰顯質量風格特色的決定性因素。但氣候條件具有不確定性和不可控性，生產中只有適應性利用之，因此，對土壤微生態的調節和利用便成為苦瓜枯萎病防控的重要策略，尤其在缺乏穩定的高抗品種的苦瓜生產中，可通過調節土壤微生態功能來保障苦瓜的健康生長和有效控制枯萎病的發生為害。研發以作物健康生長為中心、以土壤微生態調控為基礎、以抗耐病品種選育為保障的可有效防控連作地苦瓜枯萎病危害的綜合治理關鍵技術，並大面積推廣應用，可真正實現化肥農藥減量使用的現代農業發展要求，對提高苦瓜產量、保障苦瓜質量和維持苦瓜種植業的可持續發展具有重要意義。技術實現要素：本發明所解決的現有技術的問題是：現有的生防菌株活性不高，防治效果不穩定，而且由於土壤肥力條件、營養元素和有機質含量的不斷變化，需要新的適應性更強的微生物菌株。具體而言，本發明提供了如下技術方案：一方面，本發明提供了一種多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11，保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNO.5214。第二方面，本發明還提供了一種微生物菌劑，其利用含有以上所述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11生產得到，其活性成分為以上所述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11。優選的，所述的微生物菌劑還包括硅藻土、SDS和木質素磺酸鈉。優選的，以重量百分比計，所述微生物菌劑包括所述硅藻土10-12％、SDS1.2-2.4％、木質素磺酸鈉2-4％以及多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-1184.6-87.8％。第三方面，本發明還提供了以上所述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11或以上所述微生物菌劑在防治作物枯萎病和/或植物促生領域中的應用。優選的，所述作物優選為苦瓜。優選的，所述多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11或所述微生物菌劑中的活性成分DP-11為200億-400億CFU/g。第四方面，本發明還提供了一種防治作物枯萎病的方法，將以上所述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11或以上任一項所述的微生物菌劑加入到土壤中。第五方面，本發明還提供了以上任一項所述的微生物菌劑的製備方法，其通過包括如下步驟的製備方法得到：(1)一級種子培養：將以上所述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11接種於培養基中培養，得到一級種子液；(2)二級種子培養：將步驟(1)得到的一級種子液按照3％-5％體積比的接種量接入肉湯培養基中培養，得到二級種子液；(3)發酵培養：將步驟(2)得到的二級種子液按照5％-20％體積比的接種量接種於固體發酵培養基中培養。優選的，步驟(1)中一級種子培養的溫度為30-35℃，培養時間為20-30h。優選的，步驟(2)二級培養的溫度為30-35℃，培養時間為2-4d。優選的，步驟(3)中培養時間為72-144h，固體發酵培養基以重量份計包括：甜高粱秸稈粉15-25份，麩皮20-30份，米糠5-15份，豆粕粉15-25份，澱粉10-20份，麥飯石3-8份，酵母粉0.5-2份，碳酸鈣2-4份，硫酸鎂0.3-0.8份，磷酸二氫鉀0.5-2份，硫酸錳0.3-0.8份。本發明中提供的多粘類芽孢桿菌為PaenibacilluspolymyxaDP-11，是從中國河南省信陽市雞公山金鑲玉竹(Phyllostachysheteroclada)的根際土壤中分離出來的，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101，保藏編號為CGMCCNo.5214，保藏日期為2011年09月05日。本發明所取得的有益效果是：利用本發明提供的菌株和微生物菌劑，可以顯著增強農作物對於枯萎病的抗病性，提高農作物品質，特別是改善苦瓜對於枯萎病的抗病性，增產效果明顯，增產幅度為11.11％-17.59％。下面結合各個具體實施方式，對本發明及其有益技術效果進行詳細說明。具體實施方式如上所述，本發明提供了一種多粘類芽孢桿菌及其菌劑和製備與應用。其中，本發明所用到的培養基的配方如下：營養瓊脂(NA)：胰蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水1L，瓊脂15g，25℃，pH7.2～7.5。營養肉湯(NB)：胰蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水1L，25℃，pH7.2～7.5。固體發酵培養基：以重量份計，甜高粱秸稈粉20份，麩皮25份，米糠10份，豆粕粉20份，澱粉15份，麥飯石5份，酵母粉1份，碳酸鈣3份，硫酸鎂0.5份，磷酸二氫鉀1份，硫酸錳0.份；料水比1:1.1(W/V，g/L)，pH9.0～10.0，0.15MPa高壓滅菌60min後備用。其中，本發明所用到的原料和儀器均為本領域常用的原料和儀器。甜高粱秸稈粉、麩皮、米糠、豆粕粉等均購自於市場。具體來說，實施例中所用到的原料和試劑的型號和廠家見表1。表1本發明所用原料和儀器及廠家實施例一本發明提供的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11為革蘭氏陽性菌，杆狀，內生孢子生成細菌，菌株的最佳生長條件為30-32℃，pH值為7.2，並通過形態學分類法和16SrRNA基因序列分析以及生物學微生物自動分析系統鑑定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。該菌株的16SrRNA序列已提交GenBank資料庫，登錄號為NJ570759。通過以上鑑定結果，確認菌株DP-11為多粘類芽孢桿菌菌株，將其命名為多粘類芽孢桿菌菌株DP-11(PaenibacilluspolymyxaDP-11)，保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心。實施例二利用上述PaenibacilluspolymyxaDP-11生產微生物菌劑(一)種子發酵液的製備將斜面保存的PaenibacilluspolymyxaDP-11菌株接入NA液體培養基中，於30℃、170r/min下振蕩培養24h，製成一級種子液。然後以3％體積比的接種量將一級種子液接種至NB培養基中於30℃、170r/min條件下振蕩培養3d製作二級種子液。其中，二級種子液中有效活菌的含量測定採用稀釋平板法，計算公式如下：活菌含量(cfu/mL)＝每個平板菌落數×稀釋倍數稀釋/塗布的菌液體積(mL)根據公式測得DP-11的二級種子液有效活菌含量均達到108cfu/ml以上才能作為固體發酵的接種劑。(二)固體發酵將液體二級種子分別以5％、10％、15％和20％(V/V)的接種量接種於固體發酵培養基中充分混勻，以6cm的厚度平攤於滅菌的淺盤中，置於發酵架上，室溫30℃～32℃條件下發酵72h，鏡檢芽胞形成率，得到DP-11固體發酵物。其中，活性菌株DP-11的固體發酵結果如表2所示。表2結果表明，3個發酵時間的組合試驗中，菌株DP-11二級種子液接種量為15％時，其芽胞形成率均顯著高於其他接種量的組合，其中，接種量為15％，發酵時間為72h時，芽胞形成率為97.23％，顯著高於其他組合，本研究選擇接種量15％，發酵時間72h為菌株DP-11的固體發酵條件。表2不同接種量和發酵時間對DP-11固體發酵效果的影響註：同列數字後不同大寫字母表示顯著差異(p≤0.05)，其中從A到D代表的差異的顯著性依次增加。實施例三利用實施例二得到的微生物菌劑作為活性成分，同時篩選其他載體和表面活性劑，製備可溼性微生物粉體菌劑(即為可溼性菌粉)。分別以白炭黑、高嶺土、硅藻土、膨潤土、滑石粉為載體填料，以SDS、木質素磺酸鈉、吐溫60和D425為表面活性劑按照一定的比例與DP-11固體發酵物裝入混合攪拌機中，充分混合，測定溼潤時間，懸浮率和芽孢含量以及吸附容量。通過測定不同載體填料以及表面活性劑對DP-11固體發酵物的不同影響，篩選出最適宜的載體填料以及最合適的表面活性劑，然後將其按照最佳的配比，將篩選出的載體填料以及表面活性劑同DP-11固體發酵物進行混合，化驗，包裝，即為可溼性菌粉。其中，參照《中華人民共和國國家標準》對不同的製劑進行測定。潤溼時間測定參照GB/T5451-2001，懸浮率測定參照GB/T14825-2006，水分測參照GB/T1600-2001，貯存實驗參照GB/T19136-2003的方法進行。採用平板菌落計數法，測定芽孢含量。(一)填料的篩選分別選擇白炭黑、高嶺土、硅藻土、膨潤土、滑石粉等5種不同載體做填料，其中白炭黑、高嶺土、硅藻土、膨潤土、滑石粉與DP-11固體發酵物的重量比均為10％，比較不同填料對可溼性菌粉理化性質的影響。綜合考慮不同潤溼時間、吸附容量和價格等因素，確定製作可溼性菌粉的最適填料。其中，測定結果見表3。(二)表面活性劑的篩選在實施例二得到的固體發酵物中分別添加一定量的SDS、木質素磺酸鈉、吐溫60和D425等助劑製得不同的製劑。然後測定不同製劑的懸浮率，潤溼時間以及芽孢含量。其中，測定結果見表4。(三)原粉貯藏穩定性測定稱取DP-11可溼性菌粉50g，即DP-11固體發酵物同硅藻土、SDS以及木質素磺酸鈉的混合物，其中以重量百分比計算，DP-11的含量為85％，硅藻土的含量為10％、SDS的含量為2％、木質酸磺酸鈉的含量為3％，置於(4±2)℃和室溫條件下存放，每隔30d測定樣品的活菌數量，測定時長360d，明確可溼性菌粉存放360d期間活菌數量的變化。其中測定結果如下所示：(1)填料的篩選結果不同的填料對可溼性菌粉的理化性質具有一定的影響。對於固體菌粉，選擇吸附容量適宜的填料即可。表3結果表明，白炭黑吸附容量最大且流動性最大，其次為硅藻土，但是DP-11與白炭黑混合在室溫下貯藏30d後，可溼性菌粉中活菌數量明顯下降，表明白炭黑與菌株DP-11的生物相容性較差，且白炭黑價格偏高，因此本研究選擇硅藻土作為填料。表3填料對製劑性能的影響(2)表面活性劑的篩選結果由於大部分分散劑(表面活性劑)具有一定程度的潤溼作用、大部分潤溼劑具有一定程度的分散作用，因此本實驗對表面活性劑的懸浮作用和潤溼作用同時考察。結果如表4所示。以表面活性劑SDS為分散劑，製劑的懸浮率最高，達到84％，但其潤溼時間較其他材料長，為21s，以木質素磺酸鈉作潤溼劑，製劑的溼潤性能最優，但其懸浮率較SDS低，二者的芽胞含量明顯高於其他試劑，故選擇SDS與木質素磺酸鈉復配作為本研究的分散劑。表4不同表面活性劑對製劑性能的影響表面活性劑懸浮率(％)潤溼時間(s)芽胞含量(×109cfu/g)SDS84214.85木質素磺酸鈉76104.36吐溫6034173.91D42574183.14(3)DP-11可溼性菌粉貯藏穩定性測定結果表5結果表明，在室溫貯藏條件下，DP-11可溼性菌粉中的活菌數量明顯低於冷藏條件。在室溫環境下貯藏360d後，其活菌數量為原粉的59.6％，而在冷藏條件(4±2)℃下保存360d，其活菌數量為原粉的80.6％，分別下降了40.4％和19.4％。分析其原因可能是由於低溫下，菌體以芽胞的形式處於休眠狀態，生理代謝緩慢。因此，DP-11可溼性菌粉應在低溫條件下保存為宜。表5不同貯藏天數內DP-11可溼性菌粉中活菌數(4)活性菌株DP-11原粉的芽胞含量測定結果以硅藻土為載體、以SDS與木質素磺酸鈉復配為分散劑，分別混入活性菌株DP-11菌粉後，其中以重量計算，DP-11的含量為85％，硅藻土的含量為10％、SDS的含量為2％、木質酸磺酸鈉的含量為3％，，經過混合攪拌、乾燥後，獲得DP-11可溼性菌粉。檢測結果表明，DP-11接種劑中活菌含量為200億-400億cfu/g。實施例四將實施例三製備的可溼性菌粉(可溼性接種劑)與基礎肥料混合，用於驗證對於苦瓜枯萎病的防治效果。其中，可溼性菌粉以重量百分比計，包括PaenibacilluspolymyxaDP-1185％，硅藻土10％，SDS2％以及木質素磺酸鈉3％。將可溼性接種劑按照質量比為1：200的比例混入基肥中，穴施或隴施後，施少量水培土固根。其中，基肥為喜滿地牌複合肥，其添加量為50公斤/畝。可有效防治苦瓜生長早中期枯萎病的發生。其中，針對不同批次在廣西南寧的檢測結果見表6-表9。處理組和空白組分別設置三組重複組，其中，空白組不添加可溼性菌粉。表6和表7的結果為採用以上配方處理組和空白組苦瓜枯萎病的發病率的比較結果。為了防止中後期枯萎病的發生，可在苦瓜初花期，將可溼性接種劑按照質量體積比1：200的比例將接種劑溶於液體肥料中溝灌使用。其中，液體肥料採用葛林美公司的「紐翠綠」富碳腐植酸全效液體肥。以對苦瓜枯萎病菌具有拮抗活性，並具有良好促生作用的微生物菌株製成活性菌株孢子含量大於200億個/克的微生物接種劑可溼性粉劑。表8的結果為採用以上配方得到的處理組和空白組苦瓜枯萎病的發病率的比較結果，表9為通過以上不同批次和不同處理方式(即固體基肥和液體追肥)處理組和空白組苦瓜平均產量的比較結果。注意：在穴施時，穴的深度應該適當，不宜過深，以5～8cm為宜；定植時，儘量減少對定植苗根系的傷害。表6處理組和空白組苦瓜枯萎病的發病率比較(2016.4.27，廣西南寧)表7處理組和空白組苦瓜枯萎病的發病率比較(2016.5.9，廣西南寧)表8處理組和空白組苦瓜枯萎病的發病率比較(2016.5.23，廣西南寧)表9處理組和空白組苦瓜平均產量比較(2016.4.27～2016.5.23，廣西南寧)從表6-表8的結果可以看出，採用本發明的可溼性菌粉處理的苦瓜，枯萎病的發病率最高降低了18.28％，產量最高增加了17.59％。綜上所述，以生防細菌DP-11為活性菌株、硅藻土為載體、SDS與木質素磺酸鈉復配為分散劑，採用固體發酵製成活菌含量為200億cfu/g的可溼性接種劑。該接種劑可顯著增強苦瓜對枯萎病的抗病性，提高苦瓜品質，增產效果明顯，苦瓜枯萎病的平均防治效果為78.63％，增產效果為11.11％～17.59％。同時，在以上配方的基礎上，通過調整微生物菌劑各成分的重量百分比，將硅藻土在微生物菌劑中的質量分數控制在10-12％，將SDS在微生物菌劑中的質量分數控制在1.2-2.4％，將木質素磺酸鈉在微生物菌劑中的質量分數控制在2-4％以及將多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDP-11固體發酵物的質量分數控制在84.6-87.8％，可以起到同實施例四相同或相似的技術效果。本發明所提供的菌株以及微生物菌劑可以用於防治作物的枯萎病以上所述僅為本發明較佳實施例，並不用於局限本發明，凡在本發明的精神和原則之內所做的修改、等同替換和改進等，均需要包含在發明的保護範圍之內。當前第1頁1 2 3