幹細胞歸巢的快捷方法
2023-05-10 19:34:56
專利名稱：幹細胞歸巢的快捷方法
技術領域：
本發明所涉及的是一種幹細胞歸巢的快捷方法，具體說是利用磁場使幹細胞迅速準確歸巢。
背景技術：
幹細胞是指一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，在適當的誘導條件下，可分化為不同的功能細胞。隨著幹細胞生物學研究的不斷深入，以幹細胞為種子細胞的細胞治療在糖尿病、肝衰竭、心肌梗塞、早老性痴呆、帕金森病、視網膜損傷、癌症、血友病、脊髓損傷、先天性免疫性疾病等難治性、終末期疾病的治療中越來越顯示出良好的應用前景。研究中發現，哺乳動物體內多種組織(包括骨髓、臍帶血等)來源的成體幹細胞均具有「多能性」(即具有向多種組織細胞分化潛能)的特點，比如，其中的⑶34+Lin_細胞向造血系統各系細胞分化；c-Met+ β 2Μ細胞可以向成熟的肝細胞分化；間充質幹細胞可以向神經元、心肌細胞或胰島β細胞分化等等。大量的基礎研究及臨床實踐證實，幹細胞在適當的誘導條件下，在體內外均可定向分化為功能完備的肝細胞。如何選擇合適的誘導方法，促進移植幹細胞向肝臟遷移、分化，恢復肝臟解剖學結構及生理功能，一直是眾多學者努力探索的問題。一般說來，只有足夠數量的幹細胞向特定組織歸巢，才能有效分化成特定組織細胞，發揮生理功能。目前，幹細胞移植的常用方法有特定組織直接注入和外周靜脈輸注法等。前者雖然可以保證幹細胞能相對集中於特定組織中，但需通過開放性的手術實現，操作複雜，受者創傷大，併發症多；後者方法簡單，易於操作，但是由於選用的幹細胞隨血液循環流至全身各個器官，因而易於被某些富含網狀內皮系統的組織吞噬、滯留，使得定位於特定組織的幹細胞數量相對減少，嚴重影響其修復功能的發揮。而尋找一種高效、簡單的幹細胞歸巢方法具有非常重要的意義。如何誘導幹細胞歸巢、分化，已經成為當前研究的熱點。
發明內容
本發明的目的是提供一種快捷高效的幹細胞歸巢方法。本發明所提供的幹細胞歸巢方法具體步驟包括a)用粒徑為40 60nm的免疫磁珠標記幹細胞；b)將標記後的幹細胞注入特定組織的循環系統內；c)將正負兩個磁極指向所述特定組織相對應的體表部位，在所述循環系統的循環過程中，所述幹細胞迅速準確歸巢於所述特定組織內；所述正負兩個磁極間的磁場強度為8400 18600GS。其中，所述幹細胞為具有特定細胞表面標誌的、具有多向分化潛能的幹細胞，可以來源於人骨髓、流產胎兒的不同組織、胎盤、臍帶血或來自大鼠骨髓。如以大鼠骨髓c-Met+β 2M細胞為例，採用免疫磁珠標記所述幹細胞的過程如下將針對所述幹細胞表面標誌性抗原的特異性抗體與所述幹細胞孵育，經清洗後再與偶聯有抗所述特異性抗體的免疫磁珠孵育，清洗得到所述標記後的細胞。所述特異性抗體為兔抗大鼠c-Met抗體和β2Μ抗體；所述免疫磁珠偶聯有山羊抗兔IgG。
為了能提高幹細胞在特定組織中的歸巢效率，所述兩個異性磁極的材料可選用鐵氧體燒結永磁性材料，兩個異性磁極呈圓柱狀，且兩磁極靠近相對的一端直徑縮小；所述兩個異性磁極端面的距離為5 25mm。此時，在兩個磁極之間形成高強度、高梯度的磁場，磁場的高強度使免疫磁珠標記的幹細胞具有良好的歸巢能力，磁場的高梯度則使免疫磁珠標記的細胞能選擇性地滯留於特定組織而不是其他組織。本發明將直徑在35納米左右的免疫磁珠通過抗原抗體親和反應來特異性標記細胞，由於該免疫磁珠的超順磁性，使得特定細胞在磁場的作用下迅速歸巢於特定組織，而且當磁場消失後，免疫磁珠失去磁性，在特定組織內的細胞不會因為相互吸引聚集成球而導致血管阻塞。在本發明中，免疫磁珠的主要製備原料均可以被生物體吸收、排洩，對機體無毒副作用。本發明合理利用超順磁性磁珠的磁特性，採用磁場定向技術使幹細胞向特定組織歸巢，具有歸巢高效快捷等優點，有很好的臨床應用前景。
圖1為幹細胞的免疫磁珠標記；圖2為細胞在磁場中的篩分；圖3A為歸巢儀的結構；圖3B為圖3A的俯視；圖4為體外免疫磁珠標記細胞的富集操作流程圖；圖5為免疫磁珠標記的幹細胞向大鼠肝的歸巢照片。
具體實施例方式實施例1、C-Met +β 2M細胞的歸巢本實施例以肝損傷大鼠模型的肝臟作為靶組織。本實施例中所用免疫磁珠購於清華大學材料學院，該磁珠偶聯了山羊抗兔IgG，粒徑在35nm左右，具有良好的超順磁性。1、大鼠骨髓單個核細胞的獲得斷頸處死的大鼠經75%乙醇消毒後，用剖腹的方法取出股骨，以含10%胎牛血清的DMEM培養液作為衝洗液，用5ml注射器反覆衝洗骨髓腔，用100目篩網過濾衝出的細胞製成大鼠骨髓單細胞懸液，1200rpm離心後，將細胞重懸於PBS中，經Ficoll (相對密度1.083g/ml)密度梯度離心後收集大鼠骨髓單個核細胞，洗滌後重懸於PBS中。2、用兩步間接免疫磁珠分離方法富集並標記大鼠骨髓來源的c-Met+β 2M細胞如圖1所示，將步驟I所得細胞I先與兔抗大鼠β 2Μ抗體2於4°C孵育30min，經PBS緩衝液洗滌後，再將其與偶聯了山羊抗兔IgG4的免疫磁珠3於4°C孵育30min，再經PBS洗滌，從而使凡是表達β 2Μ的細胞都可被免疫磁珠標記。如圖2所示，將該群細胞流過位於兩個磁極9之間的塑料軟管7，其中被免疫磁珠所標記的表達β2Μ的細胞5(即陽性細胞)滯留於磁場內，而未被標記的細胞6(即陰性細胞)流出磁場，用Eppendorf管8收集細胞6 ;而滯留於磁場內的細胞5在去掉磁場後用緩衝液衝洗收集。按照上述操作將收集到的β 2Μ-細胞群6先後與兔抗大鼠c-Met抗體及免疫磁珠標記的山羊抗兔IgG孵育，再經PBS洗滌。這樣，在β2Μ-的細胞群中，凡是表達c-Met的C-Met+ β 2Μ細胞均被免疫磁珠所標記，流經磁場時，該細胞滯留於磁場內，將塑料軟管移離磁場後，用PBS將細胞衝出，獲得目的細胞-免疫磁珠標記的c-Met+β2Μ細胞。為了有效檢測移植細胞在受者體內的歸巢效率，該群細胞以螢光染料DAPI標記並充分洗滌。3、近交系F344大鼠的飼養和肝損傷模型的製備雄性一級近交系F344大鼠，體重180 200g，室溫20 22°C飼養，光線12小時明暗交替，自由飲水、進食。將丙烯醇按O. 62umol/kg體重經腹膜下注射至F344大鼠體內，製備藥物所致大鼠肝損傷模型，常規飼養3天後備用。4、C-Met+ β 2M 細胞的歸巢如圖3Α、圖3Β所示，磁歸巢定位儀包括有一支架10，支架10內上下相對設置有二磁極，下磁極11垂向設置在支架10的底面，上磁極12與下磁極11相對應的設置在支架10的頂面，上磁極12連接於螺杆14下端，而螺杆14上端設置有轉動把手13。通過旋轉轉動把手13，可以使螺杆14轉動，從而使螺杆相對支架10的頂面沿垂向移動，也就可以帶動上磁極12移動，藉此來改變上、下磁極之間的距離。二磁極成圓柱狀，為了保證兩磁極間的磁場強度，兩磁極靠近相對的一端直徑縮小，且直徑縮小的越多，兩磁極間的磁場梯度越大。此外，支架及二磁極的材料均選用鐵氧體燒結永磁性材料，可以有效的提高磁極間的磁場強度。將大鼠固定於磁歸巢定位儀中，使肝臟所對應的體表投射區正對上下兩個磁極，然後通過大鼠外周靜脈(尾靜脈或股靜脈)將步驟2所得目的細胞一螢光素標記的攜帶免疫磁珠的C-Met+ β 2Μ細胞輸注入體內，這樣，標記了免疫磁珠的目的幹細胞可在磁力的引導下沿血液循環向分布於肝臟內的各級血管富集，隨著大鼠在磁場內停留時間的延長，目的幹細胞便可穿越血管內皮細胞進入肝組織內整合入肝細胞板，從而使c-Met+β 2Μ細胞歸巢於肝組織。 實施例2、細胞歸巢效果的檢測體外富集按照實施例1中步驟I 2的操作得到免疫磁珠標記的β 2Μ細胞，PBS洗滌。然後配製含20%葡聚糖的生理鹽水作為流動相，將所得細胞懸浮於其中。調節蠕動泵流速為
O.1 15cm/s,使磁珠標記的細胞流過磁場(調節兩磁極間的距離1. 6 2. 5cm,使場強波動於1. 33 O. 85T)，顯微鏡下計數流出和流入細胞的比值，得到磁場對磁珠標記細胞的富集效率。操作過程如圖4所示，圖中15為加有免疫磁珠標記的β 2Μ細胞的20%葡聚糖生理鹽水溶液；16為蠕動泵；17為磁場的兩個磁極；18為富集的細胞。結果表明，隨著磁場強度的增加，β 2Μ細胞富集效果逐漸加強，當磁場強度在O. 75Te以上時，均能使磁珠標記的細胞在磁極對應的管道局部很好地富集，其效率達到95%以上。2、體內歸巢取近交系F344大鼠，雌雄不限，按實施例1步驟4的方法製備肝損傷模型。動物分為3組G1外周靜脈(股靜脈)移植+磁場；G2開腹經門靜脈移植；G3 :外周靜脈移植(對照組，不加磁場)。其中，Gl組的操作如下I)按實施例1中步驟I 2的方法製備免疫磁珠標記的C-Met+ β 2Μ細胞，然後加入DAPI染液，室溫避光染色30min，用PBS洗4次，按IxlOVmL將細胞重懸於DMEM/F12培
養基中；
2)大鼠常規麻醉後置於磁歸巢定位儀中四肢固定，使其肝臟體表投影部位正對上下兩個磁極；3)於腹股溝切開皮膚暴露股靜脈，經股靜脈緩慢注入處理好的細胞懸液，術後縫皮，燈照保暖，術後不同時間將大鼠移離磁場，正常飼養；4)術後分別於3d和IOd活殺大鼠，取肝組織製備冰凍切片，於螢光顯微鏡下觀察螢光標記細胞在受體大鼠肝內的分布。結果如圖5所不，圖5A為經門靜脈移植後,大鼠固定於磁場內20h細胞在肝臟的歸巢，圖5B為門靜脈細胞移植無磁場(對照)。結果表明，經股靜脈移植DAP1-免疫磁珠標記的細胞後,大鼠固定於磁場內20h與2h者相比，標記細胞在肺內的截留明顯減少，而在肝內的停留明顯增多；初步統計結果表明，滯留於肝臟內的細胞數，依次為磁場內20h >經門靜脈移植>磁場內2h和股靜脈移植(無磁場，對照組)，標記細胞在肺內的滯留與此相反。表明採用本發明方法能有效地使細胞歸巢於靶組 織內。
權利要求
1.一種幹細胞歸巢的快捷方法，具體步驟包括a)用粒徑為40 60nm的免疫磁珠標記幹細胞山)將標記後的幹細胞注入特定組織的循環系統內；c)將正負兩個磁極指向所述特定組織相對應的體表部位，在所述循環系統的循環過程中，所述幹細胞迅速準確歸巢於所述特定組織內；所述正負兩個磁極間的磁場強度為8400 18600GS。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述幹細胞來源於人骨髓、流產胎兒的不同組織、胎盤、臍帶血或來自大鼠骨髓。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述免疫磁珠標記所述幹細胞的過程如下將針對所述幹細胞表面標誌性抗原的特異性抗體與所述幹細胞溫育，經清洗後再與偶聯有抗所述特異性抗體的免疫磁珠溫育，清洗所得到的標記幹細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述幹細胞為來源於大鼠骨髓的c-Met+β 2M細胞；所述特異性抗體為兔抗大鼠c-Met抗體和β 2Μ抗體；所述免疫磁珠偶聯有山羊抗兔IgG。
5.根據權利要求1至4任一所述的方法，其特徵在於所述兩個異性磁極的材料為鐵氧體燒結永磁。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述兩個異性磁極呈圓柱狀，且兩磁極靠近相對的一端直徑縮小；所述兩個異性磁極端面的距離為6 30mm。
全文摘要
本發明提供的方法可使幹細胞快速有效歸巢。本發明所提供的幹細胞歸巢方法包括如下步驟1)用粒徑為40～60nm的免疫磁珠標記幹細胞；2)將標記後的幹細胞注入特定組織的循環系統內；3)將正負兩個磁極指向所述特定組織相對應的體表部位，在所述循環系統的循環過程中，所述幹細胞迅速準確歸巢於所述特定組織內；所述正負兩個磁極間的磁場強度為8400～18600Gs。本發明創新性地利用超順磁性磁珠的磁特性，採用磁吸引技術使幹細胞在特定組織歸巢，可幫助幹細胞在特定組織分化成有功能的成體細胞，為幹細胞的臨床應用開拓了新方向。
文檔編號A61N2/00GK103055418SQ201110323619
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者田傑 申請人:北京清美聯創幹細胞科技有限公司