一種小葉章莖段組培快繁的方法

2023-07-09 16:26:21 2

一種小葉章莖段組培快繁的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物組織培養技術領域，尤其涉及一種小葉章莖段組培快繁的方法。
【背景技術】
[0002]小葉章(Calamagrostis angustifolia Kom.)是禾本科拂子茅屬多年生根莖型草本植物，在我國主要分布於東北、華北、內蒙古等地區的平原低洼溼地，是三江平原典型草甸、沼澤化草甸的建群植物和優勢植物。
[0003]小葉章具有重要的經濟價值和生態價值，例如在東北草地地區其飼用價值僅次於羊草，同時它也是很好的水土保持植物和造紙等輕工業的良好原料。
[0004]近年來，由於三江平原大量溼地開墾成農田，使得溼地生態系統遭到嚴重破壞，溼地生物多樣性降低，小葉章的種群受到嚴重的破壞，生態功能下降。因此，對小葉章的人工繁殖可以減少對野生資源的破壞。
[0005]目前，小葉章仍處於野生狀態，種子萌芽率低，結實率低，而利用植物離體器官直接再生不定芽具有培養時間短，不容易發生變異，在短期內快速繁殖優質苗木而不受到季節的限制等優點。因此，本發明以小葉章幼嫩莖段為外植體，通過直接誘導不定芽、繼代增殖、生根和煉苗移栽等過程，從而建立小葉章的組織培養和快速繁殖體系，為小葉章的資源保護、基因工程研究提供可靠的理論基礎。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是為了解決野生狀態小葉章的種子萌芽率低和結實率低的問題，而提供了一種小葉章莖段組培快繁的方法。
[0007]本發明的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行:
[0008]—、莖段外植體的採集:選取當年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體；
[0009]二、莖段外植體的消毒:將採集的外植體去除葉片後，剪成3cm?4cm長的莖段，用自來水衝洗8min?1min，再用適量的洗潔精水衝洗2?3遍，然後用自來水衝洗乾淨後置於超淨工作檯中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，無菌水衝洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2111；[11、41]1；[11、61]1；[11、81]1；[11、101]1；[11和151]1；[11，期間不斷搖晃，無菌水衝洗5?6次，用無菌濾紙吸乾表面水分，備用；
[0010]三、誘導培養:將消毒好的莖段接種於無菌的誘導培養基中，誘導培養出腋芽;所述的誘導培養基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8;
[0011 ]四、增殖培養:將腋芽切下，切取長度為1.5cm?2cm，然後將腋芽轉接到增殖培養基中培養；連續繼代培養2次?3次，腋芽分化形成增殖苗；所述的增殖培養基為:含有
0.5mg/L?1.0mg/L2_iP(植物激素異戊稀基腺嘌呤)、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?
0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8;培養條件:溫度25±2°C，光照強度30μπιο1.m-2.s—1 ?40ymol.m-2.s—1，光照 14h/d?16h/d;誘導培養28d?30d;
[0012]五、壯苗伸長培養:將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉接到伸長培養基中，得到伸長的叢生芽；所述的伸長培養基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/LNAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8;
[0013]六、生根培養:切取步驟五伸長的叢生芽，然後轉接至生根培養基上進行培養，得到組培生根苗，所述的生根培養基為:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g//L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8，培養條件:溫度25 ± 2°C，光照強度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導培養28d?30d;
[0014]七、煉苗移栽:將組培生根苗在煉苗室開蓋鍛鍊2天?3天後，移栽至混合基質中，得到小葉章再生植株;所述混合基質是由草炭土、蛭石和珍珠巖按重量比3: (I?2): (I?3)組成的混合物。
[0015]本發明相對於現有的技術的優點:
[0016](I)本發明採用莖段直接再生不定芽具有培養時間短(能在3個月到4個月之間成苗)，不容易發生變異等優點，能較好的保持母本的生物學性狀，從而為小葉章的資源保護、基因工程研究提供可靠的理論基礎。
[0017](2)本發明的小葉章莖段組培快繁方法，外植體的腋芽誘導速度快;誘導率高、達87.44%以上；增殖係數可達5.76?6.23，生根率可達100%，組培生根苗健壯、移栽成活率高達95%以上。
[0018]附圖及說明
[0019]圖1為實施例1的無菌材料圖片；
[0020]圖2為實施例1的莖段腋芽萌發圖片；
[0021]圖3為實施例1的莖段增殖培養圖片；
[0022]圖4是實施例1的壯苗伸長培養圖片；
[0023 ]圖5是實施例1的生根培養圖片；
[0024]圖6是實施例1的移栽成活圖片。
【具體實施方式】
[0025]本發明技術方案不局限於以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0026]【具體實施方式】一:本實施方式的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行:
[0027]—、莖段外植體的採集:選取當年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體；
[0028]二、莖段外植體的消毒:將採集的外植體去除葉片後，剪成3cm?4cm長的莖段，用自來水衝洗8min?1min，再用適量的洗潔精水衝洗2?3遍，然後用自來水衝洗乾淨後置於超淨工作檯中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，無菌水衝洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2111；[11、41]1；[11、61]1；[11、81]1；[11、101]1；[11和151]1；[11，期間不斷搖晃，無菌水衝洗5?6次，用無菌濾紙吸乾表面水分，備用；
[0029]三、誘導培養:將消毒好的莖段接種於無菌的誘導培養基中，誘導培養出腋芽;所述的誘導培養基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8;
[0030]四、增殖培養:將腋芽切下，切取長度為1.5cm?2cm，然後將腋芽轉接到增殖培養基中培養；連續繼代培養2次?3次，腋芽分化形成增殖苗；所述的增殖培養基為:含有
0.5mg/L?1.0mg/L2-1P、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8;培養條件:溫度25 土 2 V，光照強度30μηιο1.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導培養28d?30d;
[0031]五、壯苗伸長培養:將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉接到伸長培養基中，得到伸長的叢生芽；所述的伸長培養基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/LNAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8;
[0032]六、生根培養:切取步驟五伸長的叢生芽，然後轉接至生根培養基上進行培養，得到組培生根苗，所述的生根培養基為:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g//L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8，培養條件:溫度25 ± 2°C，光照強度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導培養28d?30d;
[0033]七、煉苗移栽:將組培生根苗在煉苗室開蓋鍛鍊2天?3天後，移栽至混合基質中，得到小葉章再生植株;所述混合基質是由草炭土、蛭石和珍珠巖按重量比3: (I?2): (I?3)組成的混合物。
[0034]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，誘導培養基為:含有0.5mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA、35g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0035]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，增殖培養基為:含有
0.5mg/L 2-1P、0.5mg/L6_BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉的 1/2MS培養基，pH值為5.5。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0036]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，步驟四增殖培養的培養條件:溫度25°C，光照強度30μπκ)1πΓ2.s—S光照15h/d;誘導培養28d。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0037]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，伸長培養基為:含有
0.5mg/L GA3、0.lmg/L熟4、308/1蔗糖和68/1瓊脂粉的1/21^培養基，？田直為5.5。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0038]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，所述的生根培養基為:含有2.0mg/L嫩4、308/1蔗糖和78/1瓊脂粉的1/21^培養基，？!1值為5.5。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0039]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，步驟六生根培養的培養條件:溫度25°C，光照強度40μπιΟ1.πΓ2.s—S光照16h/d;誘導培養30d。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0040]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，混合基質中按重量比草炭土:輕石:珍珠巖=3:1: I。其他步驟與參數與【具體實施方式】一相同。
[0041 ] 實施例1
[0042]本實施例的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行:
[0043]—、莖段外植體的採集:選取當年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體。
[0044]二、莖段外植體的消毒:將採集的外植體去除葉片後，剪成3cm?4cm長的莖段，用自來水衝洗lOmin，再用適量的洗潔精水衝洗2遍，然後用自來水衝洗乾淨後置於超淨工作檯中，用75%酒精浸泡30s，無菌水衝洗2次；用0.1 %HgCh溶液消毒2min、4min、6min、8min、10mir^P15min，期間不斷搖晃，無菌水衝洗5次，用無菌濾紙吸乾表面水分，備用(圖1);
[0045]三、誘導培養:將消毒好的莖段接種於無菌誘導培養基中，誘導培養出腋芽;所述的誘導培養基(和前面說的無菌誘導培養基是一個)為:1/2MS(MS大量元素減半，其他不變)+6-BA0.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+瓊脂粉7g/L+pH值為5.5(圖2);
[0046]四、增殖培養:將長度1.5?2cm的腋芽切下轉接到增殖培養基培養;連續繼代2次?3次，腋芽分化形成增殖苗;所述的增殖培養基為:l/2MS+2-1P(植物激素異戊烯基腺嘌呤)0.5mg/L+6-BA0.lmg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+瓊脂粉7g/L+pH值為5.5;培養條件:溫度25°C，光照強度40μπιΟ1.πΓ2.s—S光照16h/d;誘導培養28d(圖3);
[0047]五、壯苗伸長培養:將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉接到伸長培養基中，所述的伸長培養基為:1/2MS+GA30.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+瓊脂粉6g/L+pH值為5.5(圖 4);
[0048]六、生根培養:切取叢生芽轉接至生根培養基上進行培養，得到組培生根苗，所述的生根培養基為:1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉7g/L+pH值為5.5，培養條件:溫度25°C，光照強度40μπιΟ1.m—2.s—1，光照 16h/d;誘導培養30d(圖5);
[0049]七、煉苗移栽:將生根苗在煉苗室開蓋鍛鍊3天後，移栽至按重量比的草炭土:蛭石:珍珠巖=3:1:1混合的基質中，得到小葉章再生植株(圖6)。
[0050]圖2為步驟三誘導培養15d後腋芽可長至3cm左右，葉片開展，形成綠梢，誘導率為87.44%。
[0051 ]圖3為步驟四腋芽的單芽形成芽叢，芽伸長生長快，增殖係數可高達5.76。
[0052]圖5表明不定根的誘導率為100%，植株健壯，葉色翠綠，根系粗壯。
[0053]本實施例實現了小葉章莖段快速繁殖成小葉章再生植株，且增殖係數可高達5.76和不定根的誘導率為100%。
【主權項】
1.一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:該方法按以下步驟進行: 一、莖段外植體的採集:選取當年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體； 二、莖段外植體的消毒:將採集的外植體去除葉片後，剪成3cm-4cm長的莖段，用自來水衝洗Smin?lOmin，再用適量的洗潔精水衝洗2?3遍，然後用自來水衝洗乾淨後置於超淨工作檯中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，無菌水衝洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2min、4min、6min、8min、1min和15min，期間不斷搖晃，無菌水衝洗5?6次，用無菌濾紙吸乾表面水分，備用； 三、誘導培養:將消毒好的莖段接種於無菌的誘導培養基中，誘導培養出腋芽;所述的誘導培養基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8; 四、增殖培養:將腋芽切下，切取長度為1.5cm?2cm，然後將腋芽轉接到增殖培養基中培養;連續繼代培養2次?3次，腋芽分化形成增殖苗;所述的增殖培養基為:含有0.5mg/L?1.0mg/L2_iP、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的I /2MS培養基，pH值為5.5?5.8 ;培養條件:溫度25 ± 2 °C，光照強度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導培養28d?30d; 五、壯苗伸長培養:將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉接到伸長培養基中，得到伸長的叢生芽;所述的伸長培養基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8; 六、生根培養:切取步驟五伸長的叢生芽，然後轉接至生根培養基上進行培養，得到組培生根苗，所述的生根培養基為:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5?5.8，培養條件:溫度25 ± 2°C，光照強度30ymol.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導培養28d?30d; 七、煉苗移栽:將組培生根苗在煉苗室開蓋鍛鍊2天?3天後，移栽至混合基質中，得到小葉章再生植株;所述混合基質是由草炭土、蛭石和珍珠巖按重量比3: (I?2): (I?3)組成的混合物。2.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:誘導培養基為:含有0.5mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA、35g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5。3.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:增殖培養基為:含有0.5mg/L 2-1P、0.5mg/L6_BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉的 1/2MS培養基，pH值為5.5。4.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:步驟四增殖培養的培養條件:溫度25°C，光照強度30μπιΟ1.πΓ2.s—S光照15h/d;誘導培養28d。5.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:伸長培養基為:含有0.5mg/L GA3、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5。6.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:所述的生根培養基為:含有2.0mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉的1/2MS培養基，pH值為5.5。7.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:步驟六生根培養的培養條件:溫度25°C，光照強度40μηιο1.m—2.s—S光照16h/d;誘導培養30d。8.根據權利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特徵在於:混合基質中按 重量比草炭土:蛭石:珍珠巖= 3:1:1。
【專利摘要】一種小葉章莖段組培快繁的方法，本發明屬於植物組織培養技術領域，尤其涉及一種小葉章莖段組培快繁的方法。本發明的目的是為了解決野生狀態小葉章的種子萌芽率低和結實率低的問題。本發明的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行：一、莖段外植體的採集、二、莖段外植體的消毒、三、誘導培養、四、增殖培養、五、壯苗伸長培養、六、生根培養、七、煉苗移栽。本發明採用莖段直接再生不定芽具有培養時間短(能在3個月到4個月之間成苗)，不容易發生變異等優點且本發明的小葉章莖段組培快繁方法，外植體的腋芽誘導速度快；誘導率高。本發明的培養方法用於植物快速繁殖。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706934
【申請號】CN201610124898
【發明人】張玉, 倪紅偉, 徐明怡, 冷海楠, 王麗媛, 隋心
【申請人】黑龍江省科學院自然與生態研究所