海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF及其製備方法
2023-05-03 01:52:11 1
海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF及其製備方法
【專利摘要】海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF及其製備方法，涉及一種微生物來源的抗真菌蛋白。海洋桔青黴W1為CCTCC?NO：M2013205。從海洋桔青黴W1發酵液上清中分離純化到一種抗真菌蛋白，命名為PcPAF，經鑑定所得質譜信息在NCBI?Genbank資料庫中未匹配到結果；進而通過N端測序檢測該蛋白N端的15個胺基酸，所得胺基酸序列在NCBI?Genbank資料庫中的比對結果同源性很低，判斷PcPAF為一種新的抗真菌蛋白。經N端測序確定其N端15個胺基酸為AGNRPDFPRRHHPGG。PcPAF對4株植物致病真菌綠色木黴等具有明顯抑制作用。PcPAF在80℃下加熱20min仍具有抗菌活性。
【專利說明】海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物來源的抗真菌蛋白，尤其是涉及一種海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF及其製備方法。
【背景技術】
[0002]一些由病毒、細菌和真菌影響所引起的農作物疾病，導致了農產品的虧損和質量安全問題。目前，植物疾病的防治主要依靠化學農藥，但是農藥的使用受到了嚴格的監管和控制。抗真菌蛋白則被看做是能夠保護植物健康的新興化合物，因為目前正需要不僅能保護植物，同時又符合新規定的新型農藥。生物體能夠通過核糖體或非核糖體合成並分泌多種抗真菌蛋白。以一些抗真菌蛋白為基礎而設計的新合成物已經在轉基因植物中表達，賦予了植物抵抗微生物病害的能力，或者通過轉基因微生物分泌出能夠作為商業生物農藥的有效成分([l]Emilio Μ.(2007)Antimicrobial peptides and plant diseasecontrol[J].FEMS Microbiology Letters270(I):1-11)。
[0003]抗真菌蛋白幾乎存在於所有生物中，包括細菌、真菌、昆蟲、軟體動物、植物和哺乳動物。由於環境中存在大量的致病真菌，許多生物已經進化出多種強有力的防禦機制，其中包括合成一些小分子量的具有抗真菌活性的多肽和蛋白質。抗真菌蛋白是先天性免疫反應中的進化保守組件，並且是主要的效應分子。抗真菌蛋白參與生物體的組成抗性或者誘導抗性機制，使生物體能夠有效地抵抗致病真菌的侵害。([2]Claude P.S.(2001)AntifungalProteins[J].Applied And Environment Microbiology67(7):2883 - 2894)?
[0004]真菌來源的抗真菌蛋白，目前報導的還比較少，包括從麴黴Aspergi I Iusgiganteus 分離到的抗真菌蛋白 AFP([3]Wnendt S, Ulbrich N, StahlU.(1994)Molecular cloning, sequence analysis and expression of the gene encoding anantifungal-protein from Aspe`rgillus giganteus[J].Current Genetics25:519-523),從產黃青黴Penicillium chrysogenums分離到的抗真菌蛋白PAF以及從黑麴黴Aspergillus niger 中分離到的抗真菌蛋白 Anafp ([4]Marx F，HaasH, Reindl M, etal.(1995)Cloning, structural organization and regulation of expression of thePenicillium chrysogenum paf gene encoding an abundantly secreted protein withantifungal activity[J].Gene167:167-171;[5]Geisen R.(2000)P.nalgiovense carriesa gene which is homologous to the paf gene of P.chrysogenum which codes for anantifungal peptide[J].1nternational Journal of Food Microbiology62:95-101; [6]Rodriguez-Mamn A, Acosta R, Liddell S, et al.(2010).Characterization of the novelantifungal protein PgAFP and the encoding gene of Penicillium chrysogenum[J].Peptides31:541-547;[7]Gun LD,Shin SY, Maeng CY,et al.(1999).1solation andcharacterization of a novel antifungal peptide from Aspergillus niger[J].Biochemical and Biophysical Research Communications263:646-651)。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一在於提供海洋桔青黴(Penicillium citrinum) Wl。
[0006]本發明的目的之二在於提供一種海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF及其製備方法。
[0007]本發明的目的之三在於提供一種通過N端測序鑑定海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的部分胺基酸序列的方法，抗真菌蛋白PcPAF的N端15個胺基酸序列如下所示:AGNRPDFPRimHPGG。
[0008]本發明所述海洋桔青黴(Penicillium citrinum)Wl已於2013年5月15日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013205，中國典型培養物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學。
[0009]所述海洋桔青黴(Penicillium citrinum) Wl是從中國大洋第21航次科學考查採集的西南印度洋深海沉積物樣品中分離得到。將該菌株接種於YPTG液體或者固體培養基表面，在28 °C條件下培養，該菌株能夠快速生長。該菌株在固體培養基上，菌落呈綠色，菌絲緻密，與培養基連接緊密，產生的孢子較多，在培養基上產生黃綠色的色素，使背景呈黃綠色。
[0010]所述海洋桔青黴(Penicillium citrinum) Wl的ITS序列為:
[0011]I GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC
[0012]51 ATTACCGAGT GCGGGCCCCT CGGGGCCCAA CCTCCCACCC GTGTTGCCCG
[0013]101 AACCTATGTT GCCTCGGCGG GCCCCGCGCC CGCCGACGGC CCCCCTGAAC
[0014]151 GCTGTCTGAA GTTGCAGTCT GAGACCTATA ACGAAATTAG TTAAAACTTT
[0015]201 CAACAACGGA TCTCTTGGTT CCGGCATCGA TGAAGAACGC AGCGAAATGC
[0016]251 GATAACTAAT GTGAATTGCA GAATTCAGTG AATCATCGAG TCTTTGAACG
[0017]301 CACATTGCGC CCTCTGGTAT TCCGGAGGGC ATGCCTGTCC GAGCGTCATT
[0018]351 GCTGCCCTCA AGCCCGGCTT GTGTGTTGGG CCCCGTCCCC CCCGCCGGGG
[0019]401 GGACGGGCCC GAAAGGCAGC GGCGGCACCG CGTCCGGTCC TCGAGCGTAT
[0020]451 GGGGCTTCGT CACCCGCTCT AGTAGGCCCG GCCGGCGCCA GCCGACCCCC
[0021]501 AACCTTTAAT TATCTCAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG
[0022]552 AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGG。
[0023]所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF，表現為序列的新穎性，通過MALD1-T0F-T0F進行鑑定，所得質譜信息在美國國家醫學圖書館國家生物技術信息中心(NCBI) Genbank資料庫中未匹配到結果；進而通過N端測序檢測蛋白N端的15個胺基酸，所得胺基酸序列在NCBI資料庫中的比對結果同源性很低，說明該蛋白為一種新的抗真菌蛋白，其N端15個胺基酸序列為:AGNRPDFPRRHHPGG。
[0024]所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法,包括以下步驟:
[0025]1)從平板上挑取海洋桔青黴(Penicillium citrinum) Wl菌體接種於YPTG液體培養基進行發酵培養後，收集發酵液上清；
[0026]2)在步驟1)所收集到的發酵液上清中加入硫酸銨，配製成硫酸銨飽和的混合液，靜置，使發酵液上清中的蛋白完全沉澱；
[0027]3)將步驟2)所得混合液進行離心，收集的沉澱用去離子水重新溶解，獲得含鹽的粗蛋白溶液；[0028]4)將步驟3)所得含鹽的粗蛋白溶液轉移到透析袋中進行透析，除去多餘的鹽離子，再通過離心除去溶液中的不溶性雜質，收集除鹽後的粗蛋白溶液，分裝後凍存；
[0029]5)將步驟4)所得結凍的粗蛋白溶液轉移到凍幹機中進行凍幹，去除水相得到固體的粗蛋白，再用去離子水將粗蛋白溶解；
[0030]6)將步驟5)所得處理後的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱上進行第一步的分離純化，根據依次出現的280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行超濾濃縮，通過真菌拮抗實驗追蹤分離得到的活性組分，進行抗真菌活性檢測，使用對該粗蛋白敏感的植物病原真菌作為敏感指示菌；
[0031]7)將步驟6)獲得的具有抗真菌活性的非吸附組分繼續在羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱上進行第二步分離純化，同樣根據依次出現的280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行離心超濾濃縮，通過真菌拮抗實驗追蹤分離出來的活性組分，同樣採用濾紙片法，並使用對該粗蛋白敏感的植物病原真菌作為敏感指示菌，活性組分確定後，通過SDS-PAGE電泳圖判斷組分中的蛋白純度，確定活性組分為純的單一蛋白；
[0032]8)通過15%SDS_PAGE 電泳在IOkDa附近得到單一條帶,將凝膠上的單一條帶切下，經過無菌去離子水洗滌後，通過MALD1-T0F-T0F進行鑑定，所得質譜信息在NCBI資料庫中未匹配到結果；進而將單一的蛋白條帶通過轉膜處理轉移到PVDF聚偏二氟乙烯膜上，通過N端測序鑑定蛋白N端的15個胺基酸，所得胺基酸序列在NCBI資料庫中的比對結果同源性很低，判斷為一種新的抗真菌蛋白。
[0033]在步驟I)中，所述YPTG液體培養基的組成成分及各組分質量百分比含量為:每IOOmLYPTG液體培養基中含酵母提取物0.5g，蛋白腖0.3g，甘露醇2.5g，葡萄糖lg，以及氯化鈉0.25g ;所述發酵培養的條件為28°C、180r/min，發酵培養時間為7天；所述收集發酵液上清可通過抽濾的方法將所得發酵液中的菌體去除後獲得。
[0034]在步驟2)中，所述靜置的條件可於4°C條件下靜置過夜。
[0035]在步驟3)中，所述離心的條件可將混合液於13000g、4°C條件下離心30min。
[0036]在步驟4)中，所述透析的條件可在4°C條件下進行；所述離心的條件可在10000g、4°C條件下離心20min。
[0037]在步驟5)中，所述凍幹，是在凍幹機中進行，凍幹時間是2天。
[0038]在步驟6)中，所述超濾濃縮的條件可為4800g、4°C ;所述敏感指示菌包括但不限於綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴和長柄鏈格孢等；所述抗真菌活性檢測方法可採用濾紙法，採用濾紙法的具體步驟如下:挑取直徑為0.6cm的敏感指示菌菌塊於PDA平板中央，28 °C倒置培養，在距敏感指示菌菌絲邊緣0.8-Icm處放置直徑為0.65cm無菌紙片，在各紙片上滴加40-50 μ L濃縮後的各分離組分以及空白對照，將平板置於28°C條件下培養，直到能觀察到受試菌菌絲的生長受到明顯的抑制。
[0039]在步驟8)中，所述N端測序鑑定可委託中科院上海生命科學院蛋白質組研究分析中心進行N端測序鑑定。
[0040]本發明採用鹽析、透析、凍幹、陰離子交換色譜、陽離子交換色譜、超濾濃縮等方法從海洋桔青黴(Penicillium citrinum)Wl發酵液上清中分離純化到一種抗真菌蛋白，將它命名為PcPAF，通過MALD1-T0F-T0F質譜鑑定該蛋白，所得質譜信息在NCBI Genbank資料庫中未匹配到結果；進而通過N端測序檢測該蛋白N端的15個胺基酸，所得胺基酸序列在NCBIGenbank資料庫中的比對結果同源性很低，判斷PcPAF為一種新的抗真菌蛋白。通過N端測序確定其N端15個胺基酸為AGNRPDFPRRHHPGG。PcPAF對4株植物致病真菌綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴以及長柄鏈格孢具有明顯抑制作用。經檢測，PcPAF對綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴以及長柄鏈格孢的最低抑制濃度分別為1.52 μ g/disc、
6.08 μ g/disc,3.04 μ g/disc 和 6.08 μ g/disc。PcPAF 在 80°C條件下加熱 20min 仍具有抗菌活性。
[0041]本發明是從海洋桔青黴Wl發酵液上清中分離純化到一種抗真菌蛋白，並判定為一種新的抗真菌蛋白。抗真菌蛋白PcPAF對典型的植物致病真菌綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴以及長柄鏈格孢具有明顯的抑制作用，顯示出其在農業抗真菌藥物、食品保藏等方面具有潛在的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1為海洋桔青黴(Penicillium citrinum) Wl蛋白成分使用二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱進行色譜分離的情況。在圖1中，橫坐標表示洗脫運行時間(min)，縱坐標表示紫外吸收值(mAU) ;P1表示具有活性的非吸附組分。
[0043]圖2為非吸附組分Pl使用羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱進行色譜分離的情況。在圖2中，橫坐標表示洗脫運行時間(min)，縱坐標表示紫外吸收值(mAU) ;P5表示非吸附組分。
[0044]圖3為分離產物PcPAF進行SDS-PAGE電泳的圖譜。在圖3中，右邊泳道M表示蛋白分子量標準Marker,左邊泳道P表示分離產物PcPAF。
[0045]圖4為分離產物PcPAF對敏感指示菌綠色木黴的抑制效果圖。在圖4中，I表示作為空白對照的溶解PcPAF的起始緩衝溶液，2表示PcPAF。
[0046]圖5為分離產物PcPAF對敏感指示菌棉花枯萎病菌的抑制效果圖。在圖5中，I表示作為空白對照的溶解PcPAF的起始緩衝溶液，2表示PcPAF。
[0047]圖6為分離產物PcPAF對敏感指示菌宛氏擬青黴的抑制效果圖。在圖6中，I表示作為空白對照的溶解PcPAF的起始緩衝溶液，2表示PcPAF。
[0048]圖7為分離產物PcPAF對敏感指示菌長柄鏈格孢的抑制效果圖。在圖7中，I表示作為空白對照的溶解PcPAF的起始緩衝溶液，2表示PcPAF。
[0049]圖8為通過二倍稀釋法檢測PcPAF對敏感指示菌綠色木黴的最低抑制濃度的檢測結果。在圖8中，I-6表示各紙片抗真菌蛋白濃度分別為97.30 μ g/disc, 48.65 μ g/disc,24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始緩衝溶液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.1)。
[0050]圖9為通過二倍稀釋法檢測PcPAF對敏感指示菌棉花枯萎病菌的最低抑制濃度的檢測結果。在圖9中，I-6表示各紙片抗真菌蛋白濃度分別為48.65 μ g/disc, 24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc, 1.52 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始緩衝溶液(20mmol/L Tris-HCl，ρΗ8.I)。
[0051]圖10為通過二倍稀釋法檢測PcPAF對敏感指示菌宛氏擬青黴的最低抑制濃度的檢測結果。在圖10中，I-6表示各紙片抗真菌蛋白濃度分別為24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc, 1.52 μ g/disc, 0.76 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始緩衝溶液(20mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.I)。
[0052]圖11為通過二倍稀釋法檢測PcPAF對敏感指示菌長柄鏈格孢的最低抑制濃度的檢測結果。在圖11中，I-6表示各紙片抗真菌蛋白濃度分別為48.65 μ g/disc, 24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc, 1.52 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始緩衝溶液(20mmol/LTris-HCl，pH8.1)。
[0053]圖12為不同溫度處理後的活性蛋白PcPAF對敏感指示菌綠色木黴的抑制作用。在圖12中，I表示未處理的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C處理20min後的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C處理20min後的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C處理20min後的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C處理20min後的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C處理20min後的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始緩衝溶液(20mmol/L Tris-HCl,ρΗ8.I)。
[0054]圖13為不同溫度處理後的活性蛋白PcPAF對敏感指示菌棉花枯萎病菌的抑制作用。在圖13中，I表示未處理的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C處理20min後的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C處理20min後的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C處理20min後的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C處理20min後的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C處理20min後的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始緩衝溶液(20mmol/LTris-HCl, pH8.1)。
[0055]圖14為不同溫度處理後的活性蛋白PcPAF對敏感指示菌宛氏擬青黴的抑制作用。在圖14中，I表示未處理的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C處理20min後的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C處理20min後的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C處理20min後的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C處理20min後的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C處理20min後的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始緩衝溶液(20mmol/LTris-HCl, pH8.1)。
[0056]圖15為不同溫度處理後的活性蛋白PcPAF對敏感指示菌長柄鏈格孢的抑制作用。在圖15中，I表示未處理 的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C處理20min後的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C處理20min後的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C處理20min後的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C處理20min後的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C處理20min後的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始緩衝溶液(20mmol/LTris-HCl, pH8.1)。
【具體實施方式】
[0057]以下實施例將結合附圖對本發明作詳細說明。
[0058]1.菌種
[0059]本發明涉及菌株海洋桔青黴(Penicillium citrinum)Wl,已於2013年5月15日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013205，中國典型培養物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學；是從中國大洋第21航次科學考查採集的西南印度洋深海沉積物樣品中分離得到，它的發酵上清對綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴、以及長柄鏈格孢的菌絲生長具有明顯抑制活性。
[0060]2.培養基[0061 ] YPTG液體培養基:0.5%酵母提取物，0.3%蛋白腖，2.5%甘露醇，1%葡萄糖，及
0.25%NaCl，用去離子水配製。
[0062]實施例1:海洋桔青黴(Penicillium citrinum)Wl蛋白成分使用二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱進行色譜分離
[0063]使用起始緩衝液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.1)平衡二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱，將2ml左右的海洋桔青黴Wl粗蛋白成分在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱上樣，使用兩個柱體積的起始緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.1)衝洗層析柱，獲得低鹽濃度條件下在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱上的非吸附成分P1，再用洗滌緩衝液(lmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl,pH8.1)繼續衝洗二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱，將其餘的吸附組分洗脫下來(圖1)。
[0064]實施例2:非吸附組分Pl使用羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱進行色譜分離
[0065]使用起始緩衝液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.1)平衡羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱，將濃縮至2ml左右的非吸附組分Pl在羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱上樣，使用兩個柱體積的起始緩衝液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.1)衝洗層析，獲得非吸附組分P5，再用洗滌緩衝液(lmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl, pH8.1)繼續衝洗羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱，將其餘的吸附組分洗脫下來(圖2)。
[0066]實施例3:分離產物PcPAF進行SDS-PAGE電泳
[0067]分離到的的組分P5在電壓180V，常溫條件下跑15%SDS_PAGE電泳，使用硝酸銀快速染色方法檢測分離組分P5的純度，在電泳染色圖譜上，分離到的組分P5隻有一條單一條帶被顯色出來，大小在IOkDa附近，將該蛋白命名為PcPAF(圖3)。
[0068]實施例4:分離產物PcPAF`對4株敏感指示菌綠色木黴，棉花枯萎病菌，宛氏擬青黴以及長柄鏈格孢的抑制效果
[0069]挑取直徑為0.6cm的敏感指示菌圓形菌塊接種於普通PDA培養基平板上，在28 °C條件下倒置培養，使菌絲在平板上呈圓形伸展，在距離菌絲邊緣0.8-Icm處放置直徑為
0.65cm的無菌濾紙片，在濾紙片上滴加40-50μ L的PcPAF抗真菌蛋白溶液，而在作為空白對照的另一濾紙片上，滴加等體積的溶解PcPAF的起始緩衝溶液(圖4-7)。
[0070]實施例5 =PcPAF對4株敏感指示菌的最低抑制濃度的測定
[0071]挑取直徑為0.6cm的敏感指示菌圓形菌塊接種於普通PDA培養基平板上，在28°C條件下倒置培養，使菌絲在平板上呈圓形伸展，在距離菌絲邊緣0.8-Icm處均勻放置直徑為0.65cm的無菌濾紙片，各濾紙片距離菌絲邊緣相等距離。採用二倍稀釋法將高濃度的PcPAF抗真菌蛋白溶液依次進行梯度稀釋，稀釋液使用起始緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.1)，將各稀釋樣品過濾除菌，在每個濾紙片上滴加40-50 μ L的各濃度的PcPAF抗真菌蛋白質溶液，以起始緩衝液作為陰性對照，在超淨臺中將平板上所加的液體樣品吹乾，將做好的PDA抑菌板置於28°C條件下倒置培養，不同敏感指示菌培養時間不同，直到能夠觀察到真菌菌絲受抑制的最低程度。採用二倍稀釋法，最低抑制濃度(MIC，minimalinhibition concentration)可定義為隨著各個濾紙片上抗真菌蛋白含量的降低，濾紙片周圍出現的對黴菌菌絲的抑制程度逐漸減弱，最終與陰性對照無差別，即能夠觀察到對黴菌菌絲抑制現象的最低蛋白含量，記為μ g/disc。
[0072]通過二倍稀釋法，檢測到PcPAF對綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴以及長柄鏈格孢的最低抑制濃度分別為1.52 μ g/disc、6.08 μ g/disc、3.04 μ g/disc和6.08 μ g/disc (圖 8 -11)。
[0073]實施例6:溫度對抗真菌蛋白PcPAF抗菌活性的影響
[0074]將pcPAF抗真菌蛋白溶液於40℃、60:、80℃:、100℃:條件下分別處理201min以及121 °C高壓滅菌條件下處理20min ;處理後的PcPAF抗真菌蛋白溶液於4°C放置Ih後離心，以未處理的PcPAF蛋白溶液為陽性對照，以溶解PcPAF抗真菌蛋白的緩衝液為陰性對照，檢測各樣品對4株敏感指不囷的抑囷活性。
[0075]挑取直徑為0.6cm的敏感指示菌圓形菌塊接種於普通PDA培養基平板上，在28 °C條件下倒置培養，使菌絲在平板上呈圓形伸展，在距離菌絲邊緣0.8-Icm處均勻放置直徑為0.65cm的無菌濾紙片，各濾紙片距離菌絲邊緣相等距離。在紙片上分別滴加40-50 μ L經不同溫度處理後的PcPAF抗真菌蛋白溶液。檢測到PcPAF在100°C條件下處理20min會失去抗菌活性(圖12-15)。
【權利要求】
1.海洋桔青黴(Penicilliumcitrinum)W1，已於2013年5月15日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013205。
2.如權利要求1所述海洋桔青黴(Penicilliumcitrinum) Wl,其特徵在於其ITS序列為:
I GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC
51 ATTACCGAGT GCGGGCCCCT CGGGGCCCAA CCTCCCACCC GTGTTGCCCG
101 AACCTATGTT GCCTCGGCGG GCCCCGCGCC CGCCGACGGC CCCCCTGAAC
151 GCTGTCTGAA GTTGCAGTCT GAGACCTATA ACGAAATTAG TTAAAACTTT
201 CAACAACGGA TCTCTTGGTT CCGGCATCGA TGAAGAACGC AGCGAAATGC
251 GATAACTAAT GTGAATTGCA GAATTCAGTG AATCATCGAG TCTTTGAACG
301 CACATTGCGC CCTCTGGTAT TCCGGAGGGC ATGCCTGTCC GAGCGTCATT
351 GCTGCCCTCA AGCCCGGCTT GTGTGTTGGG CCCCGTCCCC CCCGCCGGGG
401 GGACGGGCCC GAAAGGCAGC GGCGGCACCG CGTCCGGTCC TCGAGCGTAT
451 GGGGCTTCGT CACCCGCTCT AGTAGGCCCG GCCGGCGCCA GCCGACCCCC
501 AACCTTTAAT TATCTCAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG
551 AACTTA AGCA TATCAATAAG CGGAGG。
3.如權利要求1所述海洋桔青黴(Penicilliumcitrinum)Wl,其特徵在於其抗真菌蛋白PcPAF的N端15個胺基酸序列為:AGNRPDFPRRHHPGG。
4.海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)從平板上挑取海洋桔青黴(Penicilliumcitrinum) Wl菌體接種於YPTG液體培養基進行發酵培養後，收集發酵液上清； 2)在步驟I)所收集到的發酵液上清中加入硫酸銨，配製成硫酸銨飽和的混合液，靜置，使發酵液上清中的蛋白完全沉澱； 3)將步驟2)所得混合液進行離心，收集的沉澱用去離子水重新溶解，獲得含鹽的粗蛋白溶液； 4)將步驟3)所得含鹽的粗蛋白溶液轉移到透析袋中進行透析，除去多餘的鹽離子，再通過離心除去溶液中的不溶性雜質，收集除鹽後的粗蛋白溶液，分裝後凍存； 5)將步驟4)所得結凍的粗蛋白溶液轉移到凍幹機中進行凍幹，去除水相得到固體的粗蛋白，再用去離子水將粗蛋白溶解； 6)將步驟5)所得處理後的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱上進行第一步的分離純化，根據依次出現的280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行超濾濃縮，通過真菌拮抗實驗追蹤分離得到的活性組分，進行抗真菌活性檢測，使用對該粗蛋白敏感的植物病原真菌作為敏感指示菌； 7)將步驟6)獲得的具有抗真菌活性的非吸附組分繼續在羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱上進行第二步分離純化，同樣根據依次出現的280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行離心超濾濃縮，通過真菌拮抗實驗追蹤分離出來的活性組分，同樣採用濾紙片法，並使用對該粗蛋白敏感的植物病原真菌作為敏感指示菌，活性組分確定後，通過SDS-PAGE電泳圖判斷組分中的蛋白純度，確定活性組分為純的單一蛋白； 8)通過15%SDS-PAGE電泳在IOkDa附近得到單一條帶,將凝膠上的單一條帶切下,經過無菌去離子水洗滌後，通過MALD1-TOF-TOF進行鑑定，所得質譜信息在NCBI資料庫中未匹配到結果；進而將單一的蛋白條帶通過轉膜處理轉移到PVDF聚偏二氟乙烯膜上，通過N端測序鑑定蛋白N端的15個胺基酸，所得胺基酸序列在NCBI資料庫中的比對結果同源性很低，判斷為一種新的抗真菌蛋白。
5.如權利要求4所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法，其特徵在於在步驟I)中，所述YPTG液體培養基的組成成分及各組分質量百分比含量為:每IOOmL YPTG液體培養基中含酵母提取物0.5g,蛋白腖0.3g,甘露醇2.5g,葡萄糖Ig,以及氯化鈉0.25g ;所述發酵培養的條件為28°C、180r/min，發酵培養時間為7天；所述收集發酵液上清可通過抽濾的方法將所得發酵液中的菌體去除後獲得。
6.如權利要求4所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法，其特徵在於在步驟2)中，所述靜置的條件是於4°C條件下靜置過夜；在步驟3)中，所述離心的條件可將混合液於13000g、4°C條件下離心 30min。
7.如權利要求4所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法，其特徵在於在步驟.4)中，所述透析的條件是在4°C條件下進行；所述離心的條件可在10000g、4°C條件下離心20mino
8.如權利要求4所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法，其特徵在於在步驟5)中，所述凍幹，是在凍幹機中進行，凍幹時間是2天。
9.如權利要求4所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法，其特徵在於在步驟6)中，所述超濾濃縮的條件為4800g、4°C ;所述敏感指示菌包括但不限於綠色木黴、棉花枯萎病菌、宛氏擬青黴和長柄鏈格孢。
10.如權利要求4所述海洋桔青黴抗真菌蛋白PcPAF的製備方法,其特徵在於在步驟6)中，所述抗真菌活性檢測方法採用濾紙法，採用濾紙法的具體步驟如下:挑取直徑為.0.6cm的敏感指示菌菌塊於PDA平板中央，28°C倒置培養，在距敏感指示菌菌絲邊緣0.8~Icm處放置直徑為0.65cm無菌紙片，在各紙片上滴加40~50 μ L濃縮後的各分離組分以及空白對照，將平板置於28°C條件下培養，直到能觀察到受試菌菌絲的生長受到明顯的抑制。
【文檔編號】C07K1/34GK103451109SQ201310370028
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】陳新華, 郭文斌, 文超 申請人:國家海洋局第三海洋研究所, 中國大洋礦產資源研究開發協會