優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體的製作方法

2023-07-19 09:11:26 2

專利名稱：優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體的製作方法
技術領域：
本發明屬於海藻資源高值化開發利用技術領域，具體是涉及一種利用在優化的調控培養條件情況下，培養出具有高含量藻紅蛋白的紫菜絲狀藻體的技術方法。
背景技術：
海洋藻類資源及天然活性產物的高值化開發和利用是當今海洋生物科學研究的重要主題。在海洋生態系統中，光合色素對於所有光合作用的自營養型生物是至關重要的。 各種海洋植物、藻類能通過自身存在的光合系統，有效地利用環境中的CO2,即海藻的光合色素能把(X)2轉化為有機物並釋放氧氣，它們是海洋中其它生物賴以生存、持續發展的基礎。海洋紅藻和藍藻，除了含有植物常見的葉綠素a外，還含有一類特殊的輔助性採光色素，稱為藻膽蛋白(Wiycobiliprotein)，主要包括藻紅蛋白(Wiycoerythrin，PE)，藻藍蛋白(Phycocyanin，PC)和別藻藍蛋白(Allo-phycocyanin，APC)。紅藻和藍藻所特有的藻膽蛋白，最早是由henbeck於1836年首次發現的。長期以來，國內外的許多科研人員已對各種海洋藻類藻膽蛋白的分子結構特點、光譜吸收特徵、光合生理以及它們在光合過程中的作用等方面進行過大量的理論性研究，而且在探索藻膽蛋白的應用性研究方面也做了許多的探索。相關的研究表明，藻膽蛋白在臨床醫學診斷、免疫化學及生物工程等研究領域具有廣泛的應用價值。它們可作為單克隆物與特異的抗體發生耦合作用，當這種結合態抗體附到細胞或組織的特異受體位點時，很容易通過它們發出的特異性螢光而進行跟蹤觀察，可作為效果良好的生物性示蹤物，而且這種結合態物對生物體本身無任何毒性副作用和損害，這是放射性物以及其他一些化學染料示蹤法所根本無法相比的，其它潛在的應用還包括DNA探針的螢光標誌，分子物和細胞的螢光免疫測試。藻膽蛋白也可和其它生物性大分子物或非生物性大分子物耦合，例如酶，其它蛋白質物，多肽， 激子，核酸，藥物，維生子等，因此在分子或細胞水平上，對研究分子的轉移、代謝，疾病的診斷和治療方面，具有重要的開發、應用價值。最近的研究表明，藻膽蛋白可作為有效的光敏劑，用於治療腫瘤、癌症等。已有許多報導指出，藻膽蛋白能有效清除體內的各種有害自由基，提高機體免疫力，具有抗輻射、 抗衰老、抗腫瘤作用，其產品市場大，是目前極有發展潛力的健康保健品。另外，藻膽蛋白也可作為添加劑，廣泛應用於各類食品和化妝品行業。根據全球生物化學產品最大的供應商 Sigma公司的標價，高純度的藻膽蛋白目前的市場售價已達75-500美元/毫克不等，而某些生物分子與藻膽蛋白結合物的現成品的售價更高。據統計，這類產品目前在國際市場上大約有超過100億美元的市場機會。因此，隨著藻膽蛋白的價值逐步為人們所認識，藻膽蛋白的開發利用已成為研發的熱點，但昂貴的價格成為制約其開發利用的瓶頸。如何高效獲取藻紅蛋白主要取決於如下幾個方面用於分離提取藻紅蛋白所需的藻源材料是否容易得到，藻源材料的藻紅蛋白含量高低，分離提取方法步驟的難易程度，藻源材料中存在的幹擾分離純化成分量的多少等方面。目前，能利用於分離提取藻紅蛋白的藻源材料雖然有許多種，例如紫菜葉狀體，紅毛藻，石花菜，麒麟菜，江籬，叉枝藻，角叉藻，多管藻等，但這些藻普遍存在藻紅蛋白含量較低、幹擾物多等問題，而且幾種藻膽蛋白的混雜存在，加大了獲取單一型藻紅蛋白的困難，造成藻紅蛋白分離純化的程序和步驟繁瑣複雜，且萃取、回收率低，成本高。有些用於分離提取藻紅蛋白的藻源材料很不容易獲取，例如珊瑚藻。紫菜葉狀體作為分離提取藻紅蛋白的材料，雖然來源方便，但紫菜經加工後本身就已經是一種好商品，若用來分離提取藻紅蛋白，就要耗費大量紫菜(因紫菜葉狀體藻紅蛋白含量低)，分離提取藻紅蛋白後，紫菜就失去利用價值，而且大量的廢渣容易造成環境問題，另外，紫菜葉狀體存在的大量胞外產物(例如粘多糖等)，也很不利於藻紅蛋白的分離提取。

發明內容
本發明所要解決的技術問題就是針對上面所述的背景技術，採用適宜的處理程序和條件，使成熟的壇紫菜葉狀體釋放果孢子，果孢子萌發後生長成絲狀藻體；通過正交實驗設計方案[採用正交表L27 (313)]，考察三因子(溫度、光照、鹽度)及各個因子三水平(低、 中、高)的調控培養條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量的數值變化，從而確定優化的調控培養條件。通過優化的調控培養條件的培養，獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體。本發明採用的方法具有簡便易行，效果好的優點，使用獲得的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體作為藻源材料， 可用於進一步分離提取藻紅蛋白，達到藻類材料高值化利用的目的，具有廣泛的應用價值。 目前，尚無採用優化調控培養條件，獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體的相關報導。本發明採用的研究材料和方法紫菜果孢子釋放與萌發的操作過程為於紫菜收成季節從現場海區採收成熟的紫菜葉狀體。用鑷子夾紗布，蘸滅菌海水小心清洗葉狀體表面，然後用滅菌海水淋洗3-5遍， 置於10-18°C環境陰乾4-10小時。用滅菌剪刀剪下葉狀體的成熟部位，放於裝有滅菌海水的500-2000毫升的燒杯中。IO-M小時後，取出葉狀體。在已有果孢子釋放的燒杯中加入滅菌過的f/2營養液，鹽度範圍在10-30ppt，置於10-20°C，光照強度lOO-lOOOlux，光照周期(L:D = 16:8)的培養箱培養，直至培養長出具有簇棕紅色的絲狀體藻絲。果孢子萌髮長成的初期絲狀體藻絲按正交實驗方案設置的條件下調控培養， PH保持適宜的數值，採用適宜的經改良後的f/2營養液，配方成分為NaN03，NaH2PO4H2O, FeCl36H20, FeSO4, Na2EDTA. 2H20, NaHCO3, NaMoO4. 2H20, ZnSO4. 7H20, CuSO4. 5H20, MnCl2. 4H20, CoCl2. 6H2O, VitaminB1, VitaminB2, VitaminB6, VitaminB12, VitaminC, VitaminD, Biotin。 絲狀藻體為全時光照的靜態培養。培養15-30天後，取出絲狀體藻絲，用濾紙吸去水分， 絲狀體藻絲放入研缽研磨成藻漿狀，加入0. 05M的磷酸鹽衝液置於暗處4°C萃取10-20小時，樣品液用離心機10000-12000rpm離心20-30分鐘，取上層藻紅蛋白萃取液，用分光光度計測定其在565、620、730nm波長的吸光值，同時測定濾紙吸去水分的絲狀體藻絲的重量以及置於80°C乾燥12小時後的藻體乾重，確定出溼藻體和幹藻體重量比值，最後按 Sampath-Wiley and Neefus方法Q007)計算絲狀體藻絲的藻紅蛋白含量，表達為毫克藻紅蛋白/克乾重藻體(mg/g. dw)。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為採用了三因子、三水平並具有可做交互作用分析的正交實驗設計(正交表 L27 (313))，設置調控培養實驗，同時運用方差分析方法，重點考察關鍵性因子溫度、光照強度和鹽度對絲狀藻體藻紅蛋白含量的影響，分析這些關鍵性因子的主次順序、交互作用的影響及確定優化的調控培養條件。以下是實驗設計、實驗結果及分析。 表一、絲狀藻體藻紅蛋白含量實驗因子水平表
權利要求
1.一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵在於通過採收成熟的紫菜葉狀體，得到釋放的果孢子，果孢子萌發後生長成絲狀體。採用正交實驗設計方案，考察多因子水平的調控培養條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量的數值變化，從而確定可達到獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體的優化調控培養條件。
2.按照權利要求1所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的紫菜種類為壇紫菜，但也可適用於其它形式的紫菜種類。
3.按照權利要求1所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的紫菜果孢子釋放與萌發的操作過程為於紫菜收成季節從現場海區採收成熟的紫菜葉狀體。用鑷子夾紗布，蘸滅菌海水小心清洗葉狀體表面，然後用滅菌海水淋洗3-5遍，置於10-18°C環境陰乾4-10小時。用滅菌剪刀剪下葉狀體的成熟部位，放於裝有滅菌海水的500-2000毫升的燒杯中。IO-M小時後，取出葉狀體。在已有果孢子釋放的燒杯中加入滅菌過的f/2營養液，鹽度範圍在10-30ppt，置於10-20°C，光照強度 lOO-lOOOlux，光照周期(L:D= 16:8)的培養箱培養，直至培養長出具有簇棕紅色的絲狀體藻絲。
4.按照權利要求1所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的可達到獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體的優化調控培養條件的確定，是通過通過相應的正交實驗設計方案獲得的。
5.按照權利要求1或4所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的高含量藻紅蛋白的絲狀藻體的優化調控培養條件的溫度範圍值為 8-30 "C。
6.按照權利要求1或4所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優化調控培養條件的光照強度範圍值為 lOO-lOOOlux。
7.按照權利要求1或4所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優化調控培養條件的鹽度範圍值為 10-30ppt。
8.按照權利要求1或4所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優化調控培養條件的PH範圍值為 7. 0-8. 5。
9.按照權利要求1或4所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優化調控培養條件是採用靜態培養。
10.按照權利要求1或4所述的一種優化調控培養條件獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體，其特徵是所述的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體的優化調控培養條件是採用適宜的經改良後的f/2營養液，配方成分為NaNO3, NaH2PO4H2O, FeCl3. 6H20, FeSO4, Na2EDTA. 2H20, NaHCO3, NaMoO4. 2H20, ZnSO4. 7H20, CuSO4. 5H20, MnCl2. 4H20, CoCl2. 6H20, VitaminB1, VitaminB2, VitaminB6, VitaminB12, VitaminC, VitaminD, Bioitn。
全文摘要
本發明涉及一種採用優化調控培養條件，獲得高含量藻紅蛋白的壇紫菜絲狀藻體。屬於海藻資源高值化開發利用技術領域.具體操作過程為採用適宜的處理程序和條件，使成熟的壇紫菜葉狀體釋放果孢子，果孢子萌發後生長成絲狀藻體；通過正交實驗設計方案[採用正交表L27(313)]，考察三因子(溫度、光照、鹽度)及各個因子三水平(低、中、高)的調控培養條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量的數值變化，從而確定優化的調控培養條件。在優化的調控培養條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量值高，最高可達64.73毫克/克乾重藻體(平均值±標準偏差SD為58.24±5.07)。本發明採用的方法具有簡便易行，效果好的優點，使用獲得的高藻紅蛋白含量的絲狀藻體作為藻源材料，可用於進一步分離提取藻紅蛋白，達到藻類材料高值化利用的目的，具有廣泛的應用價值。
文檔編號A01G33/02GK102334443SQ201010229370
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者林汝榕, 柯秀蓉, 邢炳鵬 申請人:國家海洋局第三海洋研究所